《药品生物检定技术》课件-第十章 生物制品的生物测定法

第十章生物制品的生物测定法第一节概念

第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法第三节外源性DNA残留量的检查法第四节鼠IgG残留量的检查法目录第十章生物制品的生物测定法第五节残余抗生素的检查法学习目标第十章生物制品的生物测定法掌握酶联免疫吸附试验检测方法熟悉生物制品的概念；宿主细胞（或菌体）蛋白

残留量、外源性DNA残留量等检查法的概念了解生物制品所含杂质的分类概述第一节第十章生物制品的生物测定法第一节概述一.

生物制品的概念

生物制品（biologicalproducts）是指以微生物、细胞、动物或人员组织和体液等为起始原材料，用生物学技术制成，用于预防、治疗和诊断人类疾病的制剂，如疫苗、血液制品、生物技术药物、微生态制剂、免疫调节剂、诊断制品等。二.

生物制品杂质的分类

第一节概述

（1）生物污染物包括微生物污染，细胞成分（如宿主细胞蛋白等）、培养基成分（如牛血清蛋白等）。

（2）产品相关杂质包括二聚体及多聚体、脱氨或氧化产物、突变物、错误裂解产物、二硫化物异构体等。

（3）工艺添加剂包括残余的抗生素，蛋白分离剂（如乙醇等）、产品稳定剂（如肝素等）、防腐剂（如苯酚等）、佐剂（如氢氧化铝等）、细菌及病毒灭活剂（如甲醛等）。宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法第二节第十章生物制品的生物测定法一.

概念

第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法

宿主细胞（或菌体）的残留蛋白是指与生物制品生产用的细胞、工程菌相关的特殊蛋白杂质。对该类生物制品的检定应按照《中国药典》现行版三部的规定来严格测定和控制异源蛋白的含量，以防其超量而导致机体出现的各种不良免疫反应，确保该类产品的质量和安全性。二.

原理及方法1.方法

根据《中国药典》（2015年版）的规定，目前对宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的测定主要采用的是酶联免疫吸附试验检测方法（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法二.

原理及方法第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法2.原理

根据抗原-抗体反应的特点，先将抗体（抗原）包被在固相载体表面后，按不同的步骤加入待测抗原（抗体）和酶标记的抗体（抗原），待其充分反应后，用洗涤的方法将固相载体上形成的特异性抗原-抗体复合物与其他物质分离，洗去未结合的游离酶标抗体（抗原），最后加入酶的底物，根据酶对底物催化的显色反应的程度，对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量检测。3.ELISA（双抗体夹心法）方法举例大肠埃希菌表达系统生产的重组生物制品中残留菌体蛋白含量测定方法的基本步骤为:

（1）包被抗体：将特异性抗体与固相载体连接，形成固相载体，洗涤除去未吸附的抗体和杂质。

（2）加待测标本并孵育：使标本中的待测抗原与上述固相抗体充分反应，形成固相抗原-抗体复合物，洗涤除去其他未结合的游离抗原和杂质.第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法二.

原理及方法

（3）加酶标抗体孵育：使固相抗原抗体复合物中的抗原再与相应的酶标抗体相结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体复合物（即双抗体夹心法），洗涤除去未结合的酶标抗体和其他杂质。（4）加底物显色：固相上的辣根过氧化物酶催化加入的底物（邻苯二胺）形成橙色产物，根据颜色反应的程度来进行该抗原的定性或定量检测。最后加入终止液（硫酸）终止反应。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，以不同浓度的标准品溶液的吸光度做出工作曲线，由此可以测出重组生物制品中所残留的大肠埃希菌菌体蛋白的含量。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法SM-3酶标仪第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法三.实例

本法采用酶联免疫法测定大肠埃希菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残留量。（《中国药典》（2015年版）三部通则3412）1.方法原理重组人粒细胞刺激因子注射液原液的宿主菌蛋白质残留量测定

（1）溶液的配制第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法2.实验步骤2.实验步骤132465包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤液（pH7.4）浓稀释液底物缓冲液78底物液终止液稀释液（PH7.4）

（2）标准品溶液的制备按菌体蛋白质标准品说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每1ml中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法

（3）供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每1ml中约含250μg的溶液。如供试品每1ml中含量小于500μg时，用浓稀释液稀释1倍。

（4）测定法a.取兔抗大肠埃希菌菌体蛋白质抗体适量，用包被液溶解并稀释成每1ml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜（16～18小时）。b.用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备l%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内，37℃放置2小时。c.将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μl/孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入2孔空白对照(稀释液)，37℃放置2小时。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法

d.用稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗大肠埃希菌菌体蛋白质抗体1000倍，以100μl/孔加至酶标板内，37℃放置1小时，用洗涤液洗板10次，以100μl/孔加入至酶标板内，37℃避光放置40分钟，以50μl/孔加入终止液终止反应。e.用酶标仪在波长492nm处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量。按式（10-1）计算:供试品菌体蛋白质残留量（%）=式（10-1）式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml；n为供试品稀释倍数；T为供试品蛋白质含量，mg/ml。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法3.计算重组人粒细胞刺激因子注射液原液的宿主菌蛋白质残留量应不高于蛋白质总量的0.10%。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法4.结果外源性DNA残留量的检查法第三节第十章生物制品的生物测定法第三节外源性DNA残留量的检查法一.外源性DNA的测定方法

目前对生物制品中残留外源性DNA的测定方法主要包括：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白分析系统及实时定量PCR（Q-PCR）3类检测技术，其中以分子杂交技术最为常用。第三节外源性DNA残留量的检查法1.分子杂交技术的基本原理

采用DNA探针来检测固定在硝酸纤维素膜上的变性的宿主细胞DNA。供试品中的外源性DNA经变性成为单链，再吸附在固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成双链DNA，称为杂交。阳性对照和标记探针的DNA可由生产供试品所用的传代细胞、工程菌及杂交瘤细胞提取纯化来制备。第三节外源性DNA残留量的检查法2.实验步骤01用标记物来标记特异性的单链DNA探针与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交02030405使用与标记物相对应的显示系统来显示杂交结果与已知含量的阳性DNA对照对比测出供试品中外源性DNA的含量，其灵敏度可达10pg以下第三节外源性DNA残留量的检查法3.注意事项(1)DNA残留量在1.25～80ng/ml范围内，本法线性较好。(2)供试品首次应用本法测定时需要进行方法学验证，验证内容至少包括精密度试验和回收率试验。鼠IgG残留量的检查法第四节第十章生物制品的生物测定法第四节鼠IgG残留量的检查法一.试验原理

同宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法，即利用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法来测定经单克隆抗体亲和层析方法纯化的重组制品中残留的鼠IgG的含量。第四节鼠IgG残留量的检查法1.实验步骤

(1)包被抗体：将特异性的抗体（山羊抗鼠IgG抗体）包被在固相载体上，洗涤除去未吸附的抗体和杂质。

(2)加待测标本并孵育：使标本中的待测抗原（供试品溶液）和标准品溶液与上述固相抗体结合形成抗原-抗体复合物，洗涤除去其他未结合的游离抗原和杂质。

(3)加酶标抗体孵育：使固相抗原-抗体复合物中的抗原再与对应的经辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠IgG抗体相结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体复合物（即双抗体夹心法），洗涤除去未结合的酶标抗体和其他杂质。第四节鼠IgG残留量的检查法

(4)加底物显色：固相上的辣根过氧化物酶催化加入的底物（邻苯二胺）形成有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量检测。最后加入终止液硫酸来终止反应。用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，以不同浓度的标准品溶液的吸光度做出工作曲线，由此可以测出由单克隆抗体亲和层析法纯化的重组制品中的残留鼠IgG的含量。残余抗生素的检查法第五节第十章生物制品的生物测定法目前一些生物制品（如由大肠埃希菌表达系统生产的注射用重组人干扰素-α1b、注射用重组人干扰素-α2a等），由于在生产过程中使用了抗生素（如氨苄西林或四环素），根据《中国药典》现行版四部的要求，对此类生物制品进行质量检定时，除了要在纯化工艺中除去抗生素以外，还应在原液检定中增加残余抗生素活性的检测项目。第五节残余抗生素的检查法一、概念对生物制品残余抗生素活性的检测，目前采用的是琼脂扩散法（管碟法）。残余抗生素检测的基本原理是在琼脂培养基内检测抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品和供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，以检测供试品中氨苄西林或四环素的残留量。二、原理和方法第五节残余抗生素的检查法琼脂扩散法测定残余抗生素量三.实例1.操作步骤

(1)磷酸盐缓冲液(pH6.0)的制备称取磷酸二氢钾8.0g、磷酸氢二钾2.0g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃灭菌30分钟。(2)抗生素Ⅱ号培养基的制备称取胨6g、牛肉提取粉1.5g、酵母浸出粉6g，加入适量水溶解后，加人琼脂13～14g，加热使之溶胀，滤过除去不溶物，加入葡萄糖lg，溶解后加水至1000ml，调pH值使灭菌后为6.5～6.6；分装于玻璃管或锥形瓶中，经115℃灭菌30分钟，4℃保存。第五节残余抗生素的检查法

(3)对照品溶液的制备a.取氨苄西林对照品适量，用0.01mol/L盐酸溶解并稀释成每1ml中含氨苄西林10mg的溶液，精密量取适量，用磷酸盐缓冲液稀释成每1ml中含1.0μg的溶液。b.取四环素对照品适量，用生理氯化钠溶液溶解并稀释成每1ml中含0.125μg的溶液。第五节残余抗生素的检查法

(4)菌悬液的制备a.金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）悬液：用于检测氨苄西林。取金黄色葡萄球菌(CMCC26003)营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。b.藤黄微球菌（Micrococcusluteus）悬液：用于检测四环素。取藤黄微球菌[CMCC(B)28001]营养琼脂斜面培养物.接种于营养琼脂斜面E，置26～27℃培养24小时。临用时，用0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。第五节残余抗生素的检查法

(5)检查法

取培养皿，注入熔化的抗生素Ⅱ号培养基15～20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。取抗生素Ⅱ号培养基10～15ml置于1支50℃水浴预热的试管中，加入0.5%～1.5%（ml/ml）的菌悬液