百日咳实验室检测技术指南

百日咳实验室检测技术指南百日咳是由百日咳鲍特菌（Bordetellapertussis）引起的急性呼吸道传染病，实验室检测是确诊和流行病学调查的关键环节。目前常用的检测技术包括细菌分离培养、直接荧光抗体检测（DFA）、分子生物学检测（以PCR为主）及血清学检测四大类，各类技术在适用场景、操作规范及结果判读上存在差异，需根据样本类型、病程阶段及临床需求选择合适方法。一、细菌分离培养技术细菌培养是百日咳诊断的“金标准”，适用于病程早期（卡他期至痉咳期前2周）未使用抗生素的患者样本检测。（一）样本采集与处理1.采样方法：首选鼻咽拭子采样，使用无菌涤纶或藻酸钙拭子（避免棉拭子，因棉纤维可能抑制细菌生长），经鼻孔缓慢插入至鼻咽后壁（深度约为患者鼻翼至外耳道口距离的2/3），旋转拭子并停留10-15秒后取出。也可采用咳碟法（将鲍-金培养基平皿置于患者口前5-10cm处，令其连续咳嗽5-10声后立即盖好平皿），但阳性率低于鼻咽拭子。2.样本保存与运输：拭子采集后需立即接种培养基，若无法及时处理，应将拭子插入含半固体运输培养基（如Amies培养基）的试管中，4℃保存并24小时内送检；超过24小时需-70℃冻存（避免反复冻融）。（二）培养基选择与培养条件1.培养基：推荐使用鲍-金培养基（Bordet-Gengouagar，含15%-20%脱纤维羊血及甘油）或雷氏培养基（Regan-Loweagar，含活性炭、马血及头孢他啶等抗生素抑制杂菌）。雷氏培养基因添加抗生素，更适用于已使用抗生素患者的样本培养。2.接种与培养：将拭子在培养基表面做“Z”字形涂抹，分区划线分离单菌落。置于35-37℃、5%-10%CO₂环境中需氧培养（可用烛缸法维持CO₂浓度），培养时间5-7天（部分菌株需延长至10天）。（三）菌落鉴定1.形态观察：培养48小时后可见针尖大小、光滑湿润、珍珠样半透明菌落，周围有狭窄溶血环（鲍-金培养基更明显）；72小时后菌落直径约1-2mm，呈银灰色“水银滴”样。2.染色与生化反应：挑取可疑菌落进行革兰染色，可见革兰阴性短小杆菌（0.2-0.5μm×0.5-2.0μm），常单个或成对排列。生化鉴定需检测氧化酶（阳性）、触酶（阳性）、尿素酶（阴性）、硝酸盐还原（阴性）及动力（无）等指标。3.血清学确认：使用百日咳鲍特菌特异性抗血清（如因子血清1、2、3）进行玻片凝集试验，阳性反应表现为快速（1分钟内）凝集。（四）注意事项-采样应在患者使用抗生素前完成，抗生素治疗48小时后培养阳性率显著下降。-培养基需新鲜配制（鲍-金培养基4℃保存不超过7天，雷氏培养基不超过14天），避免营养成分流失或杂菌污染。-培养环境需严格控制温度和湿度（相对湿度60%-80%），避免培养基干裂影响细菌生长。二、直接荧光抗体检测（DFA）DFA通过荧光标记的特异性抗体与样本中的百日咳鲍特菌抗原结合，经荧光显微镜观察结果，适用于快速初步筛查。（一）操作流程1.样本处理：将鼻咽拭子在生理盐水中充分洗脱，取10μl洗脱液均匀涂片于载玻片（直径约1cm），自然干燥后用无水乙醇固定10分钟。2.荧光染色：滴加1:10-1:20稀释的荧光标记抗百日咳鲍特菌单克隆抗体工作液（覆盖涂片区域），置湿盒中37℃孵育30分钟。3.洗涤与封片：用0.01mol/LPBS（pH7.4）轻轻冲洗玻片3次（每次5分钟），吸水纸吸去多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂，加盖玻片。4.镜检判读：在荧光显微镜（激发光490nm，发射光520nm）下观察，阳性结果可见散在或成簇的亮绿色荧光杆菌（形态为球杆状，两端钝圆），每视野≥10个典型菌可判为阳性。（二）性能特点-优点：操作快速（2-3小时出结果），适用于急性期样本的快速筛查。-缺点：特异性受样本中杂菌（如嗜血杆菌、假单胞菌）交叉反应影响，需结合培养或PCR结果确认；灵敏度低于培养（约60%-80%），尤其在病程后期或抗生素使用后易漏检。（三）质量控制-每次检测需设置阳性对照（已知百日咳鲍特菌培养物涂片）和阴性对照（健康人鼻咽拭子涂片），确保试剂有效性。-涂片厚度需均匀，过厚可能导致背景荧光增强，影响判读。三、分子生物学检测（PCR技术）PCR因高灵敏度和特异性，已成为百日咳实验室诊断的核心技术，适用于各病程阶段（包括抗生素使用后、培养阴性或病程超过2周的患者）。（一）靶基因选择推荐选择双重靶标以提高特异性：1.IS481插入序列：为百日咳鲍特菌的特异性重复序列（拷贝数约20-30个/基因组），敏感性高，是主要检测靶标。2.ptxS1基因：编码百日咳毒素亚单位S1，为功能性毒力基因，可区分百日咳鲍特菌与副百日咳鲍特菌（后者无此基因）。（二）样本类型与核酸提取1.样本类型：鼻咽拭子（首选）、诱导痰、支气管肺泡灌洗液（BALF）均可用，需避免血液或黏液过多（可能抑制PCR反应）。2.核酸提取：采用磁珠法或硅胶柱法提取DNA，操作需严格遵循试剂盒说明书。提取前需将拭子在1mlPBS中充分振荡洗脱（1000rpm×5分钟），取200μl洗脱液进行提取。提取的DNA浓度应≥10ng/μl，OD260/280比值在1.8-2.0之间。（三）PCR反应体系与条件（以实时荧光定量PCR为例）1.反应体系（25μl）：2×PCR缓冲液12.5μl，上游引物（10μmol/L）0.5μl，下游引物（10μmol/L）0.5μl，探针（10μmol/L）0.3μl，Taq酶（5U/μl）0.2μl，DNA模板5μl，无菌去离子水补足至25μl。2.扩增条件：预变性95℃5分钟；变性95℃15秒，退火/延伸60℃45秒（40个循环）。（四）结果判读-阳性：IS481和ptxS1均扩增出典型荧光曲线（Ct≤38），或IS481阳性且ptxS1Ct≤40（需结合临床）。-阴性：无荧光曲线或Ct>40。-不确定：仅IS481阳性且Ct>38，需重复检测或结合其他方法（如培养、血清学）确认。（五）质量控制1.污染防控：PCR实验室需严格分区（试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区），各区物品专用；每次实验前用10%次氯酸钠或紫外灯（254nm，30分钟）消毒台面；扩增反应中添加UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶），防止扩增产物污染。2.对照设置：每批次检测需包含：-阳性对照（含IS481和ptxS1片段的质粒DNA，Ct值18-22）；-阴性对照（无菌去离子水）；-内参对照（人β-actin基因，确保样本核酸提取有效，避免假阴性）。四、血清学检测血清学检测通过检测特异性IgM、IgG抗体辅助诊断，适用于病程超过2周、培养及PCR阴性的患者，或流行病学回顾性调查。（一）检测方法与原理常用ELISA法，包被抗原为百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）（需排除疫苗株变异影响）。操作步骤包括：1.包被：将PT（5μg/ml）和FHA（10μg/ml）抗原包被酶标板，4℃过夜。2.封闭：用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭，37℃孵育1小时。3.加样：稀释患者血清（1:100）加入孔中，37℃孵育1小时。4.加酶标二抗：加入HRP标记的抗人IgM或IgG抗体（1:5000），37℃孵育1小时。5.显色：加入TMB底物液，避光反应15分钟，用2mol/LH₂SO₄终止反应。6.读数：酶标仪读取450nm吸光度值（OD），计算样本/阴性对照（S/CO）比值。（二）结果判读-IgM阳性：S/CO≥2.1，提示近期感染（病程2-4周达高峰）。-IgG阳性：急性期与恢复期（间隔2-4周）双份血清IgG滴度≥4倍升高，或单份血清IgG≥500IU/ml（需结合临床）。（三）注意事项-疫苗接种（如百白破疫苗）可导致IgG升高，需排除接种后3个月内的样本。-免疫功能低下患者抗体反应可能延迟，需延长检测间隔。五、不同检测技术的联合应用临床实践中需根据病程阶段选择检测策略：-病程≤2周（卡他期至痉咳早期）：优先选择培养（金标准）和PCR（高灵敏度），同时采集急性期血清。-病程>2周（痉咳后期至恢复期）：PCR仍可检