基于DEET和挥发油双效驱蚊凝胶剂的研制

【摘要】目的：研制一种结合避蚊胺（DEET）与植物挥发油的双效驱蚊凝胶剂，以协同增效机制提升驱蚊效率并降低DEET用量，同时确保产品的安全性与长效性。方法：通过分光光度法建立OD值与菌落数的标准曲线，其中大肠杆菌的回归方程为（y=15.6x-0.6173，r=0.9888），金黄色葡萄球菌的回归方程为（y=6.3075x＋0.828，r=0.963）；通过微量肉汤稀释法测定香叶天竺葵（PelargoniumgraveolensL'Hér.&Aiton）挥发油与薄荷（MenthacanadensisL.）挥发油（复配1：1）体系的抑菌效力（MIC/MBC）；采用单因素试验优化凝胶基质配比（卡波姆浓度、吐温80浓度及保湿剂比例）；通过人体药效实验测定驱蚊时效，并利用鸡胚尿囊膜实验评估皮肤刺激性。结果：挥发油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的MIC均为0.313%，MBC为1.25%；凝胶最佳配方为卡波姆940（0.6%）、吐温80（1%）、保湿剂（PEG400：丙二醇：丁二醇=2:1:1，40%），其平均有效保护时间达3.32小时；鸡胚尿囊膜实验显示终点评分（ES=0），表明无皮肤刺激性。结论：成功开发出兼具高效驱蚊与安全性的双效凝胶剂，验证了DEET与植物挥发油的协同应用潜力，为环境友好型驱蚊产品的设计提供了理论依据与实践参考。【关键词】DEET；挥发油；驱蚊凝胶；抑菌效力；皮肤刺激性DevelopmentofaDual-EffectMosquitoRepellentGelBasedonDEETandVolatileOils[Abstract]Objective:Todevelopadual-effectmosquitorepellentgelcombiningDEETandplant-derivedvolatileoils,leveragingasynergisticmechanismtoenhancerepellentefficacywhilereducingDEETconcentration,ensuringproductsafetyandlong-lastingperformance.Methods:

AstandardcurverelatingODvaluestocolony-formingunitswasestablishedusingspectrophotometry,withregressionequationsforEscherichiacoli(y=15.6x-0.6173,r=0.9888)andStaphylococcusaureus(y=6.3075x+0.828,r=0.963).Theantimicrobialefficacy(MIC/MBC)ofblendedvolatileoilsfrom

Pelargoniumgraveolens

L'Hér.&Aitonand

Menthacanadensis

L.wasdeterminedusingthemicrobrothdilutionmethod.Single-factorexperimentsoptimizedthegelmatrixformulation(Carbomer940concentration,Tween80concentration,andhumectantratio).Humanefficacytrialsassessedrepellentduration,whileskinirritationwasevaluatedviathehen'seggchorioallantoicmembrane(HET-CAM)test.Results:TheMICandMBCofthevolatileoilsagainst

E.coli

and

S.aureus

were0.313%and1.25%,respectively.TheoptimalgelformulationcomprisedCarbomer940(0.6%),Tween80(1%),andhumectants(PEG400:propylene

glycol:butylene

glycol=2:1:1,40%),achievinganaverageeffectiveprotectiontimeof3.32hours.TheHET-CAMtestyieldedafinalirritationscore(ES=0),indicatingnoskinirritation.Conclusion:Adual-effectgelwithhighrepellencyandsafetywassuccessfullydeveloped,demonstratingthesynergisticpotentialofDEETandplant-derivedvolatileoils.Thisstudyprovidestheoreticalandpracticalinsightsfordesigningeco-friendlymosquitorepellentproducts.[Keywords]DEET;volatileoils;mosquitorepellentgel;antibacterialefficacy;skinirritation随着全球气候变暖和城市化进程的加速，蚊媒疾病的传播风险显著增加，开发高效、安全的驱蚊产品已成为公共卫生领域的重要课题。传统的驱蚊剂以化学合成成分为主，其中避蚊胺（DEET）因其广谱高效的驱蚊效果而被广泛应用。然而，DEET的长期使用可能引发皮肤刺激、环境残留以及对非靶标生物的潜在毒性问题，这限制了其在可持续公共卫生策略中的应用。与此同时，植物源挥发油因其天然、低毒的特性逐渐受到关注，但其驱蚊时效短、稳定性差等缺陷限制了其实际应用。因此，如何通过剂型优化与组分协同作用实现驱蚊效率与安全性的平衡，成为本领域研究的核心目标。近年来，凝胶剂因其良好的皮肤附着性、缓释性能及使用舒适度，成为新型驱蚊制剂的优选载体。凝胶剂能够有效控制活性成分的释放速率，延长驱蚊时效，同时减少化学驱蚊剂的使用量，从而降低其潜在毒性风险。然而，单一驱蚊成分的凝胶剂难以满足长效与温和的双重要求。基于此，本研究提出将DEET与植物挥发油复配，构建双效驱蚊体系：一方面利用DEET的高效驱避特性，另一方面通过挥发油的天然抗菌活性降低DEET用量，同时发挥协同增效作用。本研究选取香叶天竺葵（Pelargoniumgraveolens

L'Hér.&Aiton）和薄荷（Menthacanadensis

L.）两种植物挥发油作为研究对象。香叶天竺葵油富含香茅醇，具有显著的抗菌和驱蚊活性；薄荷油则以薄荷醇为主要成分，具有清凉感和一定的驱避效果。两者在化学成分和作用机制上具有互补性，通过复配可能产生协同增效作用。研究通过微量肉汤稀释法评估挥发油的抑菌效力，采用单因素试验筛选凝胶基质的最佳配比，并结合人体药效实验与鸡胚尿囊膜实验综合评价产品的驱蚊时效及皮肤安全性。本研究不仅为开发环境友好型驱蚊产品提供理论依据，也为天然活性成分与合成成分的协同应用开辟新思路，具有重要的科学价值与社会意义。通过优化配方与剂型设计，本研究有望为公共卫生领域提供一种高效、安全、长效的驱蚊解决方案，同时推动天然资源在现代驱蚊产品中的应用。2.1主要仪器实验所用主要仪器如下（见表2-1）。表2-1仪器名称型号生产厂家电动搅拌器电热恒温培养箱上海一恒科学仪器双人单面净化工作台苏州净化设备超低温冰箱海尔集团冷冻冷藏箱美的集团紫外-可见分光光度计津岛德国股份万分之一天平上海精科天美仪器摇摆式高速万能粉碎机双光束紫外可见分光光度计上海佑科仪器仪表压力蒸汽灭菌锅电热套郑州长城科工有限公司体式显微镜重庆奥特光学仪器全自动高端孵化机多功能粉碎机漩涡混合仪常州恩培仪器制造pH计上海三信仪表厂超声波清洗器昆山市超声仪器

2.2主要材料和试剂实验所用主要材料和试剂如下（见表2-2）。表2-2主要原料与试剂原料名称规格生产厂家薄荷香叶天竺葵避蚊胺上海麦克林生化科技股份有限公司丙二醇聚乙二醇4001,3丁二醇乙二胺四乙酸二钠天津市百世化工有限公司三乙醇胺山东优索化工科技有限公司聚乙烯吡咯烷酮K30天津市众联试剂有限公司吐温80成都市科龙化工试剂厂卡波姆940广东广试试剂科技有限公司DEET上海麦克林生化科技股份有限公司对羟基苯甲酸乙酯西亚试剂去离子水实验室自制琼脂粉LB肉汤广东环凯微生物科技有限公司CAMHB肉汤海博生物技术有限公司氯化钠二甲基亚砜链霉素北京索莱宝科技有限公司注：薄荷来源于中山市仙逸堂有限公司，经广东药科大学田素英副教授鉴定为唇形科薄荷属薄荷（Menthacanadensis

L.）。香叶天竺葵来源于中山市仙逸堂有限公司，经广东药科大学田素英副教授鉴定为牻牛儿苗科天竺葵属植物香叶天竺葵（Pelargoniumgraveolens

L'Hér.&Aiton）。

3.1建立OD值与菌落数的标准曲线OD值反映总菌体（包括死菌和代谢产物），而平板计数仅统计活菌。抑菌实验需明确活菌数量变化以评估抗菌效果。此外，不同菌种的最适检测波长及OD值与菌数的换算系数存在差异。通过标准曲线可将OD值转换为活菌数（CFU），避免高估或低估抑菌率。将－80℃保存的大肠杆菌（Escherichiacoli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）菌种接种于LB平板，37℃培养18小时。将复苏后的菌种用无菌接种环挑取单个菌落接种于LB平板挑取纯化后的单个菌落，接种于LB平板，37℃培养18小时。纯化后的几个单克隆菌种用无菌生理盐水将菌悬液稀释至适当浓度。将菌悬液用无菌生理盐水进行适当稀释，选取OD600nm值在0.1-0.8之间的菌悬液稀释液作为原菌液样品6个。每个稀释度需重复测定3次，取平均值。根据测定的OD值，将菌液进行10倍梯度稀释，取100μL菌液加入到900μL无菌生理盐水中，混匀，得到10^1稀释度；再取100μL10^1稀释液加入到900μL无菌生理盐水中，混匀，得到10^2稀释度，以此类推。样品稀释度分别为10^6、10^6、10^7、10^7、10^7、10^7。从每个稀释度中分别取50μL菌液，加入到无菌培养皿中，涂布均匀。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养18小时。将每个梯度的菌液分别涂布于平板上。将涂布后的LB平板置于37℃恒温培养箱中培养20小时，观察菌落数，选择菌落数在30-300之间的平板进行计数。统计每个培养平板上的菌落数，根据稀释倍数和涂布体积，计算出每mL原始菌液中的菌落数（CFU/mL）。记录每个OD值对应的CFU/mL值，以OD600为横坐标，菌落总数（CFU/mL）为纵坐标，绘制OD值对菌落总数曲线回归方程（R2>0.95）。3.2微量肉汤稀释法抑菌效力测定该实验使用2倍连续稀释法，使香叶天竺葵油与薄荷油（1:1复配）体系形成浓度梯度。孵育后通过肉眼观察孔内浊度变化，无可见生长的最低药物浓度即为MIC，反映药物抑菌效力；MBC为取MIC对应清孔菌液涂布琼脂平板，37℃培养24h后无可见菌落的最低浓度，反映药物杀菌效力。将香叶天竺葵油与薄荷油按1:1混合，用1%DMSO与0.5%吐温80溶解，以CAMHB培养基进行2倍稀释，其浓度为10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%（v/v）。于96孔板中每孔加入100μL菌悬液与100μL挥发油稀释液，37℃培养24h。药物终浓度为5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%，0.039%（v/v）。以不含挥发油的培养基为阴性对照，以50μg/mL的链霉素为阳性对照，含1%DMSO与0.5%吐温80的培养基为溶剂对照（图3-1）。测定MIC与MBC，MIC为肉眼观察无浑浊的最低浓度；MBC为取MIC对应清孔菌液涂布琼脂平板，37℃培养24h后无可见菌落的最低浓度。图3-1微量肉汤稀释法抑菌实验

4.1凝胶样品的配制与评估标准凝胶型驱蚊剂配制：向烧杯中加入卡波姆940，溶胀过夜，然后加入EDTA-2Na、去离子水和TEA，机械搅拌至均匀（约200r/min），搅拌时间10min，制成凝胶半成品。再将防腐剂、PVPK30、PEG40、丙二醇和丁二醇混合均匀后，加入驱避剂和挥发油混合均匀，搅拌速度为200r/min，搅拌5min。最后将含有驱避剂、香叶天竺葵油与薄荷油（1:1复配）体系和吐温80的混合溶液缓慢加入凝胶半成品中，继续搅拌20min，形成样品。肤感评估：志愿者清洁双手。依次评估样品，每项指标独立评分，间隔清水冲洗或休息，避免感官疲劳。耐热与耐寒测试：将凝胶样品装入试管（Φ20mm×120mm），高度约80mm，密封。耐热：将样品置于（40±1）℃恒温箱24h，恢复室温后对比外观变化；耐寒：将样品置于-5℃~-10℃冰箱24h，恢复室温后对比外观变化。长期留样试验：模拟实际储存环境，温度25℃±2℃，湿度60%±5%RH，时间点设置为0，3，6月。分别配制卡波姆940浓度为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%（w/w）的凝胶基质，固定吐温80为1.0%（w/w）、保湿剂（PEG400：丙二醇：丁二醇=2:1:1）为40%（w/w），加入DEET（2%）和香叶天竺葵油与薄荷油（1:1复配）体系，总浓度0.313%。采用磁力搅拌器（500rpm，25℃）均质化30min，调节pH至6.5-7.0（三乙醇胺调节），用去离子水加至100g。固定卡波姆0.8%、保湿剂（PEG400：丙二醇：丁二醇=2:1:1）40%，设置吐温80浓度为0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%（w/w）。

固定卡波姆0.8%、吐温801%，设置保湿剂（PEG400：丙二醇：丁二醇=2:1:1）浓度为25%、30%、35%、40%、45%（w/w）。

本实验评估驱蚊剂防护时效，通蚊虫叮咬行为判定药物失效节点。每次正式测试前需进行空白对照测试，当未施药部位在2min内吸引≥2只蚊虫停留时，判定蚊群攻击力达标。自施药起每小时进行叮咬测试，持续至失效为止，施药区域出现首例成功叮咬即判定防护失效。记录每位受试者各次测试的有效防护时间（精确至分钟），最终取算术平均值作为产品防护时效。5.1受试者的选择选取4名及以上健康志愿者，纳入标准：（1）年龄18～35岁；（2）无化妆品或药物过敏史；（3）无任何皮肤或系统性疾病患史；（4）无体质高度敏感者；（5）最近三个月受试部位未参加其他临床试验者；（6）自愿参加，并签阅知情同意书，能严格遵守研究方案的要求。5.2驱蚊时间测定采用人体手臂暴露法。将0.1mL样品均匀涂布于15cm²方形皮肤区域，自然环境下保持静止暴露状态，记录首次被叮咬时间，每人试验重复10次（间隔≥72小时）。

6.1鸡胚处理选用受精鸡胚（孵化第9天），开窗暴露尿囊膜（CAM），随机分为三组：阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（0.1mol/LNaOH）、实验组（0.3g凝胶）。6.2刺激性观察使用薄膜上样品（凝胶3g），孵育五分钟，用生理盐水冲洗样品。本研究采用03分评分法。表6-1刺激性评分表出血凝血血管融解无000轻度111中度222重度3336.3数据分析样本独立评分三次，计算刺激指数(ES)=3只鸡胚得分总和的平均值，判定标准：ES≤15为无/轻刺激性；15<ES≤50为轻度刺激；ES>50具显著刺激性

7.1OD值与菌落数的标准曲线表7-1大肠杆菌的OD值与菌落数对照OD值0.1020.1760.2820.4500.5270.767平板计数结果／（×１０8ＣＦＵ·ｍＬ－１）0.871.361.952.743.345.01表7-2金黄色葡萄球菌的OD值与菌落数对照OD值0.0920.1850.3130.4200.5760.729平板计数结果／（×１０8ＣＦＵ·ｍＬ－１）1.122.213.163.44.085.6

图7-3中，大肠杆菌的OD值与菌落数标准曲线为y=15.6x-0.6173（r=0.9888）。图7-4中，金黄色葡萄球菌的OD值与菌落数标准曲线为y=6.3075x＋0.828（r=0.963）。图7-3大肠杆菌的OD值与菌落数标准曲线图7-4金黄色葡萄球菌的OD值与菌落数标准曲线

7.2微量肉汤稀释法抑菌实验大肠杆菌的MIC为0.313%（如图7-5），MBC为1.25%（如表7-7）。金黄色葡萄球菌的MIC为0.313%（如图7-6），MBC为1.25%（如表7-8）。图7-5大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）图7-6金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）

表7-7大肠杆菌的最小杀菌浓度（MBC）梯度试样5%2.5%1.25%0.625%0.313%有无菌落无无无有有表7-8金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）梯度试样5%2.5%1.25%0.625%0.313%有无菌落无无无有有7.3驱蚊凝胶基质的筛选与优化为了对基质进行优化和评估，以下是筛查标准：指标优（3~2分）良（2~1分）差（1~0分）外观均匀度外观均匀，有光泽外观较为均匀，光泽较暗淡外观不均匀，无光泽粘腻度清爽，成膜感轻，无明显粘感成膜感微重，黏腻感轻微成膜感重，粘腻感重粘稠度粘稠度适中粘稠度差，流动性强粘稠度极强，微结块润滑度非常润滑润滑良好涂抹干涩稳定性外观无变化微微分层乳化，析出

如表7-9所示，当卡波姆940浓度为0.6%（w/w）时，凝胶基质表现出最优的流变学特性。表7-9卡波姆浓度梯度筛选卡波姆940含量%（w/w）外观均匀度粘腻度粘稠度润滑度稳定性总评分0.4外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感黏稠度较差非常润滑外观无变化120.6外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感比较黏稠非常润滑外观无变化130.8外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微比较黏稠润滑良好外观无变化101.0外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微比较黏稠润滑一般外观无变化8.51.2外观均匀，有光泽成膜感重，粘腻感重非常黏稠润滑一般外观无变化8

吐温80浓度为1%（w/w）时，凝胶的乳化效果最佳，能够确保驱蚊成分均匀分布。表7-11吐温80浓度梯度筛选吐温80含量%（w/w）外观均匀度粘腻度粘稠度润滑度稳定性总评分0.50外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感粘稠度适中非常润滑外观无变化110.75外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感粘稠度适中非常润滑外观无变化13.51.00外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感粘稠度适中非常润滑外观无变化121.25外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微粘稠度适中非常润滑外观无变化121.50外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微粘稠度适中润滑良好外观无变化11.5

保湿剂浓度为40%（w/w）时，凝胶的稳定性、保湿效果最佳。表7-10保湿剂浓度梯度筛选保湿剂含量%（w/w）外观均匀度粘腻度粘稠度润滑度稳定性总评分25外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感粘稠度适中润滑良好乳化，析出稳定性差，排除30外观均匀，有光泽清爽，成膜感轻，无明显粘感粘稠度适中润滑良好乳化，析出稳定性差，排除35外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微粘稠度适中非常润滑乳化，析出稳定性差，排除40外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微粘稠度适中非常润滑外观无变化1445外观均匀，有光泽成膜感微重，黏腻感轻微粘稠度适中非常润滑外观无变化12

在保湿剂浓度梯度耐热与耐寒测试中，25%、30%、35%的稳定性过差，故排除（如图7-11）。选取40%，45%，进行下一步长期留样试验（如图7-12，图7-13）。保湿剂浓度为40%（w/w）时，凝胶的稳定性效果最佳。故选择40%。左1空白，左245%，左340%，左435%，左530%，左625%ba图7-11保湿剂浓度梯度耐热与耐寒测试baa左1空白，a左245%试样，a左345%试样，b左1空白，b左240%试样，b左340%试样图7-12保湿剂浓度梯度长期留样试验（6个月）

7.4驱蚊药效实验四位志愿者的有效保护时间分别为2.68h、3.85h、3.29h和3.49h，总平均时长为3.32h（xˉ±SD=3.32±0.47）。表7-13驱蚊时间药效实验12345678910平均时长志愿者1驱蚊时长2.43.62.13.12.62.53.84.21.21.32.68志愿者2驱蚊时长2.65.11.35.34.62.43.62.94.763.85志愿者3驱蚊时长2.65.34.21.35.23.33.23.14.10.63.29志愿者4驱蚊时长4.35.21.34.81.92.65.33.61.34.63.49平均时长2.9754.82.2253.6253.5752.73.9753.452.8253.1253.3275

7.5皮肤刺激性评估（鸡胚尿囊膜实验）abc1cabc1c2e2e1d2d1e2e1d2d1a阳性，b阴性，c1加药前，c2加药后，d1加药前，d2加药后，e1加药前，e2加药后图7-14驱蚊凝胶急性眼刺激试验

一、标准曲线建立的科学意义本研究成功构建了OD600与CFU/mL的标准曲线，实现了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活菌数的精准换算。相较于传统OD值测量法易受死菌及代谢产物干扰导致结果偏高的问题，本方法显著提升了抗菌实验中活菌定量的准确性。需特别指出的是，不同检测方法对OD值与菌落数相关性存在显著影响。光电比浊法虽具快速检测优势，但其对菌落总数的表征精度有限。而平板计数法虽耗时较长，却能提供更精确的活菌定量数据REF_Ref20946\r\h[1]。典型例证如当OD600值为0.1时，金黄色葡萄球菌的菌落数为9.4×10⁷CFU/mL，而大肠杆菌则达到1.45×10⁸CFU/mL，充分揭示了不同菌种光吸收特性的种属差异性。二、挥发油协同抑菌机制香叶天竺葵油与薄荷油（1:1复配）对金黄色葡萄球菌表现出显著的协同抑菌效应，相较于单一使用，联合应用使最低抑菌浓度（MIC）降低了约50%REF_Ref21047\r\h[2]。与Kafa等（2021）报道的香叶天竺葵油-迷迭香油组合相比REF_Ref195741129\r\h[3]，本研究复配体系对金黄色葡萄球菌的MIC降幅更为显著，这归因于两种挥发油化学成分的功能互补：香叶天竺葵油中香茅醇通过靶向细胞膜结构发挥抗菌作用，而薄荷油中的薄荷醇则通过破坏膜通透性产生协同增效REF_Ref195741129\r\h[3]。Sanei-Dehkordi等（2023）进一步证实，香叶醇与薄荷醇可分别作用于细菌膜脂质和呼吸链酶系统，二者的联合作用显著增强了抗菌效果REF_Ref21273\r\h[4]。但值得注意的是，本体系对大肠杆菌的抑菌效果低于Terlizzi等（2022）报道的天竺葵-N-乙酰半胱氨酸组合REF_Ref21312\r\h[5]，提示亲水性成分可能通过增强渗透作用提升对革兰氏阴性菌外膜屏障的穿透效率。值得注意的是，对大肠杆菌的MIC值（0.313%v/v）显著高于金黄色葡萄球菌，可能与革兰氏阴性菌外膜屏障有关REF_Ref195741170\r\h[6]。三、凝胶基质的优化与驱蚊性能通过系统优化，确定卡波姆940浓度为0.6%（w/w）时凝胶具有最优的黏弹性（表7-9）。结合吐温80（1%）的乳化稳定作用与保湿剂（40%）的增塑效应，显著改善了制剂的物理稳定性与皮肤粘附性能。驱蚊功效评价显示，复配挥发油凝胶的平均有效保护时间为3.32小时（表7-13），虽低于化学驱避剂DEET（N,N-二乙基间甲苯酰胺，4-8小时），但显著优于柠檬桉油等单一植物提取物（约2小时）REF_Ref195741382\r\h[7,REF_Ref195741389\r\h8]。这种时效差异可能与挥发油组分的蒸汽压差异及基质的缓释动力学特性密切相关。四、驱蚊时长的差异与机理本研究获得的平均有效驱蚊时长（3.32小时）较王越等（2013）报道的薄荷单方提取物（1.5小时）提升121%REF_R