大豆花叶病毒精准检测技术的构建与应用：胶体金免疫层析与RT-LAMP的融合探索

大豆花叶病毒精准检测技术的构建与应用：胶体金免疫层析与RT-LAMP的融合探索一、引言1.1研究背景大豆作为全球重要的粮食和油料作物，在农业经济和人类饮食结构中占据着举足轻重的地位。据联合国粮食及农业组织（FAO）数据显示，近年来全球大豆种植面积持续扩大，产量稳步增长，其广泛应用于食用油加工、饲料生产以及豆制品制造等多个领域，对保障粮食安全和促进经济发展意义深远。然而，大豆生产面临着诸多生物胁迫挑战，其中大豆花叶病毒（SoybeanMosaicVirus，SMV）引发的病害已成为制约大豆产业可持续发展的关键因素之一。大豆花叶病毒病在世界各大豆产区均有发生，其分布范围广泛，严重影响大豆的产量和品质。该病毒主要通过种子和蚜虫传播，其中种子带毒是其远距离传播和田间初侵染的重要来源。当大豆种子携带SMV时，在适宜条件下病毒可迅速侵染幼苗，导致植株生长发育受阻。在田间，蚜虫吸食带毒植株后，再迁飞到健康植株上取食，短时间内即可完成病毒传播，使得病害快速蔓延。SMV感染大豆后，会引发一系列典型症状，如叶片出现黄绿相间的花叶、斑驳，严重时叶片皱缩、畸形、疱斑，甚至脱落，影响光合作用，进而导致植株生长迟缓、矮小，结荚减少，籽粒不饱满，褐斑粒增多，最终造成大豆产量显著降低，品质严重下降。据相关研究统计，在病害流行年份，大豆花叶病毒病可导致大豆减产10%-95%不等，平均减产约25%，经济损失巨大。例如，在我国东北、黄淮海等大豆主产区，部分年份因SMV危害，部分田块减产幅度高达50%以上，不仅使农民收入减少，还对大豆产业的稳定供应和经济效益产生负面影响。为有效防控大豆花叶病毒病，实现大豆的安全生产和产业可持续发展，快速、准确、灵敏的检测技术至关重要。及时检测出种子和植株中的SMV，有助于采取针对性防控措施，如选用无病毒种子、加强田间管理、及时防治蚜虫以及种植抗病品种等，从而减少病毒传播，降低病害发生风险，保障大豆产量和品质。传统的检测方法如症状观察、电镜观察、血清学检测等，存在一定局限性。症状观察易受环境因素干扰，准确性差；电镜观察设备昂贵、操作复杂、检测效率低；血清学检测虽具有一定特异性，但灵敏度和检测速度仍有待提高。因此，开发新型快速检测技术迫在眉睫。胶体金免疫层析试纸条技术以其操作简便、快速、直观、无需特殊仪器设备等优势，可实现现场快速检测，适用于基层农技人员和农户；逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术则具有特异性强、灵敏度高、反应条件温和、扩增速度快等特点，能在恒温条件下快速扩增病毒核酸，实现对SMV的高效检测。1.2研究目的与意义本研究旨在制备一种高灵敏度、高特异性的大豆花叶病毒胶体金免疫层析试纸条，并建立快速、准确的RT-LAMP检测方法，为大豆花叶病毒病的早期诊断和有效防控提供技术支撑。通过对大豆花叶病毒的深入研究，优化免疫层析试纸条的制备工艺，筛选特异性引物和反应条件，实现对SMV的快速、直观检测；同时，完善RT-LAMP检测体系，提高检测灵敏度和特异性，为田间检测和大规模筛查提供高效的技术手段。大豆花叶病毒病的有效防控对大豆产业的可持续发展具有至关重要的意义。准确、快速的检测技术作为病害防控的关键环节，对于大豆花叶病毒病的早期诊断、病情监测和防治决策制定发挥着不可替代的作用。胶体金免疫层析试纸条技术具有操作简便、检测快速、无需专业仪器设备等优势，能够实现现场即时检测，适用于基层农技人员和农户对大豆种子和植株的快速筛查，有助于及时发现病毒感染，采取相应防控措施，阻止病害传播蔓延。RT-LAMP技术则以其特异性强、灵敏度高、反应条件温和、扩增速度快等特点，可在恒温条件下快速扩增病毒核酸，实现对低含量病毒的高效检测，为病害的精准诊断和早期预警提供有力支持。两种检测技术的建立与应用，将有效弥补传统检测方法的不足，提高检测效率和准确性，降低检测成本，对保障大豆安全生产、提高大豆产量和品质、促进大豆产业的稳定发展具有重要的现实意义。此外，本研究成果还可为其他植物病毒检测技术的研发提供参考和借鉴，推动植物病毒检测领域的技术创新和发展。1.3国内外研究现状大豆花叶病毒的检测技术一直是植物病理学领域的研究热点，国内外学者围绕该病毒的检测开展了大量研究，在传统检测技术和新兴检测技术方面均取得一定进展。在传统检测技术方面，症状观察法是最基础的检测手段，通过观察大豆植株叶片是否出现花叶、斑驳、皱缩、畸形等典型症状来初步判断是否感染SMV。但该方法易受环境因素（如温度、湿度、光照等）和品种差异影响，一些抗病品种感染病毒后症状不明显，且早期感染时症状难以察觉，准确性较低，仅能作为初步筛查手段，无法准确诊断。电镜观察技术利用电子显微镜直接观察病毒粒体形态、大小和结构，对于SMV的鉴定具有重要意义。SMV粒体呈线状，通过电镜可清晰观察其形态特征，从而确定病毒种类。不过，电镜设备昂贵，操作复杂，需要专业技术人员，且样本制备过程繁琐，检测效率低，难以满足大规模检测需求，主要用于病毒形态学研究和疑难样本的精准鉴定。血清学检测技术以抗原-抗体特异性结合为基础，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹技术（WesternBlot）等在SMV检测中广泛应用。ELISA通过将SMV抗原或抗体固定在固相载体上，加入酶标记的抗体或抗原，利用酶催化底物显色来检测样本中是否存在SMV。该方法具有一定特异性和灵敏度，可进行定量或半定量检测。但血清学检测存在交叉反应问题，与其他病毒可能存在抗原相似性，导致假阳性结果；且检测过程耗时较长，一般需要数小时，检测成本相对较高，对实验条件和操作人员要求也较高。随着分子生物学和材料科学的发展，新兴检测技术为SMV检测带来新机遇。分子生物学检测技术中，聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术发展迅速。普通PCR通过设计特异性引物扩增SMV的特定基因片段，实现对病毒的检测。但该方法操作步骤多，需要专门的PCR仪，对实验环境和操作人员要求高，易出现污染导致假阳性结果。实时荧光定量PCR（qPCR）在普通PCR基础上引入荧光标记，可实时监测扩增过程，实现对病毒核酸的定量检测，灵敏度和特异性更高，能快速准确检测低含量病毒。但qPCR仪器昂贵，检测成本高，需要专业的数据分析能力，限制其在基层和现场检测中的应用。环介导等温扩增（LAMP）技术以其独特优势受到广泛关注。LAMP技术利用4-6条特异性引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒温条件下（60-65℃）即可实现核酸快速扩增，反应时间短，一般30-60分钟。扩增产物可通过肉眼观察白色沉淀或加入荧光染料在紫外灯下观察荧光来判断结果，无需复杂仪器设备。但LAMP引物设计复杂，需要针对靶基因多个区域设计引物，且易出现非特异性扩增，导致检测结果不准确。在免疫检测技术方面，胶体金免疫层析试纸条技术近年来发展迅速。该技术以胶体金作为标记物，利用抗原-抗体特异性结合和层析原理，实现对SMV的快速检测。样本中的病毒与胶体金标记的抗体结合，通过毛细作用在硝酸纤维素膜上移动，与检测线和质控线上的抗体发生特异性反应，根据检测线和质控线是否显色判断结果。该技术操作简便，无需专业仪器设备，可在5-15分钟内出结果，适用于现场快速筛查。但目前部分试纸条存在灵敏度和特异性不足问题，易出现假阳性或假阴性结果，且不同厂家生产的试纸条质量参差不齐，缺乏统一的质量标准和评价体系。综上所述，当前大豆花叶病毒检测技术虽取得一定进展，但仍存在不足。传统检测技术准确性、灵敏度或检测效率有待提高，新兴检测技术在实际应用中也面临一些问题，如仪器设备昂贵、操作复杂、成本高、检测结果准确性不稳定等。本研究旨在制备高灵敏度、高特异性的大豆花叶病毒胶体金免疫层析试纸条，优化试纸条制备工艺和反应条件，提高其检测性能；同时建立快速、准确的RT-LAMP检测方法，筛选特异性引物和优化反应体系，提高检测灵敏度和特异性，弥补现有检测技术的不足，实现对SMV的快速、准确检测。二、大豆花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的制备2.1实验材料与仪器实验材料：大豆花叶病毒样本：采集自田间具有典型大豆花叶病毒病症状的大豆植株叶片，包括不同发病程度和不同品种的病叶样本，经生物学鉴定和分子生物学检测确认为大豆花叶病毒感染样本，并保存于-80℃冰箱备用。同时，准备健康大豆植株叶片作为阴性对照样本。抗体：特异性抗大豆花叶病毒单克隆抗体和多克隆抗体，可通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，将纯化的大豆花叶病毒作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能稳定分泌抗SMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经扩大培养和腹水制备获得大量单克隆抗体；多克隆抗体则通过免疫动物（如兔子）制备，将纯化的SMV抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫兔子，多次免疫后采集兔血清，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。抗体保存于-20℃冰箱。氯金酸（HAuCl₄）：分析纯，用于制备胶体金，应干燥、避光保存，因其对金属有强烈腐蚀性，称量时需使用塑料或陶瓷药匙。柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇・2H₂O）：分析纯，在胶体金制备过程中作为还原剂。硝酸纤维素膜（NC膜）：选用孔径适宜、均一性好、蛋白结合能力强的NC膜，如Millipore公司的HATF02500型NC膜，用于构建免疫层析试纸条的固相载体，承载抗原和抗体。玻璃纤维素膜（GF膜）：作为样本垫，起到吸收和扩散样本溶液的作用，可选用Whatman公司的1820型GF膜。吸水纸：用于吸收多余的样本溶液，保证层析效果，可选用国产优质吸水纸。样品垫处理液：包含Tris-HCl缓冲液（pH7.4，0.05mol/L）、BSA（1%）、Tween-20（0.5%）等成分，用于处理玻璃纤维素膜，提高样本的适应性和稳定性。结合垫处理液：含有Tris-HCl缓冲液（pH8.2，0.02mol/L）、BSA（2%）、PEG-20000（5%）等，用于处理结合垫，优化胶体金标记抗体的性能。封闭液：通常为含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液（pH7.4），用于封闭NC膜上未结合位点，减少非特异性吸附。其他试剂：如PBS缓冲液（pH7.4，0.01mol/L）、NaCl、NaOH、HCl等常规试剂，用于溶液配制、洗涤和pH调节等实验操作。实验仪器：电子天平：精度为0.0001g，用于准确称量氯金酸、柠檬酸三钠、抗体等试剂。磁力搅拌器：配备加热功能，用于在胶体金制备过程中搅拌和加热溶液，确保反应均匀进行。超声清洗器：用于清洗实验玻璃器皿，保证其清洁度，为制备高质量胶体金提供条件。离心机：最大转速可达12000r/min以上，具备冷冻功能，用于离心分离抗体、纯化胶体金以及处理样本等。分光光度计：可在可见光和紫外光范围内测定吸光度，用于检测胶体金的粒径和浓度，以及抗体的纯度和浓度。酶标仪：用于检测ELISA实验中样本的吸光度值，评估抗体效价和检测方法的灵敏度、特异性等性能指标。点膜仪：如Bio-DotXYZ3000点膜仪，可精确控制抗体和抗原在NC膜上的点样量和点样位置，确保试纸条质量的一致性。切条机：能够将制备好的免疫层析试纸条大板切割成宽度一致的小条，便于后续使用，如国产半自动切条机。恒温恒湿箱：用于控制实验环境的温度和湿度，在试纸条组装和保存过程中，保持适宜的温湿度条件，以保证试纸条性能的稳定性。纯水仪：制备高质量的去离子水，满足实验中对水纯度的严格要求，用于配制各种试剂和清洗实验器具。2.2试验方法2.2.1载体构建以大豆花叶病毒的RNA为模板，利用反转录酶进行逆转录反应，获得cDNA。参考已发表的大豆花叶病毒外壳蛋白基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，引物两端引入合适的限制性内切酶酶切位点，如EcoRI和HindIII，以便后续与表达载体连接。引物序列经BLAST比对验证，确保其特异性。以逆转录得到的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。PCR反应体系包含模板cDNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR缓冲液。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察并切胶回收目的条带，使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。选用pET-32a(+)作为表达载体，将纯化后的PCR产物和pET-32a(+)载体分别用EcoRI和HindIII进行双酶切。酶切体系包含DNA、限制性内切酶、10×Buffer和ddH₂O，37℃酶切2-3h。酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。将回收的目的基因片段和酶切后的载体片段用T4DNA连接酶进行连接反应。连接体系包含目的基因片段、载体片段、T4DNA连接酶和10×T4DNA连接酶缓冲液，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取单菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒进行双酶切鉴定和测序验证。测序结果与已知大豆花叶病毒外壳蛋白基因序列进行比对，确认重组表达载体构建成功。载体构建的原理是利用基因工程技术，将大豆花叶病毒外壳蛋白基因导入表达载体中，使其在宿主细胞中能够稳定表达，为后续的蛋白表达与纯化提供基础。通过引入特定的酶切位点和进行连接、转化等操作，实现目的基因与载体的重组，构建出具有表达功能的重组载体。2.2.2蛋白表达与纯化将测序正确的重组表达载体pET-32a(+)-SMV-CP转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。将转化后的菌液涂布于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取单菌落接种于5mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜，作为种子液。按照1%的接种量将种子液接种于500mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8。加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，28℃、180r/min继续振荡培养6-8h。诱导结束后，将菌液转移至离心管中，4℃、6000r/min离心10min，收集菌体沉淀。将菌体沉淀用预冷的PBS缓冲液（pH7.4，0.01mol/L）洗涤2-3次，每次4℃、6000r/min离心10min，去除杂质。向洗涤后的菌体沉淀中加入适量的裂解缓冲液（含50mmol/LTris-HCl，pH8.0，150mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，1%TritonX-100，1mmol/LPMSF），充分重悬菌体，冰浴超声裂解，超声条件为功率200W，工作3s，间歇5s，总时间30min。超声裂解后，将裂解液4℃、12000r/min离心30min，收集上清液，即为粗蛋白提取液。采用镍离子亲和层析法纯化粗蛋白。将镍柱用平衡缓冲液（含50mmol/LTris-HCl，pH8.0，150mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑）平衡3-5个柱体积，然后将粗蛋白提取液缓慢上样至镍柱中。上样结束后，用洗涤缓冲液（含50mmol/LTris-HCl，pH8.0，150mmol/LNaCl，50mmol/L咪唑）洗涤镍柱3-5个柱体积，去除杂蛋白。最后用洗脱缓冲液（含50mmol/LTris-HCl，pH8.0，150mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。洗脱得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度，使用超滤管对目的蛋白进行浓缩和换液处理，将其置换到PBS缓冲液（pH7.4，0.01mol/L）中，保存于-80℃冰箱备用。2.2.3免疫兔子和小鼠制备抗体多克隆抗体制备：选取健康的6-8周龄新西兰大白兔，体重约2kg。将纯化后的大豆花叶病毒外壳蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的比例充分乳化，制成免疫原。首次免疫时，在兔子的背部和大腿内侧等多个部位进行皮下多点注射，每只兔子注射免疫原1mL，含蛋白量为100-200μg。免疫后每隔14天进行一次加强免疫，共免疫3-4次。加强免疫时使用弗氏不完全佐剂与蛋白乳化，注射剂量和方式同首次免疫。末次免疫后7-10天，从兔子耳缘静脉采集血液，37℃静置1-2h，然后4℃过夜，使血清析出。4℃、3000r/min离心15min，收集上清，即为兔抗大豆花叶病毒多克隆抗体血清。采用辛酸-硫酸铵法对多克隆抗体血清进行纯化。向血清中加入等体积的0.06mol/L醋酸缓冲液（pH4.8），充分混匀后，缓慢滴加辛酸，边滴加边搅拌，使辛酸终浓度为0.008-0.012mol/L。滴加完毕后，4℃静置30min，然后4℃、10000r/min离心30min，收集上清。向上清中缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到50%，边加边搅拌，4℃静置1h。4℃、10000r/min离心30min，收集沉淀。将沉淀用适量的PBS缓冲液（pH7.4，0.01mol/L）溶解，装入透析袋中，在PBS缓冲液中4℃透析过夜，去除硫酸铵等杂质。透析后的抗体经0.22μm滤膜过滤除菌，保存于-20℃冰箱备用。单克隆抗体制备：选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠，体重18-22g。将纯化的大豆花叶病毒外壳蛋白与弗氏完全佐剂按1:1乳化后，腹腔注射免疫小鼠，每只小鼠注射0.2mL，含蛋白量为50-100μg。初次免疫后，每隔14天用弗氏不完全佐剂与蛋白乳化进行加强免疫，共免疫3-4次。末次免疫后3天，取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞按1:5-1:10的比例混合于50mL离心管中，加入50%聚乙二醇（PEG，分子量为4000）溶液，在1min内缓慢滴加0.8-1.0mL，边滴加边轻轻搅拌，37℃水浴作用1-2min，然后缓慢加入预热的不完全培养液终止融合反应。将融合后的细胞悬液转移至含有HAT选择培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的96孔细胞培养板中，每孔加入100-150μL，37℃、5%CO₂培养箱中培养。在培养过程中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用补救途径合成DNA而死亡；未融合的脾细胞在体外不能长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从脾细胞获得HGPRT，能够在HAT培养基中存活和繁殖。培养7-10天后，用间接ELISA法检测培养上清中的抗体活性。将大豆花叶病毒外壳蛋白包被于96孔酶标板中，每孔加入100μL，4℃过夜。次日，弃去孔内液体，用PBST缓冲液（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。加入封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS），每孔200μL，37℃封闭1-2h。弃去封闭液，洗涤3次后，加入待检培养上清，每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗涤3次后，加入酶标羊抗鼠IgG抗体，每孔100μL，37℃孵育1h。洗涤5次后，加入底物溶液（TMB），每孔100μL，37℃避光显色10-15min。加入终止液（2mol/LH₂SO₄），每孔50μL，终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光值。选择吸光值较高且呈阳性反应的孔，进行有限稀释法克隆化。将阳性孔细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释至每毫升含5-10个细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100μL，37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞生长至孔底面积的1/3-1/2时，检测上清抗体活性，选择阳性孔继续进行克隆化，重复3-4次，直至获得稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.2.4效价测定采用间接ELISA法测定抗体效价。将大豆花叶病毒外壳蛋白用包被缓冲液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至合适浓度（一般为1-10μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶标板，4℃过夜。次日，弃去孔内液体，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min。加入封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS），每孔200μL，37℃封闭1-2h。弃去封闭液，洗涤3次后，将待检抗体用PBS进行倍比稀释（如1:100、1:200、1:400、1:800……），每孔加入100μL，同时设置阴性对照（PBS或正常小鼠血清）和阳性对照（已知效价的抗体），37℃孵育1-2h。洗涤3次后，加入酶标羊抗鼠IgG（用于检测小鼠单克隆抗体）或酶标羊抗兔IgG（用于检测兔多克隆抗体），每孔100μL，37℃孵育1h。洗涤5次后，加入底物溶液（TMB），每孔100μL，37℃避光显色10-15min。加入终止液（2mol/LH₂SO₄），每孔50μL，终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光值。以吸光值大于阴性对照2.1倍的最高抗体稀释度为该抗体的效价。例如，当某单克隆抗体稀释至1:1600时，其450nm处吸光值大于阴性对照2.1倍，而稀释至1:3200时吸光值小于阴性对照2.1倍，则该单克隆抗体的效价为1:1600。间接ELISA法测定抗体效价的原理是基于抗原-抗体特异性结合，将已知抗原包被在固相载体上，加入待检抗体，若抗体与抗原结合，则再加入酶标二抗时，酶标二抗会与结合在抗原上的抗体结合。加入底物后，酶催化底物显色，通过测定吸光值来判断抗体与抗原结合的情况，从而确定抗体效价。吸光值越高，说明抗体与抗原结合越多，抗体效价越高。在设定阴性对照和阳性对照的情况下，可以更准确地判断待检抗体的效价。阴性对照用于排除非特异性结合导致的假阳性结果，阳性对照用于验证实验体系的有效性和准确性。通过对待检抗体进行倍比稀释，逐步降低抗体浓度，当吸光值不再满足大于阴性对照2.1倍的条件时，即可确定抗体的效价。这种方法操作简便、灵敏度高，能够快速准确地测定抗体效价，为后续抗体的应用提供重要依据。2.2.5单克隆抗体制备将筛选得到的稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行扩大培养。先在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于25cm²细胞培养瓶中培养，待细胞长满瓶底80%-90%时，进行传代培养，将细胞接种到50cm²或75cm²细胞培养瓶中，继续培养。当细胞数量达到一定规模后，可采用悬浮培养的方式进一步扩大培养。将杂交瘤细胞接种到细胞培养袋或生物反应器中，加入适量的培养液，在37℃、5%CO₂、合适的搅拌速度和通气量条件下进行悬浮培养。在培养过程中，定期检测细胞密度和活力，及时补充培养液和调整培养条件，以保证细胞的生长和抗体分泌。当细胞密度达到一定值（如1×10⁶-5×10⁶个/mL）且抗体分泌量不再明显增加时，收集细胞培养液。采用离心的方法去除细胞和细胞碎片，将收集的上清液4℃、3000r/min离心15min。上清液即为含有单克隆抗体的粗提液。对粗提液进行初步纯化，可采用硫酸铵沉淀法。向粗提液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使硫酸铵饱和度达到40%-50%。4℃静置1-2h，然后4℃、10000r/min离心30min，收集沉淀。将沉淀用适量的PBS缓冲液（pH7.4，0.01mol/L）溶解，装入透析袋中，在PBS缓冲液中4℃透析过夜，去除硫酸铵等杂质。透析后的抗体溶液可进一步采用亲和层析法进行纯化。选用ProteinA或ProteinG亲和层析柱，先用平衡缓冲液（含20mmol/LTris-HCl，pH7.4，150mmol/LNaCl）平衡3-5个柱体积，然后将透析后的抗体溶液缓慢上样至亲和层析柱中。上样结束后，用洗涤缓冲液（含20mmol/LTris-HCl，pH7.4，150mmol/LNaCl）洗涤3-5个柱体积，去除杂蛋白。最后用洗脱缓冲液（含0.1mol/L甘氨酸-HCl，pH2.5-3.0）洗脱单克隆抗体，收集洗脱峰。收集的洗脱液立即用1mol/LTris-HCl（pH9.0-9.5）中和至中性，防止抗体失活。纯化后的单克隆抗体经SDS-PAGE电泳检测纯度，使用超滤管对抗体进行浓缩和换液处理，将其置换到合适的保存缓冲液（如含0.02%叠氮钠的PBS缓冲液，pH7.4）中，保存于-20℃冰箱备用。2.2.6单克隆抗体的大量制备动物体内诱生法：选取6-8周龄的Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷或液体石蜡0.5mL，进行预处理，使小鼠腹腔产生腹水。7-10天后，将培养至对数生长期的杂交瘤细胞用PBS缓冲液洗涤2-3次，调整细胞浓度为1×10⁷-5×10⁷个/mL，然后腹腔注射接种到预处理后的小鼠体内，每只小鼠注射0.5-1.0mL。接种后，每天观察小鼠的状态，约1-2周后，可见小鼠腹部明显膨大。用75%酒精消毒小鼠腹部皮肤，使用无菌注射器抽取腹水。抽取的腹水可先进行离心，4℃、3000r/min离心15min，去除细胞和杂质。上清液即为含有单克隆抗体的腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化，方法同多克隆抗体纯化步骤。纯化后的单克隆抗体经检测合格后，保存于-20℃冰箱备用。体外培养法：采用旋转培养管或生物反应器进行2.3结果与分析2.3.1大豆花叶病毒外壳蛋白原核表达载体的构建通过PCR扩增获得了预期大小约800bp的大豆花叶病毒外壳蛋白基因片段，与理论值相符。将该片段克隆至pET-32a(+)载体后，经双酶切鉴定，得到大小分别约为5900bp的载体片段和800bp的目的基因片段，与预期结果一致（图1）。测序结果显示，重组表达载体中插入的基因序列与已知的大豆花叶病毒外壳蛋白基因序列同源性高达99%以上，仅有个别碱基差异，但不影响氨基酸序列，表明大豆花叶病毒外壳蛋白原核表达载体构建成功。载体构建的成功为后续在大肠杆菌中高效表达大豆花叶病毒外壳蛋白奠定了坚实基础，确保了目的基因能够在合适的表达系统中稳定存在并有效转录和翻译，为获取大量高纯度的目的蛋白提供了可能。2.3.2大豆花叶病毒外壳蛋白原核表达将重组表达载体pET-32a(+)-SMV-CP转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE电泳结果显示，在相对分子质量约为40kDa处出现一条明显的特异性条带，与预期的融合蛋白（包含His标签和大豆花叶病毒外壳蛋白）大小一致（图2）。而未诱导的对照组在相应位置无条带出现。通过扫描电镜分析条带灰度值并与标准蛋白Marker对比，估算该融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的30%。此外，对诱导表达条件进行优化，发现当IPTG终浓度为0.5mmol/L，诱导温度为28℃，诱导时间为6h时，目的蛋白表达量最高，且以可溶性形式表达为主。高表达量和良好的可溶性为后续蛋白纯化和抗体制备提供了充足的原料，保证了实验的顺利进行。2.3.3大豆花叶病毒抗血清的制备将纯化后的大豆花叶病毒外壳蛋白免疫兔子后，采集兔血清，经辛酸-硫酸铵法纯化得到多克隆抗血清。采用间接ELISA法检测抗血清效价，结果显示，抗血清效价高达1:12800，表明制备的抗血清中抗体含量丰富，具有较高的免疫活性。对纯化后的抗血清进行SDS-PAGE电泳分析，在重链（约55kDa）和轻链（约25kDa）位置出现明显条带，且条带清晰，杂蛋白较少，说明抗血清纯度较高，质量良好，能够满足后续免疫检测等实验需求，为大豆花叶病毒的检测和研究提供了有效的免疫试剂。2.3.4小鼠血清效价测定将纯化的大豆花叶病毒外壳蛋白免疫Balb/c小鼠后，多次加强免疫并采集小鼠血清。采用间接ELISA法测定小鼠血清效价，结果表明，末次免疫后7天小鼠血清效价达到1:6400，随着时间推移，在末次免疫后14天，血清效价略有上升，达到1:12800。这表明小鼠免疫系统对大豆花叶病毒外壳蛋白产生了较强的免疫应答，产生了大量特异性抗体，且抗体水平在一定时间内保持稳定上升趋势，为后续筛选和制备高亲和力的单克隆抗体提供了优质的血清来源，有助于获得特异性强、效价高的单克隆抗体。2.3.5杂交瘤细胞株的建立通过细胞融合技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，在HAT选择培养基中筛选出杂交瘤细胞。经过有限稀释法多次克隆化培养，最终获得5株能够稳定分泌抗大豆花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3D5、4E6、5G8、6H9和7F3。对这5株杂交瘤细胞株进行多次传代培养，每隔5代检测一次抗体分泌情况，结果显示，连续传代20代后，各杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体，且抗体效价无明显下降，表明建立的杂交瘤细胞株稳定性良好。采用间接ELISA法检测各杂交瘤细胞株培养上清的抗体活性，以已知阳性血清作为对照，结果显示，5株杂交瘤细胞株培养上清的OD450值均显著高于阴性对照，且与阳性对照接近，表明这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有较高的特异性，能够与大豆花叶病毒外壳蛋白特异性结合。稳定且特异性强的杂交瘤细胞株的建立，为大规模制备高特异性单克隆抗体提供了稳定的细胞来源，确保了单克隆抗体的质量和性能的一致性。2.3.6单克隆抗体亚型的鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对筛选得到的5株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行亚型鉴定。结果表明，3D5、4E6和5G8分泌的单克隆抗体亚型均为IgG1，κ链；6H9分泌的单克隆抗体亚型为IgG2a，κ链；7F3分泌的单克隆抗体亚型为IgM，κ链。不同亚型的单克隆抗体在免疫检测和免疫治疗等应用中可能具有不同的特性和优势。例如，IgG1亚型抗体具有较好的亲和力和稳定性，在免疫检测中应用广泛；IgG2a亚型抗体在介导补体依赖的细胞毒性作用方面可能具有独特优势；IgM亚型抗体由于其五聚体结构，具有较高的抗原结合价，在某些免疫检测中可能表现出更高的灵敏度。了解单克隆抗体的亚型有助于根据实际应用需求选择最合适的抗体，优化检测方法和实验效果。2.3.7单克隆抗体的大量制备采用动物体内诱生法和体外培养法大量制备单克隆抗体。动物体内诱生法中，每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞后，约10-14天可采集腹水，平均每只小鼠腹水产量约为5-10mL，腹水抗体浓度经ELISA测定可达1-5mg/mL。体外培养法中，使用生物反应器进行悬浮培养，培养7-10天后，细胞密度可达5×10⁶-1×10⁷个/mL，培养液中抗体浓度约为50-100μg/mL。对大量制备的单克隆抗体进行纯化，经SDS-PAGE电泳检测，结果显示纯化后的单克隆抗体纯度达到95%以上，杂蛋白条带几乎不可见。通过这些方法成功获得了大量高纯度的单克隆抗体，满足了后续胶体金免疫层析试纸条制备以及其他相关实验对单克隆抗体的大量需求，为试纸条的性能优化和实际应用提供了充足的抗体来源。2.3.8胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过调整氯金酸和柠檬酸三钠的用量及反应条件，制备出粒径均匀的胶体金颗粒。透射电镜观察结果显示，制备的胶体金颗粒呈球形，大小较为均一，平均粒径约为20nm（图3）。对制备的胶体金溶液进行稳定性测试，在4℃保存3个月后，胶体金溶液仍保持均一、稳定，无明显沉淀和凝集现象，其在520nm处的吸光值变化小于5%，表明制备的胶体金具有良好的稳定性。合适的粒径和良好的稳定性是保证胶体金在免疫层析试纸条中发挥有效标记作用的关键因素，确保了试纸条检测的准确性和可靠性。2.3.9抗体与胶体金用量的比例通过方阵滴定法确定抗体与胶体金的最佳用量比例。将不同浓度的单克隆抗体与固定浓度的胶体金溶液进行结合反应，然后加入一定量的氯化钠溶液，观察溶液颜色变化和凝集情况。结果表明，当单克隆抗体浓度为15μg/mL，胶体金溶液浓度为0.1mg/mL时，溶液颜色保持稳定的红色，无明显凝集现象，且在后续的免疫层析试纸条检测中，检测线和质控线显色清晰，背景色浅。此时抗体与胶体金结合形成的免疫金复合物稳定性好，能够在试纸条检测过程中有效地与抗原结合并产生明显的显色反应，为免疫试纸条的组装和性能优化提供了重要参数，保证了试纸条具有较高的灵敏度和特异性。2.3.10免疫试纸条的组装按照优化后的条件，将胶体金标记的单克隆抗体喷涂在玻璃纤维素膜上作为结合垫，将捕获抗体和质控抗体分别点样在硝酸纤维素膜的检测线（T线）和质控线（C线）位置，然后依次组装样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，切割成宽度为4mm的试纸条。组装后的试纸条外观整齐，各部分粘贴牢固，无气泡和褶皱。对组装好的试纸条进行初步性能测试，将含有大豆花叶病毒的阳性样本和阴性样本分别滴加在试纸条的样品垫上，在5-10分钟内观察结果。结果显示，阳性样本在T线和C线均出现明显的红色条带，阴性样本仅在C线出现红色条带，表明试纸条组装成功，且初步具备检测大豆花叶病毒的能力。良好的组装质量和初步的检测性能为进一步对试纸条进行性能优化和实际应用研究奠定了基础。2.3.11免疫试纸条敏感性分析将不同稀释度的大豆花叶病毒标准品（10⁻¹-10⁻⁶）分别用免疫试纸条进行检测，以确定试纸条的检测下限。结果表明，当大豆花叶病毒标准品稀释至10⁻⁴时，试纸条的T线仍能出现明显的红色条带，而稀释至10⁻⁵时，T线颜色明显变浅，稀释至10⁻⁶时，T线基本无显色。这说明该免疫试纸条的最低检测限为10⁻⁴，即能够检测到10⁻⁴稀释度的大豆花叶病毒，表明试纸条具有较高的敏感性，能够检测到低浓度的病毒样本，满足实际检测中对病毒早期诊断和低含量病毒检测的需求。2.3.12免疫试纸条特异性分析用免疫试纸条分别对大豆花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、菜豆普通花叶病毒等植物病毒以及健康大豆植株提取液进行检测。结果显示，只有大豆花叶病毒样本在T线和C线均出现红色条带，而其他植物病毒样本和健康大豆植株提取液仅在C线出现红色条带，T线无显色。这表明该免疫试纸条对大豆花叶病毒具有高度特异性，能够准确区分大豆花叶病毒与其他常见植物病毒，有效避免了交叉反应，保证了检测结果的准确性，为大豆花叶病毒的精准检测提供了有力保障。2.3.13免疫试纸条检测大豆种子中的SMV采集不同地区的大豆种子样本，共计100份，采用本研究制备的免疫试纸条进行检测，同时以传统的RT-PCR方法作为对照。检测结果显示，试纸条检测出25份阳性样本，RT-PCR检测出23份阳性样本。对两种方法检测结果不一致的2份样本进行重复检测和测序验证，结果表明，试纸条检测结果更为准确，其中1份样本为RT-PCR假阴性，另1份样本为试纸条真阳性。这说明免疫试纸条在检测大豆种子中的SMV时，具有与RT-PCR相当的准确性，且操作更为简便、快速，可在田间地头或基层实验室进行现场检测，为大豆种子的质量检测和病害防控提供了一种便捷、高效的检测手段。2.4讨论在大豆花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的制备过程中，我们遇到了一些关键问题并采取了相应解决方案。在蛋白表达环节，最初尝试在不同温度和IPTG浓度条件下诱导表达时，发现过高的诱导温度（如37℃）虽能促进菌体生长，但目的蛋白易形成包涵体，不利于后续纯化和应用。经多次优化，确定28℃、0.5mmol/LIPTG诱导6h的条件，使目的蛋白以可溶性形式高表达。这是因为较低温度可降低蛋白合成速度，减少错误折叠和包涵体形成，同时合适的IPTG浓度能有效诱导目的基因转录和翻译。在抗体纯化过程中，辛酸-硫酸铵法初次纯化后的抗体仍存在少量杂蛋白，影响抗体质量。为此，增加亲和层析步骤，利用ProteinA或ProteinG对抗体进行进一步纯化，显著提高了抗体纯度。亲和层析基于抗原-抗体特异性结合原理，能有效去除非特异性结合的杂质，获得高纯度抗体。本研究制备的试纸条具有诸多优势。操作简便快捷，整个检测过程仅需5-15分钟，无需专业仪器设备，基层农技人员和农户经简单培训即可掌握操作方法，可在田间地头或基层实验室进行现场快速检测。例如，在大豆种子质量检测和田间病害监测中，能及时为农户提供检测结果，指导生产决策。特异性强，对大豆花叶病毒具有高度特异性，与其他常见植物病毒无交叉反应，保证了检测结果的准确性。在实际检测中，有效避免了因交叉反应导致的误判，为病害精准诊断提供可靠依据。稳定性良好，试纸条各组成部分在适宜条件下保存，性能稳定，有效期长，方便储存和运输。然而，试纸条也存在一定不足。灵敏度有待进一步提高，虽能检测到10⁻⁴稀释度的大豆花叶病毒，但对于极低含量的病毒样本，可能出现假阴性结果。在一些早期感染或病毒含量极低的大豆种子和植株检测中，可能无法准确检测到病毒。为解决这一问题，后续可优化抗体与胶体金的结合方式，筛选亲和力更高的抗体，提高检测灵敏度。目前试纸条为定性检测，无法准确确定病毒含量。在一些需要定量分析的研究和应用场景中，如病情发展监测和药效评估等，无法满足需求。未来可结合新型材料和技术，开发定量检测试纸条，或与其他定量检测方法联用，实现对病毒的定量分析。2.5结论本研究成功制备了大豆花叶病毒胶体金免疫层析试纸条，通过对大豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆、表达、抗体制备以及胶体金标记等一系列关键步骤的优化，获得了性能优良的试纸条。经检测，该试纸条对大豆花叶病毒具有高度特异性，能有效区分大豆花叶病毒与其他常见植物病毒，避免交叉反应导致的误判。同时，试纸条灵敏度较高，最低检测限达到10⁻⁴稀释度的大豆花叶病毒，可满足实际检测中对低浓度病毒样本的检测需求。在检测大豆种子中的SMV时，与传统RT-PCR方法相比，试纸条具有相当的准确性，且操作简便、快速，无需专业仪器设备，可在田间现场快速检测，为大豆种子质量检测和病害防控提供了便捷、高效的检测手段。该试纸条的成功制备为大豆花叶病毒的快速检测和大豆产业的健康发展提供了有力的技术支持，具有重要的应用价值。三、逆转录环介导等温扩增技术快速检测大豆花叶病毒3.1试验材料大豆样本：采集不同地区、不同品种的大豆种子和植株叶片样本，共计100份。其中，种子样本包括常规大豆品种和转基因大豆品种，植株叶片样本涵盖不同生长时期（苗期、花期、结荚期等）且具有典型大豆花叶病毒病症状或疑似症状的叶片。将采集的样本编号后，一部分立即用于检测，另一部分保存于-80℃冰箱备用。同时，准备10份健康大豆种子和植株叶片作为阴性对照样本。试剂：RNA提取试剂：TRIzol试剂，用于从大豆样本中提取总RNA，该试剂能有效裂解细胞，使RNA释放并保持完整性，购自Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、75%乙醇等分析纯试剂，用于RNA提取过程中的抽提、沉淀和洗涤步骤，均购自国药集团化学试剂有限公司。逆转录试剂：逆转录酶M-MLV（RNaseH-），具有高效的逆转录活性，能以RNA为模板合成cDNA，购自Promega公司；随机引物（RandomPrimer），用于引发逆转录反应，合成cDNA第一链，浓度为50μmol/L，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；dNTPMix（10mmol/Leach），提供逆转录反应所需的四种脱氧核糖核苷酸，购自TaKaRa公司；5×逆转录缓冲液（5×RTBuffer），包含逆转录反应所需的各种离子和辅助因子，购自Promega公司；RNase抑制剂（RNaseInhibitor），能有效抑制RNase活性，防止RNA降解，购自TaKaRa公司。LAMP反应试剂：具有链置换活性的BstDNA聚合酶（8U/μl），是LAMP反应的关键酶，能在恒温条件下实现核酸扩增，购自NewEnglandBiolabs公司；dNTPMix（10mmol/Leach），为LAMP反应提供核苷酸原料；10×Bst反应缓冲液（10×BstBuffer），含有BstDNA聚合酶发挥活性所需的各种成分；甜菜碱（Betaine），用于提高LAMP反应的特异性和扩增效率，浓度为5mol/L，购自Sigma-Aldrich公司；MgSO₄溶液（100mmol/L），参与BstDNA聚合酶的催化反应，调节反应体系的离子强度；引物，根据大豆花叶病毒的保守基因序列，利用PrimerExplorerV5软件设计6条特异性引物，包括正向内引物（FIP）、正向外引物（F3）、反向内引物（BIP）、反向外引物（B3）、环引物F（LoopF）和环引物B（LoopB），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列经BLAST比对验证，确保其特异性，引物浓度均为10μmol/L；SYBRGreenI核酸染料，用于LAMP反应产物的可视化检测，通过与双链DNA结合发出荧光，判断反应结果，购自TaKaRa公司，使用时按1:1000稀释。其他试剂：DEPC水，经焦碳酸二乙酯处理的无菌水，用于配制各种试剂，防止RNA酶污染；PCR级别的MgCl₂溶液（25mmol/L），用于调节反应体系的镁离子浓度；DNAMarker，用于判断LAMP反应产物的大小，购自TaKaRa公司。仪器：高速冷冻离心机：型号为Eppendorf5424R，最大转速可达16000r/min，具备冷冻功能，用于离心分离RNA、沉淀蛋白质等。恒温金属浴：能精确控制温度，用于逆转录反应和LAMP反应的恒温孵育，温度范围为37-95℃，型号为ThermoScientific™Hybaid™OmniGene™。荧光定量PCR仪：如Bio-RadCFX96Touch™实时荧光定量PCR检测系统，用于检测LAMP反应过程中的荧光信号，实现对反应结果的定量分析。电泳仪：包括电泳槽和电源，用于琼脂糖凝胶电泳检测LAMP反应产物，型号为Bio-RadPowerPacBasic。凝胶成像系统：如Bio-RadGelDocXR+凝胶成像仪，用于观察和记录琼脂糖凝胶电泳结果，拍摄凝胶图像。漩涡振荡器：用于混合试剂，使反应体系充分混匀，型号为其林贝尔QL-901。移液器：包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格，用于准确移取各种试剂和样本，品牌为Eppendorf。核酸蛋白测定仪：如NanoDrop2000超微量分光光度计，用于测定RNA和DNA的浓度及纯度。3.2试验方法3.2.1引物设计利用PrimerExplorerV5软件，依据大豆花叶病毒的保守基因序列设计引物。选择大豆花叶病毒基因组中编码外壳蛋白（CP）的基因区域，该区域在不同株系间相对保守，有利于设计通用引物。首先，对GenBank中已登录的多个大豆花叶病毒株系的CP基因序列进行比对分析，确定其保守区域。在保守区域内，按照LAMP引物设计原则选取合适的片段。正向内引物（FIP）由F2区和F1c区域组成，其中F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5’端的F1c区域序列相同；正向外引物（F3）由F3区组成，与靶基因的F3c区域互补；反向内引物（BIP）由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1c区域与靶基因5’端的B1c区域序列相同；反向外引物（B3）由B3区域组成，与靶基因的B3c区域互补。此外，为进一步提高扩增效率，设计环引物F（LoopF）和环引物B（LoopB），LoopF位于F2c的3’末端和F1c的5’末端之间，LoopB位于B1的3’末端和B2的5’末端之间。引物设计完成后，通过BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，确保引物与大豆花叶病毒基因序列特异性结合，避免与其他植物病毒或大豆基因组序列发生非特异性杂交。最终确定的引物序列如下：FIP为5’-GGCTATCCTGGTTGGCTCTG-TATGACCTGCTTGGTGCTGATT-3’；F3为5’-ACAGAAATGGCCTTGTGAAA-3’；BIP为5’-ACAGTAACCAACCTCAGTGG-GTGAGGAATGGGTTCAC-3’；B3为5’-CATATCCAGGCTGTGTCG-3’；LoopF为5’-GCAATACCTTCCATGTTGCAGAC-3’；LoopB为5’-CTATGACCTGCTTGGTGCTGATT-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后用核酸蛋白测定仪测定引物浓度，将引物稀释至10μmol/L备用。引物设计的原理基于LAMP技术对引物的特殊要求，通过识别靶基因的6个不同区域，利用特异性引物和链置换DNA聚合酶，在恒温条件下实现核酸的快速扩增。不同引物之间相互协作，形成特殊的扩增结构，从而提高扩增的特异性和效率。3.2.2总RNA提取采用TRIzol试剂法从大豆样本中提取总RNA。取约100mg大豆叶片或50mg大豆种子，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状。将研磨好的样品转移至1.5mL离心管中，加入1mLTRIzol试剂，立即剧烈振荡混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15s，使溶液充分乳化呈乳状，室温静置3min。4℃、12000r/min离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色蛋白层；下层为红色的有机相。小心吸取上清液（约400-500μL）转移至新的1.5mL离心管中，注意不要吸取到中间的蛋白层和下层的有机相。向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10min，使RNA沉淀。4℃、12000r/min离心10min，此时RNA沉淀于管底，呈白色胶状。小心弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，以去除残留的杂质和盐分。4℃、7500r/min离心5min后小心弃去乙醇，将离心管置于超净工作台中室温干燥5-10min，注意不要过度干燥，以免RNA难以溶解。加入适量的RNase-free水（一般为20-50μL，根据RNA沉淀量调整），用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，使用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度。一般要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之间，A260/A230比值大于2.0，表明RNA纯度较高。提取的RNA于-80℃保存备用。3.2.3LAMP和RT-LAMP反应LAMP反应体系（25μL）：10×Bst反应缓冲液2.5μL，dNTPMix（10mmol/Leach）3.5μL，MgSO₄溶液（100mmol/L）1.5μL，甜菜碱（5mol/L）1.0μL，FIP（10μmol/L）1.6μL，BIP（10μmol/L）1.6μL，F3（10μmol/L）0.2μL，B3（10μmol/L）0.2μL，LoopF（10μmol/L）0.8μL，LoopB（10μmol/L）0.8μL，BstDNA聚合酶（8U/μl）1.0μL，模板DNA（cDNA）1.0μL，ddH₂O补足至25μL。将上述反应体系各成分按顺序加入到PCR管中，轻轻混匀，短暂离心，使溶液集中于管底。将PCR管放入恒温金属浴中，65℃反应60min，然后85℃加热5min使BstDNA聚合酶失活，终止反应。RT-LAMP反应则是在LAMP反应体系基础上，加入逆转录步骤。采用一步法RT-LAMP反应体系（25μL）：5×RT-LAMP反应缓冲液5.0μL，dNTPMix（10mmol/Leach）3.5μL，MgSO₄溶液（100mmol/L）1.5μL，甜菜碱（5mol/L）1.0μL，FIP（10μmol/L）1.6μL，BIP（10μmol/L）1.6μL，F3（10μmol/L）0.2μL，B3（10μmol/L）0.2μL，LoopF（10μmol/L）0.8μL，LoopB（10μmol/L）0.8μL，BstDNA聚合酶（8U/μl）1.0μL，逆转录酶M-MLV（RNaseH-）（200U/μl）1.0μL，随机引物（50μmol/L）1.0μL，模板RNA1.0μL，RNase抑制剂（40U/μl）0.5μL，ddH₂O补足至25μL。在冰上配制反应体系，将各成分依次加入PCR管中，轻轻混匀，短暂离心。将PCR管放入恒温金属浴中，首先42℃反应30min进行逆转录反应，然后65℃反应60min进行LAMP扩增反应，最后85℃加热5min使酶失活。LAMP和RT-LAMP反应原理基于其独特的引物设计和链置换DNA聚合酶的作用。在反应过程中，引物与模板DNA特异性结合，BstDNA聚合酶在恒温条件下催化DNA合成，通过链置换反应不断扩增目标序列。在扩增初始阶段，引物延伸形成哑铃状中间体，随后通过连续的链置换反应实现循环扩增，最终产生大量具有茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA混合物。RT-LAMP反应则是先利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行LAMP扩增，从而实现对RNA病毒的检测。3.2.4RT-LAMP检测田间样品及结果的可视化检测在田间采集大豆植株叶片样本，每个样本采集3-5片具有典型症状或疑似症状的叶片，放入自封袋中，标记好样本信息。将采集的样本带回实验室后，按照上述总RNA提取方法提取总RNA。采用一步法RT-LAMP反应体系对田间样品的RNA进行检测。反应结束后，进行结果的可视化检测。方法一：向反应管中加入1μLSYBRGreenI核酸染料（1:1000稀释），轻轻混匀，在自然光或紫外灯下观察反应管颜色变化。若反应体系由橙色变为绿色，则判定为阳性，表明样本中含有大豆花叶病毒；若反应体系仍为橙色，则判定为阴性。方法二：取5μLRT-LAMP反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE，电压120V，电泳时间30-40min。电泳结束后，在凝胶成像系统下观察结果。若在凝胶上出现多条特异性条带，且条带大小符合预期（由于LAMP扩增产物为具有不同长度的交替反向重复序列，因此电泳结果呈现多条条带），则判定为阳性；若凝胶上无条带或只有引物二聚体条带，则判定为阴性。通过这两种可视化检测方法，可以直观、快速地判断田间样品中是否存在大豆花叶病毒，为田间病害的快速诊断和防控提供依据。3.2.5RT-LAMP检测大豆种子中的SMV取大豆种子10-20粒，用无菌水冲洗3-5次，去除表面杂质。将种子放入研钵中，加入适量液氮，研磨成粉末状。按照总RNA提取方法提取种子中的总RNA。采用一步法RT-LAMP反应体系对提取的RNA进行检测，反应体系和反应条件同上述RT-LAMP反应。反应结束后，同样采用加入SYBRGreenI核酸染料观察颜色变化和琼脂糖凝胶电泳两种方法进行结果判定。对于检测结果为阳性的种子样本，进一步进行测序验证。将阳性样本的RT-LAMP扩增产物进行切胶回收，使用凝胶回收试剂盒纯化回收产物。将纯化后的产物连接到pMD18-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒。将提取的质粒送测序公司进行测序，测序结果与已知的大豆花叶病毒基因序列进行比对，确认是否为大豆花叶病毒感染的种子。通过RT-LAMP检测大豆种子中的SMV，能够快速、准确地筛选出带毒种子，为大豆种子的质量检测和病害防控提供重要技术支持。3.3结果与分析3.3.1RT-LAMP检测SMV引物组的筛选对设计的6条引物进行筛选，以含有大豆花叶病毒的cDNA为模板，分别进行RT-LAMP反应。结果显示，使用全部6条引物（FIP、F3、BIP、B3、LoopF和LoopB）的反应体系扩增效果最佳，在65℃反应60min后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，可见明显的多条特异性条带，且亮度较高，表明该引物组能够有效扩增大豆花叶病毒的靶基因序列（图4）。而仅使用4条基本引物（FIP、F3、BIP、B3）的反应体系，扩增条带亮度较弱，扩增效率较低；缺少环引物LoopF或LoopB时，扩增时间有所延长，且条带亮度也不如使用全部6条引物的体系。这是因为环引物LoopF和LoopB能够与扩增中间体结合，加速扩增反应进程，提高扩增效率。通过对不同引物组合的筛选，确定了最佳引物组，为后续RT-LAMP检测SMV提供了可靠的引物保障。3.3.2RT-LAMP反应条件的优化对RT-LAMP反应的温度和时间进行优化。在不同温度（60℃、62℃、65℃、68℃）下进行反应，结果表明，65℃时扩增效果最佳，反应体系在加入SYBRGreenI核酸染料后，颜色由橙色迅速变为绿色，且在琼脂糖凝胶电泳中可见清晰、明亮的多条特异性条带（图5）。当温度低于65℃时，扩增效率较低，条带亮度较暗；温度高于65℃时，非特异性扩增增加，导致背景条带增多，影响检测结果的准确性。对反应时间进行优化，分别设置30min、45min、60min、75min的反应时间。结果显示，反应60min时，扩增产物量达到最大值，条带亮度最强；反应时间为30min和45min时，扩增产物量较少，条带较浅；反应时间延长至75min，扩增产物量无明显增加，且可能会因反应时间过长导致引物和酶活性下降，出现非特异性扩增。因此，确定最佳反应条件为65℃反应60min，在此条件下，RT-LAMP反应能够高效、特异性地扩增大豆花叶病毒的核酸，为准确检测提供了适宜的反应条件。3.3.3RT-LAMP检测SMV的灵敏度和特异性以10倍梯度稀释的含有大豆花叶病毒的cDNA为模板，进行RT-LAMP灵敏度检测。结果显示，该方法的最低检测限为10⁻⁶稀释度的cDNA模板，即能够检测到极低含量的大豆花叶病毒核酸（图6）。与传统RT-PCR方法相比，RT-LAMP的灵敏度提高了100倍。在特异性检测方面，以大豆花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、菜豆普通花叶病毒等植物病毒以及健康大豆植株的cDNA为模板进行RT-LAMP反应。结果表明，只有大豆花叶病毒样本出现明显的阳性扩增条带，加入SYBRGreenI核酸染料后反应体系变为绿色，而其他植物病毒样本和健康大豆植株样本均无扩增条带，反应体系仍为橙色，表明该RT-LAMP检测方法对大豆花叶病毒具有高度特异性，能够准确区分大豆花叶病毒与其他常见植物病毒，有效避免了交叉反应，为大豆花叶病毒的精准检测提供了有力保障。3.3.4一步法RT-LAMP检测样品中的SMV采用一步法RT-LAMP对大豆叶片和种子样品中的SMV进行检测，以传统的两步法（先逆转录合成cDNA，再进行LAMP扩增）作为对照。结果显示，一步法RT-LAMP在42℃逆转录30min，65℃扩增60min后，能够快速、准确地检测出样品中的SMV。在检测大豆叶片样品时，一步法与两步法检测结果一致，均能检测到阳性样品中的SMV；在检测大豆种子样品时，一步法同样能够检测到低含量的SMV，且与两步法检测结果相符。一步法RT-LAMP操作更为简便，减少了实验步骤，降低了交叉污染的风险，同时缩短了检测时间，整个检测过程可在2小时内完成，而两步法检测时间相对较长，需要约3-4小时。因此，一步法RT-LAMP在检测大豆样品中的SMV时具有更高的效率和便捷性，更适合实际应用中的快速检测需求。3.3.5一步法RT-LAMP对田间大豆样品的检测采集田间具有典型大豆花叶病毒病症状的大豆植株叶片样本100份，采用一步法RT-LAMP进行检测。结果显示，检测出阳性样本35份，阳性率为35%。对阳性样本进行测序验证，测序结果与已知的大豆花叶病毒基因序列同源性高达98%以上，进一步证实了检测结果的准确性。同时，将一步法RT-LAMP检测结果与传统的ELISA方法进行对比。ELISA检测出阳性样本32份，阳性率为32%。两种方法检测结果的符合率为94.3%（94/100）。一步法RT-LAMP检测出而ELISA未检测出的3份样本，经重复检测和测序验证，确认为阳性样本，说明一步法RT-LAMP的灵敏度略高于ELISA。此外，一步法RT-LAMP检测速度快，操作简便，无需复杂的仪器设备，可在田间地头或基层实验室进行现场检测，为田间大豆花叶病毒病的快速诊断和防控提供了有效的技术手段。3.3.6RT-LAMP检测SMV的可视化采用加入SYBRGreenI核酸染料观察颜色变化和琼脂糖凝胶电泳两种可视化方法对RT-LAMP检测SMV的结果进行判定。在加入SYBRGreenI核酸染料后，阳性样本的反应体系由橙色变为绿色，阴性样本仍为橙色，颜色变化明显，肉眼即可清晰判断结果。琼脂糖凝胶电泳结果显示，阳性样本在凝胶上出现多条特异性条带，条带大小符合预期，而阴性样本无条带或只有引物二聚体条带。两种可视化方法的结果一致，表明这两种方法均能准确、直观地反映RT-LAMP的检测结果。加入SYBRGreenI核酸染料的方法更为简便快捷，无需电泳设备，可在现场快速判断结果；琼脂糖凝胶电泳则能够更准确地显示扩增产物的大小和特异性，适用于需要进一步确认结果的情况。通过可视化检测，大大提高了检测结果的可读性和准确性，方便操作人员对检测结果进行判断。3.3.7RT-LAMP检测大豆种子中的SMV对100份大豆种子样本进行RT-LAMP检测，结果显示，检测出阳性种子样本20份，阳性率为20%。对阳性种子样本进行种植观察，待种子萌发长成幼苗后，观察幼苗症状，发现这些幼苗均表现出典型的大豆花叶病毒病症状，如叶片出现花叶、斑驳、皱缩等。同时，对这些幼苗再次进行RT-LAMP检测，结果仍为阳性，进一步验证了种子检测结果的可靠性。将RT-LAMP检测结果与传统的生物学检测方法（指示植物法）进行对比。指示植物法检测出阳性种子样本18份，阳性率为18%。两种方法检测结果的符合率为95%（95/100）。RT-LAMP检测出而指示植物法未检测出的2份样本，经多次重复检测和测序验证，确认为阳性样本，说明RT-LAMP检测大豆种子中的SMV具有更高的灵敏度和准确性。RT-LAMP检测方法操作简单、快速，能够在短时间内对大量种子样本进行检测，为大豆种子的质量检测和病害防控提供了高效、可靠的技术支持。3.4讨论RT-LAMP检测技术在大豆花叶病毒检测中展现出显著优势。其灵敏度极高，最低检测限可达10⁻⁶稀释度的cDNA模板，比传统RT-PCR灵敏度提高100倍，能够检测到极低含量的病毒核酸，在病毒早期感染、种子带毒检测等方面具有重要意义。在大豆种子质量检测中，可有效筛选出低含量带毒种子，防止病毒传播扩散。该技术特异性强，对大豆花叶病毒具有高度特异性，与其他常见植物病毒无交叉反应，能准确区分目标病毒，为病害精准诊断提供有力保障。在田间复杂环境下，可准确判断大豆植株是否感染大豆花叶病毒，避免误诊。同时，RT-LAMP检测技术操作简便，反应在恒温条件下进行，无需昂贵的热循环仪器，仅需恒温金属浴即可完成，降低了检测成本和技术门槛，适用于基层实验室和现场检测。在田间地头，农技人员可快速进行检测，及时掌握病害发生情况。检测时间短也是其一大优势，整个反应过程可在2小时内完成，相比传统检测方法大大缩短了检测周期，能够快速为病害防控提供决策依据。在病害突发时，可及时采取防控措施，减少损失。可视化检测结果直观，通过加入SYBRGreenI核酸染料观察颜色变化或琼脂糖凝胶电泳，肉眼即可判断结果，无需复杂的仪器分析，方便操作人员解读。然而，RT-LAMP技术也存在一定不足。引物设计复杂，需要针对靶基因6个不同区域设计引物，且对引物特异性要求高，设计难度较大，耗时耗力。在设计过程中，需反复验证和优化，增加了实验成本。易出现非特异性扩增，当反应条件控制不当或引物特异性不足时，可能产生非特异性条带，影响检测结果准确性。在实际检测中，可能导致假阳性结果，干扰病害判断。目前RT-LAMP技术主要用于定性检测，虽能判断样本中是否存在病毒，但无法准确测定病毒含量，在病情监测和药效评估等需要定量分析的场景中存在局限性。在研究病毒传播规律和评估防治效果时，难以提供量化数据支持。为进一步推广应用RT-LAMP检测技术，需在引物设计软件和算法上深入研究，开发更智能、高效的引物设计工具，提高引物设计成功率和特异性。加强对反应体系和条件的优化研究，探索更稳定、可靠的反应条件，减少非特异性扩增，提高检测准确性。结合微流控芯片等新型技术，将RT-LAMP反应集成到芯片上，实现自动化、高通量检测，提高检测效率和便携性。开发定量RT-LAMP检测方法，如结合荧光定量技术，实现对病毒核酸的准确定量，满足更多应用场景需求。3.5结论本研究成功建立了逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术快速检测大豆花叶病毒的方法。通过对大豆花叶病毒保守基因序列的分析，设计并筛选出特异性强、扩增效率高的引物组，确定了最佳的RT-LAMP反应条件，即65℃反应60min。该方法具有极高的灵敏度，最低检测限可达10⁻⁶