动物医学方向课题申报书

动物医学方向课题申报书一、封面内容

动物医学方向课题申报书

项目名称：基于多组学技术的猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机制及免疫逃逸研究

申请人姓名及联系方式：张明，zhangming@

所属单位：XX大学动物医学学院

申报日期：2023年10月26日

项目类别：应用研究

二．项目摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的重大动物疫病，对全球养猪业造成巨大经济损失。本项目旨在系统揭示PRRSV的致病机制及其免疫逃逸的分子基础，为开发新型疫苗和抗病毒策略提供理论依据。项目将采用高通量测序、蛋白质组学和代谢组学等多组学技术，结合生物信息学分析，深入探究PRRSV感染猪体内的宿主免疫应答变化和病毒基因表达调控网络。具体研究内容包括：1）分析PRRSV感染后猪肺泡巨噬细胞和淋巴结中差异表达基因和蛋白质的相互作用网络；2）研究病毒蛋白与宿主细胞因子、趋化因子和免疫检查点分子的相互作用机制；3）通过构建基因编辑猪模型，验证关键免疫逃逸基因的功能及调控途径。预期成果包括鉴定出PRRSV免疫逃逸的关键分子靶点，构建基于多组学数据的病毒致病机制模型，并提出靶向干预策略。本项目的实施将有助于突破PRRSV防控的技术瓶颈，为保障畜牧业健康发展提供重要科学支撑。

三.项目背景与研究意义

猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV）引起的一种高度传染性的动物疫病，属于国家重大动物疫病，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。自1987年首次在美国报道以来，PRRSV已传播至全球多个国家和地区，包括中国。据估计，PRRSV感染导致的直接和间接经济损失每年可达数十亿美元。该病主要表现为怀孕母猪的流产、早产、死胎、木乃伊胎以及仔猪的呼吸困难、生长迟缓等症状，严重影响了养猪业的生产效率和经济效益。

近年来，随着分子生物学、基因组学、蛋白质组学和代谢组学等高通量技术的发展，对PRRSV的致病机制和免疫逃逸机制的研究取得了显著进展。然而，PRRSV的致病机制和免疫逃逸机制仍然存在许多未解之谜，这主要归因于PRRSV的复杂性及其与宿主免疫系统的相互作用。PRRSV是一种单股正链RNA病毒，其基因组编码十种蛋白质，包括五種结构蛋白（GP2、GP3、GP4、GP5和M）和五种非结构蛋白（Nsp1-10）。其中，GP5蛋白是病毒的主要包膜蛋白，具有高度的变异性，是病毒逃逸宿主免疫的关键因素。Nsp2蛋白是病毒复制的关键蛋白，具有丝氨酸蛋白酶活性，能够切割宿主细胞因子前体，抑制宿主免疫应答。此外，PRRSV还能通过干扰宿主细胞的凋亡通路、抑制抗原呈递等机制逃避免疫清除。

尽管目前已有多种PRRSV疫苗上市，但由于PRRSV的高变异性、免疫抑制性和免疫逃逸能力，这些疫苗的效果并不理想。例如，基于灭活病毒的疫苗虽然能够诱导机体产生一定的抗体，但保护力较弱，且易被野毒突破；基于重组病毒的疫苗虽然能够诱导机体产生较强的细胞免疫，但易引起免疫增强作用，导致病情加重。此外，PRRSV还存在多种变异株，如高致病性PRRSV（HP-PRRSV）和低致病性PRRSV（LPRRSV），不同变异株的致病力和免疫原性存在差异，给疫苗的研发和免疫防控带来了更大的挑战。

目前，PRRSV的防控主要依赖于生物安全措施、药物治疗和疫苗免疫。生物安全措施包括严格的检疫制度、隔离消毒、全进全出等，虽然能够有效控制病毒的传播，但成本较高，且难以完全杜绝病毒感染。药物治疗主要使用抗病毒药物，如干扰素、聚肌胞苷酸等，但这些药物的效果有限，且易产生耐药性。疫苗免疫是PRRSV防控的最有效手段，但目前上市的疫苗存在保护力不足、免疫持久性差等问题，亟需研发新型高效疫苗。

因此，深入研究PRRSV的致病机制和免疫逃逸机制，对于开发新型高效疫苗和抗病毒策略具有重要意义。本项目拟采用多组学技术，系统揭示PRRSV感染猪体内的宿主免疫应答变化和病毒基因表达调控网络，为开发新型疫苗和抗病毒策略提供理论依据。

本项目的研究具有重要的社会、经济和学术价值。从社会价值来看，PRRSV是影响养猪业健康发展的重大动物疫病，严重威胁着食品安全和农村经济发展。本项目的研究成果将有助于提高PRRSV的防控水平，保障养猪业的健康发展，促进农业增效、农民增收，维护社会稳定。从经济价值来看，PRRSV每年给全球养猪业造成的经济损失巨大，本项目的研究成果将有助于降低经济损失，提高经济效益，推动畜牧业产业的升级和发展。从学术价值来看，本项目的研究将深入揭示PRRSV的致病机制和免疫逃逸机制，为病毒学、免疫学和畜牧学等领域提供新的理论和方法，推动相关学科的交叉融合和创新性发展。

具体而言，本项目的研究成果将有助于以下几个方面：1）揭示PRRSV的致病机制，为开发抗病毒药物提供理论依据；2）阐明PRRSV的免疫逃逸机制，为开发新型疫苗提供靶点；3）构建基于多组学数据的病毒致病机制模型，为PRRSV的防控提供科学指导；4）推动多组学技术在动物疫病研究中的应用，为其他动物疫病的研究提供借鉴。总之，本项目的研究具有重要的理论意义和应用价值，将为PRRSV的防控和养猪业的健康发展提供重要的科学支撑。

四.国内外研究现状

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）作为全球养猪业面临的最严峻挑战之一，其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的研究一直是动物病毒学和免疫学领域的热点。国内外学者在PRRSV的基因组结构、病毒复制机制、致病性、免疫逃逸机制以及疫苗和防控策略等方面取得了显著进展。

在基因组结构与变异方面，PRRSV的基因组是一个单股正链RNA，长度约12-15kb，编码十种蛋白质。其中，GP5是主要的包膜蛋白，负责病毒与宿主细胞的结合和入侵；Nsp2是最大的非结构蛋白，具有蛋白酶活性，参与病毒复制过程。国内外研究已揭示了PRRSV基因组的整体结构及其各基因的功能。值得注意的是，PRRSV具有高度变异性，其基因组，特别是GP5基因，存在大量的重组和突变事件，导致不同地区和不同时间的病毒株存在显著差异。这种高度变异性是PRRSV难以防控的主要原因之一。国内外学者通过测序和基因分析，对PRRSV的遗传进化关系进行了深入研究，构建了病毒进化树，揭示了病毒传播和变异的规律。然而，关于PRRSV变异的分子机制、变异株的致病性差异以及变异对免疫逃逸的影响等方面，仍存在许多未解之谜。

在病毒复制机制方面，PRRSV的复制过程涉及宿主细胞的多个信号通路和分子机器。国内外研究已初步揭示了PRRSV复制的关键步骤，包括病毒入胞、基因组RNA解旋、负链RNA合成、包膜等。研究表明，PRRSV病毒粒子通过其包膜蛋白与宿主细胞受体结合，进入细胞内部。进入细胞后，病毒基因组RNA被释放，并利用宿主细胞的RNA聚合酶II合成病毒负链RNA，随后负链RNA作为模板合成正链RNA，用于病毒粒子的组装和释放。在这个过程中，PRRSV能够劫持宿主细胞的信号通路，如Toll样受体（TLR）通路、干扰素通路等，调节宿主细胞的生物学过程，为病毒的复制和逃避免疫清除创造有利条件。然而，PRRSV复制过程的精细机制，特别是病毒与宿主细胞的相互作用机制，以及病毒如何劫持宿主细胞信号通路以利于自身复制等方面，仍需深入研究。

在致病机制方面，PRRSV感染能够引起猪的繁殖障碍和呼吸系统疾病，其致病机制涉及免疫抑制、细胞凋亡、血管损伤等多个方面。国内外研究已揭示了PRRSV感染后猪体内的病理变化和免疫应答特征。研究表明，PRRSV感染能够引起巨噬细胞活化、细胞因子风暴、淋巴细胞减少等免疫病理反应，导致猪的免疫抑制状态。此外，PRRSV感染还能够诱导宿主细胞的凋亡，破坏组织的结构和功能。研究表明，PRRSV的Nsp2蛋白能够抑制宿主细胞的凋亡通路，为病毒的复制和扩散创造有利条件。然而，PRRSV致病的具体机制，特别是不同变异株的致病性差异，以及病毒如何与宿主细胞的凋亡通路相互作用等方面，仍需深入研究。

在免疫逃逸机制方面，PRRSV具有强大的免疫逃逸能力，这是导致PRRSV难以防控的另一个重要原因。国内外研究已揭示了PRRSV免疫逃逸的多种机制，包括病毒蛋白的修饰、病毒基因的表达调控、病毒与宿主免疫细胞的相互作用等。研究表明，PRRSV的GP5蛋白能够通过多种机制逃避免疫清除，例如，GP5蛋白能够抑制MHC-I类分子途径的抗原呈递，干扰CD8+T细胞的杀伤功能；GP5蛋白还能够与宿主细胞表面的TLR受体结合，抑制宿主免疫应答。此外，PRRSV的Nsp2蛋白也能够通过多种机制逃避免疫清除，例如，Nsp2蛋白能够抑制宿主细胞的凋亡通路，为病毒的复制和扩散创造有利条件。然而，PRRSV免疫逃逸的精细机制，特别是不同变异株的免疫逃逸能力差异，以及病毒如何与宿主免疫细胞的相互作用等方面，仍需深入研究。

在疫苗研发方面，国内外学者已研发出多种PRRSV疫苗，包括灭活疫苗、重组疫苗、核酸疫苗等。然而，这些疫苗的保护效果并不理想，存在保护力不足、免疫持久性差等问题。灭活疫苗虽然安全性高，但保护力较弱，易被野毒突破；重组疫苗虽然能够诱导机体产生较强的细胞免疫，但易引起免疫增强作用，导致病情加重；核酸疫苗虽然具有广阔的应用前景，但目前在猪体内的应用效果仍需进一步验证。因此，研发新型高效PRRSV疫苗仍是当前研究的热点之一。国内外学者正在探索多种新型疫苗技术，如病毒样颗粒疫苗、嵌合病毒疫苗、mRNA疫苗等，以期研发出保护效果更好、免疫持久性更强的PRRSV疫苗。

在防控策略方面，PRRSV的防控主要依赖于生物安全措施、药物治疗和疫苗免疫。生物安全措施包括严格的检疫制度、隔离消毒、全进全出等，虽然能够有效控制病毒的传播，但成本较高，且难以完全杜绝病毒感染。药物治疗主要使用抗病毒药物，如干扰素、聚肌胞苷酸等，但这些药物的效果有限，且易产生耐药性。疫苗免疫是PRRSV防控的最有效手段，但目前上市的疫苗存在保护力不足、免疫持久性差等问题，亟需研发新型高效疫苗。因此，制定科学合理的PRRSV防控策略，需要综合考虑生物安全措施、药物治疗和疫苗免疫等多种手段，并结合当地的具体情况，采取综合防控措施。

综上所述，国内外在PRRSV研究领域取得了显著进展，但仍存在许多未解之谜和研究空白。特别是在PRRSV的致病机制、免疫逃逸机制、新型疫苗研发以及综合防控策略等方面，仍需深入研究。本项目拟采用多组学技术，系统揭示PRRSV感染猪体内的宿主免疫应答变化和病毒基因表达调控网络，为开发新型疫苗和抗病毒策略提供理论依据，填补国内外在该领域的空白，推动PRRSV防控技术的进步和养猪业的健康发展。

五.研究目标与内容

本项目旨在通过系统性的多组学分析，深入解析猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的致病机制及其免疫逃逸策略，为开发新型高效疫苗和抗病毒药物提供坚实的理论基础和潜在的分子靶点。基于此，项目设定以下研究目标：

1.全面解析PRRSV感染猪体内的宿主分子响应网络，明确关键免疫分子和信号通路在PRRSV致病过程中的作用。

2.阐明PRRSV关键蛋白（特别是GP5和Nsp2）介导的免疫逃逸机制，鉴定病毒逃避免疫清除的关键分子靶点。

3.构建PRRSV致病机制和多组学数据的整合模型，预测并验证潜在的抗病毒干预靶点和免疫逃逸减弱位点。

4.基于研究结果，提出针对PRRSV新型疫苗设计和综合防控策略的科学建议。

为实现上述研究目标，本项目将开展以下详细研究内容：

1.**PRRSV感染相关组织样本的采集与多组学测序**

***研究问题：**PRRSV感染后，猪肺、淋巴结、脾脏等关键组织中的宿主基因、蛋白质和代谢物如何变化？这些变化如何共同调控PRRSV的致病过程？

***研究内容：**选取PRRSV感染模型猪（包括不同感染阶段、不同病变程度），采集肺、淋巴结、脾脏等代表性组织样本。利用高通量RNA测序（RNA-Seq）技术分析组织样本中的转录组变化，筛选差异表达基因（DEGs）；利用蛋白质组学技术（如LC-MS/MS）分析组织样本中的蛋白质表达变化，筛选差异表达蛋白质（DEPs）；利用代谢组学技术（如LC-MS或GC-MS）分析组织样本中的小分子代谢物变化，筛选差异表达代谢物（DEMs）。通过整合分析转录组、蛋白质组和代谢组数据，构建PRRSV感染相关的“组学”互作网络，初步揭示宿主分子层面的响应机制。

***假设：**PRRSV感染将引发宿主免疫系统（特别是巨噬细胞和淋巴细胞）和细胞因子网络的显著重塑，并伴随着特定的代谢重编程，这些变化是病毒致病和免疫逃逸的关键驱动因素。

2.**PRRSV病毒组学与变异分析**

***研究问题：**感染过程中PRRSV的基因组、转录组和蛋白质组是否存在动态变化和变异？这些变异如何影响病毒的致病性和免疫逃逸能力？

***研究内容：**对同一批感染猪在不同时间点采集的血液或组织样本进行病毒RNA测序（viralRNA-Seq），分析PRRSV的基因组序列变异、重组事件以及转录本异质性。结合蛋白质组学数据，分析病毒包膜蛋白（特别是GP5）的翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）变化，及其与宿主蛋白的相互作用。利用生物信息学方法，构建病毒进化树，分析不同变异株的传播和致病性关系。

***假设：**PRRSV在感染过程中会发生适应性进化，产生新的基因或蛋白变异，这些变异可能赋予病毒更强的传播能力或免疫逃逸能力，从而影响疾病的严重程度和疫苗的保护效果。

3.**宿主免疫应答与病毒逃逸机制研究**

***研究问题：**PRRSV如何抑制或操纵宿主的免疫应答？哪些病毒蛋白是关键的免疫逃逸因子？宿主免疫evasion相关的分子机制是什么？

***研究内容：**聚焦于差异表达基因和蛋白质中与免疫应答相关的分子（如细胞因子、趋化因子、免疫检查点分子、MHC分子等），深入分析PRRSV感染对其表达和功能的影响。利用免疫共沉淀、表面等离子共振等技术，研究PRRSV病毒蛋白（特别是GP5和Nsp2）与宿主免疫蛋白（如Toll样受体、细胞因子受体、MHC分子、PD-1/PD-L1等）的相互作用。通过基因敲除或过表达实验（如在细胞模型或基因编辑猪模型中），验证关键相互作用的功能，阐明病毒逃逸免疫应答的分子机制。

***假设：**PRRSV主要通过抑制细胞介导的免疫（特别是CD8+T细胞应答）和干扰抗原呈递途径，以及利用病毒蛋白与宿主免疫检查点分子的相互作用来实现免疫逃逸。

4.**多组学数据整合与模型构建**

***研究问题：**如何整合多组学数据，构建PRRSV致病机制和免疫逃逸的系统性模型？哪些因素对疾病的严重程度和outcome最具预测价值？

***研究内容：**利用生物信息学方法，如加权基因共表达网络分析（WGCNA）、蛋白质-蛋白质相互作用网络分析（PPI）、代谢通路分析等，对多组学数据进行整合分析与通路富集。基于整合分析结果，构建PRRSV致病机制的网络模型，揭示宿主-病毒相互作用的复杂关系。利用机器学习等方法，筛选与疾病严重程度、免疫状态或病毒载量相关的关键分子标志物，构建预测模型。

***假设：**整合多组学数据能够揭示PRRSV致病和免疫逃逸的复杂网络机制，并识别出具有潜在应用价值的生物标志物和干预靶点。

5.**潜在干预靶点验证与策略探讨**

***研究问题：**基于上述研究发现的潜在干预靶点，如何设计有效的抗病毒策略或新型疫苗？

***研究内容：**基于网络分析和功能验证结果，筛选出具有重要致病或逃逸功能的关键病毒蛋白或宿主分子作为潜在的抗病毒药物靶点或新型疫苗设计靶点。结合文献报道和现有技术，探讨基于这些靶点的抗病毒药物研发思路（如小分子抑制剂、肽类药物）或新型疫苗设计策略（如靶向免疫逃逸位点的亚单位疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗等），并从理论上评估其可行性和预期效果。

***假设：**通过靶向关键的致病或逃逸通路中的分子，可以开发出有效的抗病毒干预措施；针对病毒免疫逃逸位点的疫苗设计有望获得更广谱、更持久的保护力。

六.研究方法与技术路线

本项目将采用多学科交叉的研究方法，结合现代生物技术，系统解析PRRSV的致病机制与免疫逃逸策略。研究方法与技术路线具体如下：

1.**研究方法**

1.1**动物模型建立与样本采集**

***方法：**选取健康、遗传背景一致、血清学阴性仔猪，随机分为感染组和对照组。采用标准感染程序（如鼻内接种）感染PRRSV（选用代表性毒株，如高致病性或地方流行性毒株），在感染后不同时间点（如0,3,7,14,21,28天）安乐处死动物，采集肺、肺门淋巴结、腹股沟淋巴结、脾脏、血浆等样本。设立健康未感染猪作为阴性对照。

***设计：**采用时间梯度设计，涵盖病毒感染早期、中期和晚期，以及恢复期，以捕捉动态变化的分子事件。每组样本量不少于6头，确保统计分析的可靠性。

***数据收集：**记录动物的体重、体温、临床症状（如发热、呼吸困难、食欲不振），进行血液学指标（如白细胞计数、淋巴细胞分类）和病原学检测（如PCR检测病毒载量），结合组织病理学观察（H&E染色观察肺、淋巴结等器官病变），综合评估病毒的致病过程。

1.2**多组学测序与分析**

***RNA组学（RNA-Seq）：**

***方法：**提取肺、淋巴结、脾脏等组织样本的总RNA，进行质量检测后，采用转录组测序技术（如IlluminaHiSeq平台）进行高通量测序。对测序数据进行质量过滤、去除宿主转录本、基因表达定量等生物信息学处理。

***分析：**使用DESeq2或edgeR等软件进行差异表达基因（DEGs）分析，筛选PRRSV感染相关的上调或下调基因。利用GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，功能注释DEGs，揭示感染过程中关键生物学过程和通路的变化。构建组织特异性表达模式图，分析免疫相关基因的表达格局。

***蛋白质组学（LC-MS/MS）：**

***方法：**对肺、淋巴结、脾脏等组织样本进行蛋白质提取、酶解、肽段分离（如液相色谱）和质谱联用分析。利用蛋白质数据库（如UniProt）进行肽段和蛋白质鉴定，进行蛋白质表达量定量（如iBAQ或Label-freequantification）。

***分析：**筛选差异表达蛋白质（DEPs），进行GO和KEGG通路富集分析，功能注释DEPs。利用蛋白质相互作用数据库（如STRING）和PPI网络分析软件（如Cytoscape），构建蛋白质互作网络，揭示蛋白质层面的调控机制。利用蛋白质鉴定结果，结合文献或数据库信息，预测和分析病毒蛋白的翻译后修饰（PTMs）。

***代谢组学（LC-MS/GC-MS）：**

***方法：**对肺、淋巴结、脾脏等组织样本或血浆样本进行小分子代谢物提取。根据代谢物极性，选择合适的色谱分离技术（液相色谱或气相色谱）与质谱检测器（如LC-MS/MS或GC-MS）进行检测。利用代谢物数据库（如HMDB、KEGGMetabolomeDatabase）进行代谢物鉴定。

***分析：**筛选差异表达代谢物（DEMs），进行KEGG代谢通路富集分析，揭示感染过程中代谢网络的变化。结合蛋白质组学和转录组学数据，探索代谢物与蛋白质、基因表达的关联，构建代谢-蛋白质-基因相互作用网络。

1.3**病毒组学与变异分析**

***方法：**提取感染猪血浆或组织样本中的病毒RNA，进行高通量测序（viralRNA-Seq）。对测序数据进行病毒序列拼接、组装和变异分析，鉴定SNPs（单核苷酸多态性）、indels（插入缺失）等变异位点。利用RDP（RecombinationDetectionProgram）等工具分析病毒重组事件。

***分析：**构建病毒进化树，分析不同时间点、不同组织或不同个体间病毒株的遗传关系和进化趋势。结合蛋白质组学数据，分析关键包膜蛋白（如GP5）的变异与其表达量和潜在功能的关系。

1.4**宿主-病毒相互作用与免疫逃逸机制研究**

***方法：**

***蛋白质互作验证：**利用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（Co-IP-MS）或WesternBlot，验证RNA-Seq和蛋白质组学提示的宿主蛋白与病毒蛋白的相互作用。

***功能验证：**在适合的细胞模型（如猪原代巨噬细胞、肺泡巨噬细胞系）或基因编辑猪模型中，采用基因敲除（CRISPR/Cas9）、过表达、干扰（siRNA/miRNA）等技术，研究关键互作蛋白或病毒蛋白功能。

***免疫检查点相互作用分析：**利用生物信息学预测和实验验证（如表面等离子共振、pull-down实验）PRRSV蛋白（特别是GP5、Nsp2）与宿主免疫检查点分子（如PD-1、PD-L1、CTLA-4）的相互作用。

***信号通路分析：**结合RNA-Seq、蛋白质组学数据及磷酸化蛋白质组学（如果条件允许），分析PRRSV感染激活或抑制的宿主信号通路，特别是与免疫应答相关的通路。

***分析：**通过上述实验，明确PRRSV逃避免疫清除的关键分子机制，如抑制MHC-I途径、干扰T细胞功能、劫持免疫检查点等。

1.5**多组学数据整合与模型构建**

***方法：**利用生物信息学工具和软件（如WGCNA、PPINetworkAnalysis、Cytoscape、MetaboAnalyst），整合转录组、蛋白质组、代谢组数据。构建宿主-病毒相互作用网络，识别核心调控节点和关键通路。利用机器学习算法（如随机森林、支持向量机），基于多组学特征，训练预测模型，以预测疾病严重程度或病毒载量。

***分析：**发掘多组学数据中隐藏的关联关系，构建PRRSV致病和免疫逃逸的系统性数学模型或网络模型，为理解复杂生物学过程提供框架。

2.**技术路线**

本研究的技术路线遵循“样本采集->多组学测序->数据质控与分析->机制探究->整合建模->策略探讨”的流程，具体步骤如下：

***第一步：动物模型建立与样本采集（第1-3个月）**

*采购、隔离、检测健康仔猪，建立实验动物设施。

*按照实验设计感染PRRSV，设置不同时间点。

*观察记录临床指标，规范采集肺、淋巴结、脾脏、血浆等样本，-80°C冻存备用。进行病毒载量检测和病理学评估。

***第二步：多组学样本制备与测序（第2-6个月）**

*提取各组织样本的总RNA、总蛋白质和小分子代谢物。

*进行RNA质检、纯化，构建测序文库，进行RNA-Seq测序。

*进行蛋白质提取、酶解、肽段纯化，进行LC-MS/MS分析。

*进行代谢物提取、色谱分离，进行LC-MS或GC-MS分析。

*（可选）提取血浆病毒RNA，进行viralRNA-Seq。

***第三步：多组学原始数据处理与差异分析（第4-9个月）**

*对RNA-Seq数据进行分析，进行质量控制和标准化，进行DEGs筛选和通路富集。

*对蛋白质组学数据进行分析，进行蛋白质鉴定和定量，进行DEPs筛选、PPI网络构建和功能富集。

*对代谢组学数据进行分析，进行代谢物鉴定和定量，进行DEM筛选和代谢通路富集。

*对病毒组学数据进行序列拼接、组装和变异分析。

***第四步：关键机制实验验证（第7-15个月）**

*基于多组学分析结果，筛选关键DEGs、DEPs、DEM和病毒变异位点。

*在细胞模型或动物模型中，进行Co-IP、基因功能干预、免疫互作验证等实验，深入探究PRRSV致病和免疫逃逸的关键机制。

***第五步：多组学数据整合与模型构建（第10-12个月）**

*整合转录组、蛋白质组、代谢组数据，构建宿主-病毒相互作用网络。

*利用WGCNA、PPI分析等工具，识别核心节点和关键通路。

*构建疾病预测模型，并进行验证。

***第六步：结果整理与策略探讨（第13-18个月）**

*系统整理所有研究结果，撰写研究论文。

*基于研究发现，探讨开发新型抗病毒药物和疫苗的策略。

*完成项目总结报告。

***关键质量控制点：**在每个关键步骤（如样本采集、RNA提取、蛋白质提取、测序）设立质控标准，确保数据质量。在数据分析阶段，采用多种方法和工具进行验证，确保结果的可靠性。

七．创新点

本项目拟采用多组学“组学组学”（Omics-by-Omics）整合策略，系统解析猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）的致病机制与免疫逃逸策略，在理论、方法和应用层面均具有显著的创新性。

1.**理论创新：揭示PRRSV感染诱导的宿主系统级分子网络重构与动态演变**

传统的PRRSV研究多聚焦于单一组学（如转录组或蛋白质组）或特定信号通路，难以全面展现病毒感染引发的复杂且动态的宿主分子响应。本项目首次将转录组学、蛋白质组学和代谢组学相结合，对PRRSV感染猪的关键组织进行系统性的“组学组学”分析。这种整合策略能够超越单一组学数据的局限，捕捉基因表达、蛋白质翻译与修饰、以及代谢物水平之间的协同调控和相互作用，从而揭示PRRSV感染诱导的宿主系统级分子网络的重构过程及其动态演变规律。通过构建宿主-病毒-环境相互作用网络，本项目有望更深入地理解PRRSV如何系统性地破坏宿主生理稳态，导致繁殖障碍和呼吸系统疾病，为认识病毒致病的新机制提供理论基础。

2.**方法创新：建立基于多组学数据的PRRSV致病机制整合分析框架**

本项目将开发并应用一套系统性的多组学数据整合分析框架。首先，利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）等无监督学习方法，识别PRRSV感染相关的宿主功能模块及其与病毒感染状态的相关性。其次，通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析和代谢通路富集分析，将转录组、蛋白质组和代谢组数据关联起来，构建病毒感染调控的分子机制网络。再次，利用生物信息学工具和机器学习方法，整合多组学特征，构建预测模型，以量化评估关键分子对疾病进展或病毒载量的影响。这种多维度、多层次的数据整合与网络建模方法，是当前PRRSV研究中较少系统应用的策略，能够更全面、更系统地解析病毒与宿主复杂的相互作用机制，为复杂疫病的研究提供了新的技术范式。

3.**技术整合创新：结合病毒组学与“组学组学”，解析PRRSV变异与免疫逃逸的分子基础**

本项目不仅关注宿主反应，还将病毒组学分析（viralRNA-Seq）与“组学组学”紧密结合。通过高通量测序解析PRRSV在感染过程中的基因组、转录组和蛋白质组变异，结合免疫组学和蛋白质互作分析，精确追踪病毒关键变异位点（特别是包膜蛋白GP5）的功能变化，并阐明其逃避免疫清除的具体分子机制（如影响抗原呈递、干扰T细胞功能、劫持免疫检查点等）。这种将病毒变异动态监测与宿主免疫应答多层次分析相结合的技术路线，能够更精细地揭示病毒适应性进化与宿主免疫互作的关系，为理解疫苗失效和病毒持续传播的机制提供关键证据。

4.**应用创新：发掘新型抗病毒干预靶点和精准疫苗设计策略**

基于上述理论和方法创新，本项目旨在发掘具有潜在应用价值的抗病毒干预靶点和新型疫苗设计靶点。通过多组学整合网络分析，本项目能够识别在病毒致病和免疫逃逸中起关键作用的宿主分子（如过度激活的激酶、异常表达的免疫抑制因子）或病毒分子（如功能关键的变异位点），这些即为抗病毒药物研发的候选靶点。同时，针对病毒免疫逃逸机制的研究结果，可以直接指导新型疫苗的设计，例如，针对保守的、关键的免疫逃逸位点设计亚单位疫苗、核酸疫苗或改造现有疫苗株，以增强疫苗的免疫原性和保护力，降低免疫逃逸风险。本项目的研究成果将为开发更有效、更持久的PRRSV防控策略提供重要的科学依据和实践指导，具有重要的社会经济价值。

综上所述，本项目通过多组学“组学组学”整合策略，不仅致力于在理论上深化对PRRSV致病与免疫逃逸机制的理解，更在方法学上进行了创新性探索，最终目标是发掘出具有实际应用价值的新型防控策略，为有效应对PRRSV这一重大动物疫病挑战提供强有力的科技支撑。

八．预期成果

本项目基于多组学整合分析策略，针对猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）的致病机制与免疫逃逸策略深入研究，预期在理论层面取得突破性进展，并产生显著的应用价值。具体预期成果如下：

1.**理论成果**

1.1揭示PRRSV感染诱导的宿主系统级分子响应网络

本项目预期通过整合转录组、蛋白质组和代谢组数据，构建PRRSV感染猪肺、淋巴结、脾脏等关键组织的系统级分子响应网络。预期将阐明病毒感染如何引发宿主基因表达、蛋白质翻译与修饰、以及代谢物谱的全面重塑，识别出受病毒调控的核心功能模块和关键信号通路（如炎症反应、细胞凋亡、抗原呈递、免疫抑制等）。预期将揭示PRRSV不仅引起局部组织的病理损伤，更通过系统性地干扰宿主免疫稳态和生理功能，导致全身性的免疫抑制和代谢紊乱，为理解病毒疫病的系统致病机制提供新的理论视角。

1.2阐明PRRSV关键免疫逃逸机制及分子靶点

基于病毒组学分析、免疫组学和蛋白质互作研究，本项目预期将深入解析PRRSV逃避免疫清除的关键分子机制。预期将明确PRRSV病毒蛋白（特别是GP5和Nsp2）如何通过抑制MHC-I类分子途径的抗原呈递、干扰CD8+T细胞应答、劫持PD-1/PD-L1等免疫检查点分子、以及激活免疫抑制性细胞因子（如IL-10、TGF-β）等多种策略实现免疫逃逸。预期将鉴定出病毒逃逸的关键分子靶点和受其调控的关键宿主免疫分子，为理解病毒与宿主免疫系统的复杂互作提供了新的理论认识。

1.3建立PRRSV致病机制的多组学整合模型

本项目预期将整合多组学数据，利用网络分析和机器学习等方法，构建PRRSV致病机制的系统模型。预期该模型能够定量描述病毒感染过程中基因-蛋白质-代谢之间的相互作用，量化评估关键分子对疾病进展或病毒载量的影响，并预测潜在的干预靶点。预期该模型的建立将为复杂疫病的研究提供新的分析框架，加深对PRRSV致病复杂性的系统性认识。

2.**实践应用价值**

2.1发现新型抗病毒药物研发靶点

通过系统性的“组学组学”分析和网络挖掘，本项目预期将发现一批在PRRSV致病和免疫逃逸中发挥关键作用的宿主分子（如过度激活的激酶、异常表达的免疫调节因子）或病毒分子。其中一部分可能成为开发新型小分子抑制剂、肽类药物或基因治疗药物的候选靶点。例如，针对病毒Nsp2蛋白酶或其宿主相互作用位点设计的抑制剂，有望干扰病毒的复制过程。针对宿主免疫抑制分子的靶向药物，有望打破病毒的免疫逃逸，恢复有效的免疫应答。这些靶点的发现将为抗PRRSV药物的研发提供新的方向和靶标。

2.2指导新型疫苗设计与优化

本项目对PRRSV免疫逃逸机制的研究将直接指导新型高效疫苗的设计。预期将鉴定出病毒中保守的、关键的免疫逃逸位点，这些位点可以作为新型亚单位疫苗或核酸疫苗的抗原设计靶点，以期诱导产生更能有效清除病毒、不易被逃逸的免疫应答。同时，通过对病毒变异株的系统分析，可以为疫苗株的筛选和优化提供依据，开发出具有更广谱保护力、更能抵抗变异株挑战的疫苗。此外，对宿主免疫应答机制的研究，也可能为优化疫苗佐剂、免疫程序提供新的思路。

2.3提升PRRSV防控的科学性和精准性

本项目的研究成果将有助于更深入地理解PRRSV的致病规律和免疫逃逸机制，为制定更科学、更精准的防控策略提供理论依据。例如，基于对病毒变异和宿主免疫状态的认识，可以更准确地评估不同地区的疫病风险，指导疫苗接种策略的选择和优化。对关键传播途径和易感环节的认识，有助于完善生物安全防控措施。此外，本项目发现的生物标志物，可能有助于早期诊断、疾病监测和预后评估，为临床防控提供实用工具。

2.4产生高水平研究成果和人才培养

本项目预期将发表系列高水平研究论文（包括SCI期刊论文），申请相关发明专利（如新型疫苗或药物靶点）。项目实施过程中，将培养一批掌握多组学技术和疫病研究方法的青年科研人员，为动物医学领域的发展储备人才。

综上所述，本项目预期在PRRSV致病机制的理论认识上取得显著突破，并产生重要的实践应用价值，为开发新型抗病毒药物和疫苗、提升PRRSV防控水平提供强有力的科学支撑，对保障我国乃至全球养猪业健康发展具有深远意义。

九.项目实施计划

本项目实施周期为三年，共分为六个阶段，具体时间规划、任务分配和进度安排如下：

**第一阶段：准备与基础工作阶段（第1-3个月）**

***任务分配：**申请人团队负责项目方案的细化与完善；实验室人员负责实验动物模型（仔猪）的准备、采购与健康检测；技术平台人员负责多组学测序技术和生物信息学分析流程的确认与准备；合作单位（如有）负责协调资源与配合。

***进度安排：**第1个月，完成最终实验方案确认，采购并隔离健康仔猪，建立实验动物设施，启动样本采集所需试剂和耗材的准备。第2个月，完成仔猪的健康检测和分组，进行病毒感染实验，同步采集基础样本（对照组），开始RNA、蛋白质和代谢物样本的标准化采集流程。第3个月，完成首批感染样本的采集，进行病毒载量监测和初步病理评估，启动所有样本的质控和部分样本的初步处理工作。

**第二阶段：多组学数据生成阶段（第4-15个月）**

***任务分配：**实验室人员负责按照标准化流程完成所有样本的总RNA、总蛋白质和小分子代谢物的提取、纯化和质控。技术平台人员负责构建测序文库，进行RNA-Seq、蛋白质组学（LC-MS/MS）和代谢组学（LC-MS/GC-MS）的测序。合作单位（如有）负责提供技术支持或共享数据资源。

***进度安排：**第4-6个月，完成全部样本的RNA提取、质检和测序文库构建，进行RNA-Seq测序。第7-9个月，完成全部样本的蛋白质提取、酶解和LC-MS/MS分析。第10-12个月，完成所有样本的代谢物提取、色谱分离和MS检测，进行数据预处理。第13-15个月，对初步获得的原始数据进行严格的质控和格式化处理，确保数据质量满足后续分析要求。

**第三阶段：多组学数据整合与分析阶段（第16-30个月）**

***任务分配：**生物信息学团队负责对RNA-Seq、蛋白质组学和代谢组学数据进行详细的生物信息学分析，包括序列比对、基因/蛋白质鉴定、定量、差异分析、通路富集、网络构建等。病毒学团队负责病毒组学数据的分析，包括基因组组装、变异检测、重组分析等。免疫学团队负责宿主-病毒相互作用和免疫逃逸机制的分析。

***进度安排：**第16-20个月，完成RNA-Seq数据的差异表达基因分析、GO和KEGG富集分析，以及WGCNA模块识别。第21-24个月，完成蛋白质组学数据的差异表达蛋白质分析、PPI网络构建和功能注释。第25-27个月，完成代谢组学数据的差异表达代谢物分析、代谢通路富集和代谢网络构建。第28-30个月，进行病毒组学数据的变异和进化分析，整合多组学数据，进行“组学组学”关联分析和网络构建，利用机器学习等方法构建预测模型。

**第四阶段：关键机制实验验证阶段（第24-42个月）**

***任务分配：**实验室人员负责在细胞模型（猪原代巨噬细胞、系细胞）或基因编辑猪模型中，开展基因敲除、过表达、干扰等实验，验证多组学分析预测的关键分子功能和相互作用。技术平台人员负责提供实验所需的细胞培养、分子生物学技术支持。合作单位（如有）负责提供基因编辑猪模型或相关技术支持。

***进度安排：**第24-27个月，根据多组学分析结果，设计和优化细胞实验方案，进行关键蛋白相互作用验证（Co-IP等）和功能干预实验（基因敲除/过表达）。第28-36个月，系统开展细胞实验，收集数据并进行初步分析。第37-42个月，根据细胞实验结果，优化动物模型实验方案（如基因编辑猪模型），开展功能验证实验，并进行数据整理和分析。

**第五阶段：成果总结与论文撰写阶段（第40-48个月）**

***任务分配：**项目团队负责整合所有研究数据和结果，进行系统性总结。申请人负责指导论文撰写，组织学术交流和成果推广。相关人员负责整理项目报告和结题材料。

***进度安排：**第40-43个月，完成所有实验数据的最终整理和分析，撰写核心研究论文初稿。第44-46个月，修改完善论文，投稿至目标期刊。第47-48个月，完成项目总结报告的撰写，整理项目成果（论文、专利等），准备项目结题验收。

**第六阶段：项目验收与成果推广阶段（第49-52个月）**

***任务分配：**项目团队负责根据验收要求准备相关材料，配合进行项目验收。申请人负责进行成果推广和转化应用的初步探索。

***进度安排：**第49-50个月，根据项目任务书要求，整理并提交项目验收材料。第51-52个月，进行项目成果的内部评审和修改，参与学术会议进行成果交流，探讨后续研究计划和成果转化可能性。

**风险管理策略**

1.**技术风险及应对策略：**本项目涉及多组学高通量技术和复杂的生物信息学分析，存在技术路线不成熟、数据质量不高、分析结果解释困难等风险。应对策略包括：选择经验丰富的技术团队承担多组学样本制备和分析任务，建立严格的质量控制标准；采用多种生物信息学工具和数据库进行数据验证和分析，提高结果的可重复性和可靠性；加强团队内部的技术培训和交流，提升实验操作和数据分析能力。

2.**动物模型风险及应对策略：**PRRSV感染动物模型的建立和维持存在病毒变异、免疫抑制导致的模型差异、伦理审批等风险。应对策略包括：选择遗传背景一致、易感性高的实验动物，优化病毒感染剂量和途径，严格控制实验条件，减少模型变异。严格遵守动物福利和伦理规范，在符合伦理委员会要求的前提下进行实验操作，定期进行动物福利评估。

3.**资金风险及应对策略：**项目执行过程中可能面临资金不足或使用效率不高等风险。应对策略包括：制定详细的项目预算，合理规划资金使用，加强成本控制。定期进行项目经费使用的监督和评估，确保资金使用的规范性和有效性。积极拓展多元化funding渠道，降低对单一资金来源的依赖。

4.**合作风险及应对策略：**项目涉及多学科交叉，可能存在团队协作不畅、资源共享困难等风险。应对策略包括：建立明确的合作机制和沟通平台，定期召开项目例会，协调各成员工作，确保信息共享和协同推进。明确各成员的责权利，制定合理的利益分配方案，激发团队成员的积极性和创造性。

5.**知识产权风险及应对策略：**项目研究成果可能面临知识产权保护不足或侵权风险。应对策略包括：在项目早期阶段就制定知识产权保护策略，对关键研究成果进行专利布局。加强知识产权相关知识培训，提高团队的知识产权保护意识。与相关机构合作，为项目成果提供法律保障。

6.**成果转化风险及应对策略：**项目研究成果可能存在转化应用难度大、市场接受度低等风险。应对策略包括：深入调研市场需求，加强与企业合作，推动成果的产业化进程。开展成果转化培训，提高团队的成果转化能力。积极搭建成果转化平台，促进研究成果与产业界的对接。

十.项目团队

本项目团队由来自国内动物医学领域的知名专家和青年骨干组成，团队成员在猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原学、免疫学和防控技术等方面具有丰富的科研经验和深厚的学术造诣。团队成员涵盖病毒学、免疫学、生物信息学、病理学、分子生物学等多个学科方向，形成了优势互补、结构合理的科研团队。

1.**团队成员的专业背景与研究经验**

***项目负责人（张明）：**博士研究生导师，猪繁殖与呼吸综合征病毒学专家。先后在国内外知名研究机构从事PRRSV研究工作，主持多项国家级和省部级科研项目。在PRRSV的致病机制、免疫逃逸策略以及新型疫苗研发等方面取得了系列创新性成果，发表高水平研究论文20余篇，其中在《Virology》、《PLOSPathogens》等国际顶级期刊发表论文10余篇。具有丰富的项目管理经验和团队领导能力，擅长多学科交叉研究，致力于将基础研究成果转化为实际应用，为PRRS防控提供科学依据和技术支撑。

***副研究员（李红）：**病毒学专家，专注于PRRSV的分子免疫学和疫苗研发。在PRRSV病毒蛋白功能、病毒-宿主相互作用以及疫苗免疫机制等方面具有深入的研究积累，主持多项省部级科研项目，在国内外核心期刊发表论文15篇，其中SCI论文8篇。熟练掌握分子生物学、细胞生物学、免疫学等实验技术，具有丰富的实验操作经验和项目管理能力。

***研究员（王强）：**生物信息学专家，擅长多组学数据分析、网络药理学和系统生物学研究。在PRRSV感染诱导的宿主分子响应网络构建、病毒致病机制整合分析以及药物靶点预测等方面具有丰富的经验，参与多项大型基因组学和蛋白质组学项目，发表相关研究论文10余篇，其中SCI论文5篇。精通各类生物信息学分析软件和数据库，能够高效处理和分析大规模生物数据，为项目提供强大的数据分析和解读能力。

***副教授（赵敏）：**免疫学专家，专注于病毒感染免疫和免疫逃逸机制研究。在PRRSV感染诱导的免疫应答和疫苗免疫机制等方面具有深入的研究积累，主持多项国家自然科学基金项目，在国内外核心期刊发表论文12篇，其中SCI论文6篇。熟练掌握免疫学实验技术，如流式细胞术、ELISA、WesternBlot等，在免疫细胞分选、细胞功能分析等方面具有丰富的经验。

***青年骨干（陈伟）：**分子生物学专家，专注于PRRSV基因编辑和功能基因组学研究。在PRRSV基因组结构、病毒复制机制以及基因功能分析等方面具有深入研究，参与多项PRRSV基础研究项目，发表相关研究论文8篇，其中SCI论文3篇。熟练掌握分子生物学、细胞生物学、基因编辑等实验技术，具有丰富的实验操作经验和项目管理能力。

2.**团队成员的角色分配与合作模式**

***项目负责人（张明）：**负责项目整体规划、协调团队工作、整合项目资源，主持关键实验方案的设计和实施，以及核心研究成果的总结和论文撰写。同时，负责项目的对外合作与交流，推动研究成果的转化应用，为项目争取后续研究经费。