大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的探索与解析

大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的探索与解析一、引言1.1研究背景与意义大麦（Hordeumvulgare）作为全球重要的粮食和饲料作物，在农业生产中占据着关键地位。它不仅是啤酒酿造的主要原料，还为畜牧业提供了优质的饲料来源。然而，大麦的生长常常受到多种病害的威胁，其中白粉病是由布氏白粉菌大麦专化型（Blumeriagraminisf.sp.hordei，Bgh）引起的一种极具破坏力的真菌病害。白粉病在全球大麦种植区域广泛分布，一旦爆发，会严重影响大麦的光合作用，导致叶片早衰、麦粒瘪小，进而显著降低大麦的产量和品质，给农业生产带来巨大的经济损失。据相关研究统计，在病害流行年份，大麦因白粉病的侵害，产量损失可达20%-40%，甚至在某些严重的情况下，损失比例可能更高。大麦与白粉菌之间的相互作用是一个复杂而动态的过程，涉及到寄主植物和病原菌之间的基因表达调控、信号传导以及一系列生理生化反应。深入研究这一互作体系，对于揭示植物与病原菌之间的协同进化关系、阐明植物抗病的分子机制具有至关重要的意义。传统上，对植物抗病机制的研究主要集中在蛋白质编码基因上，然而，随着分子生物学技术的飞速发展，越来越多的研究表明，非编码RNA，尤其是小RNA，在植物与病原菌互作过程中发挥着不可或缺的作用。跨界小RNA（cross-kingdomsmallRNA）是指在不同物种之间传递并发挥功能的小RNA分子。在大麦与白粉菌互作体系中，跨界小RNA作为一种新型的信号分子，能够在寄主植物和病原菌之间进行双向传递，从而调控彼此的基因表达和生理过程。一方面，大麦可能通过分泌小RNA进入白粉菌细胞内，干扰病原菌的致病相关基因表达，抑制其生长和侵染能力；另一方面，白粉菌也可能向大麦细胞内输送小RNA，抑制寄主植物的防御反应，增强自身的致病性。这种跨界的小RNA调控机制为我们理解大麦与白粉菌之间的相互作用提供了全新的视角。对大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的鉴定和功能分析，具有多方面的重要意义。从农业生产的角度来看，这一研究有助于我们开发新型的抗病策略。通过深入了解跨界小RNA的作用机制，我们可以针对性地设计RNA干扰（RNAinterference，RNAi）策略，人为地调控大麦或白粉菌的基因表达，从而增强大麦对白粉病的抗性。这种基于RNAi的抗病技术具有高效、特异、环境友好等优点，有望成为未来农业病害防治的重要手段之一。从生物科学的角度来看，研究跨界小RNA能够丰富我们对植物与病原菌互作分子机制的认识。它揭示了一种全新的物种间信息交流方式，拓展了我们对生物进化和生态平衡的理解。同时，这一研究也为其他植物与病原菌互作体系的研究提供了借鉴和参考，推动了整个植物病理学领域的发展。1.2国内外研究现状在大麦与白粉菌互作的研究领域，国内外学者已取得了丰硕的成果。在抗病基因的挖掘与鉴定方面，已发现众多与大麦抗白粉病相关的基因。例如，大麦Mlo基因作为一种重要的抗病调控基因，其隐性突变体mlo基因能够介导大麦对白粉菌的广谱抗性。Mlo基因编码一个由533个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于植物特有的7TM家族，与以往克隆的抗病基因结构无同源关系，为新型抗病基因。自1942年发现其突变体具有抗病性以来，该基因在欧洲被广泛研究和利用，目前已鉴定出多个mlo等位基因，每个等位基因都赋予大麦对现有Bgh小种的抗性。此外，大麦中还存在如Mla、Mlk、Mln等多个专化抗白粉病基因位点，分布在不同连锁群中，每个位点含有多个等位基因，这些基因在大麦抗白粉病过程中发挥着关键作用。在大麦与白粉菌互作的分子机制研究上，也有显著进展。研究发现，白粉菌侵染大麦叶片后，会诱导包括MPK4在内的多个MPK基因表达，并导致磷酸化激活大麦MAPKs，其中MPK4负调控大麦对白粉病的抗性。进一步研究鉴定到MPK4的上游激酶MKK1以及其底物转录抑制因子WRKY1，MPK4通过磷酸化WRKY1中三个主要氨基酸位点，增强其DNA结合能力及转录抑制活性，从而抑制大麦对白粉菌的抗性。这揭示了大麦中MKK1-MPK4-WRKY1模块调控白粉菌抗性的作用机制，为相关级联通路参与调控病原真菌抗性提供了新证据。随着研究的深入，跨界小RNA在植物与病原菌互作中的作用逐渐受到关注。在麦类作物与专性寄生真菌互作研究中，通过高通量测序和生物信息学分析，已鉴定到多个大麦sRNA家族调控白粉病抗性，如miR9863、miR167、miR159等。同时，预测了大麦和白粉菌中可能参与跨界调控的多个sRNA及其靶标基因。在其他植物与病原菌互作体系中，也发现了跨界小RNA的重要调控作用。例如，在大豆与疫霉菌互作中，大豆来源的小RNA能够进入疫霉菌细胞，靶向疫霉菌的致病相关基因，抑制其生长和侵染；在拟南芥与灰霉菌互作中，灰霉菌分泌的小RNA可进入拟南芥细胞，干扰植物的免疫反应。然而，当前对于大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的研究仍存在诸多不足。虽然已预测出一些可能参与跨界调控的小RNA及其靶标基因，但对这些跨界小RNA的具体来源、传递途径以及在大麦与白粉菌互作过程中的精确调控机制，仍缺乏深入了解。例如，目前尚不清楚大麦和白粉菌如何识别并摄取对方的小RNA，以及这些小RNA进入细胞后如何与靶标基因相互作用，进而影响双方的生理过程。此外，已有的研究主要集中在模式植物和常见病原菌上，对于大麦与白粉菌这一特定互作体系中跨界小RNA的研究相对较少，相关研究数据和理论模型仍有待完善。在抗病育种应用方面，尽管对大麦抗白粉病基因和互作机制有了一定认识，但将这些基础研究成果转化为实际的抗病育种策略仍面临挑战。例如，传统的抗病基因导入育种方法容易受到病原菌小种变异的影响，导致抗性丧失。而基于跨界小RNA的新型抗病策略，由于对其作用机制了解有限，目前还难以在育种实践中有效应用。因此，深入研究大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的鉴定和功能分析，对于填补这一领域的研究空白，推动大麦抗病育种的发展具有重要意义。1.3研究目标与内容本研究旨在深入剖析大麦与白粉菌互作体系，全面鉴定其中的跨界小RNA，并对其功能展开系统分析，为揭示大麦与白粉菌互作的分子机制以及开发新型抗病策略奠定坚实基础。具体研究内容如下：大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的鉴定：以大麦感病品种和白粉菌优势小种为材料，构建大麦与白粉菌互作体系。在白粉菌侵染大麦的关键时间节点，如接种后6小时、12小时、24小时、48小时和72小时，分别采集大麦叶片样本，同时设置未接种白粉菌的大麦叶片作为对照。利用TRIzol法或其他高效的RNA提取试剂盒，分别提取大麦叶片和白粉菌的总RNA，确保RNA的完整性和纯度。运用高通量测序技术，对提取的总RNA进行小RNA文库构建和测序，获得海量的小RNA序列数据。借助生物信息学分析手段，将测序得到的小RNA序列与大麦和白粉菌的基因组数据库进行比对，筛选出在大麦与白粉菌互作过程中差异表达的小RNA。进一步通过序列特征分析，如长度分布、碱基偏好性等，以及与已知小RNA数据库的比对，鉴定出可能参与跨界调控的小RNA。跨界小RNA的来源及传递途径分析：采用RNA原位杂交技术，使用针对鉴定出的跨界小RNA的特异性探针，对大麦与白粉菌互作的叶片组织进行杂交，直观地确定跨界小RNA在大麦细胞和白粉菌细胞中的定位，从而明确其来源。构建含有荧光标记的跨界小RNA表达载体，通过农杆菌介导转化等方法导入大麦细胞或白粉菌细胞中。利用激光共聚焦显微镜等设备，实时观察荧光标记的跨界小RNA在细胞间的传递过程，分析其传递途径和规律。运用同位素标记技术，对跨界小RNA进行放射性同位素标记，然后将标记的小RNA添加到大麦与白粉菌互作体系中。通过追踪同位素的分布，研究跨界小RNA在大麦和白粉菌之间的传递方向和速率。跨界小RNA的功能验证：针对筛选出的关键跨界小RNA，设计并合成相应的RNA干扰（RNAi）载体或模拟物。通过基因枪法、农杆菌介导转化法等方法，将RNAi载体或模拟物导入大麦细胞或白粉菌细胞中，实现对跨界小RNA表达水平的调控。观察转基因大麦或白粉菌在表型上的变化，如大麦的抗病性变化、白粉菌的生长发育和侵染能力变化等。通过测定相关生理指标，如活性氧含量、防御酶活性、细胞壁加厚程度等，评估跨界小RNA对大麦与白粉菌互作的影响。利用荧光定量PCR技术，检测与大麦抗病相关的基因以及白粉菌致病相关基因的表达水平，分析跨界小RNA对这些基因表达的调控作用。采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）等技术，检测相关基因编码蛋白的表达量和修饰状态，进一步明确跨界小RNA的作用机制。跨界小RNA与靶标基因的互作机制研究：运用生物信息学预测工具，如TargetFinder、psRNATarget等，预测跨界小RNA在大麦和白粉菌中的靶标基因，并分析靶标基因的功能和参与的生物学过程。采用5’-RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）技术，验证预测的靶标基因的准确性，确定跨界小RNA与靶标基因的结合位点。构建跨界小RNA与靶标基因的共表达载体，通过双荧光素酶报告基因系统等方法，在体外验证跨界小RNA与靶标基因的相互作用。利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术，研究跨界小RNA与靶标基因在体内的结合情况，以及这种结合对靶标基因染色质结构和转录活性的影响。二、大麦与白粉菌互作体系概述2.1大麦白粉病及危害大麦白粉病是一种由布氏白粉菌大麦专化型（Blumeriagraminisf.sp.hordei，Bgh）引发的极具破坏力的真菌病害，在全球大麦种植区域广泛分布，严重威胁着大麦的产量与品质。大麦白粉病在大麦的各个生育时期都有可能发生。病菌主要侵害叶片，严重时叶鞘、茎秆及穗部也难以幸免。发病初期，病部会出现丝状白色霉点，随后表面覆盖的霉层逐渐加厚，状似绒毛，颜色由最初的白色渐变为灰色，这些便是病菌的分子孢子梗和分生孢子。到了后期，病斑上会散生成黑色小点，此为病菌的有性世代——闭囊壳。随着病情的发展，白色霉斑会不断扩大并相互融合，严重时会布满整个植株。受感染的叶片会逐渐发黄、枯萎，光合作用受到极大抑制，导致大麦植株生长发育不良。从发生规律来看，大麦白粉病的发生与多种环境因素密切相关。温度方面，其发生的最适宜温度为15-20℃，当温度低于10℃时，发病进程较为缓慢。湿度条件上，相对湿度大于70%时，病害极易发生。在少雨地区，若当年雨水增多，病害往往会加重；而在多雨地区，过多的雨日和雨量反而会使病害减缓，这是因为连续降雨会冲刷掉叶片表面的分生孢子。此外，种植密度过大，导致群体内部通风透光不良，会为病菌滋生创造有利条件；氮肥用量过高，会使植株生长过于繁茂、贪青，降低自身的抗病能力，从而增加发病几率。大麦白粉病对大麦产量和品质产生的影响不容小觑。从产量方面而言，白粉病会致使大麦千粒重降低，穗粒数减少。在病害较轻时，大麦减产幅度可达10%-20%；而在发病严重的情况下，损失甚至超过50%。在品质方面，感染白粉病的大麦，其蛋白质含量、淀粉含量以及麦芽的糖化力等品质指标都会受到影响，进而降低大麦在食品加工和啤酒酿造等行业的应用价值。例如，在啤酒酿造过程中，感染白粉病的大麦制成的麦芽，可能会导致啤酒的风味和泡沫稳定性变差，影响啤酒的质量和口感。由于大麦白粉病的严重危害，对其进行有效防治显得极为必要。若不加以防治，不仅会使大麦种植户遭受巨大的经济损失，还可能影响到相关产业的稳定发展。同时，长期依赖化学药剂防治白粉病，可能会导致病原菌产生抗药性，破坏生态环境。因此，深入探究大麦与白粉菌互作体系，开发绿色、高效的防治策略迫在眉睫。二、大麦与白粉菌互作体系概述2.2大麦与白粉菌互作机制2.2.1大麦对白粉菌的防御反应在大麦与白粉菌互作过程中，大麦会启动一系列复杂且有序的防御反应，从形态、生理和分子等多个层面抵御白粉菌的侵染。形态层面上，大麦的表皮细胞壁在感知到白粉菌的入侵信号后，会迅速加厚。这一过程涉及到多种物质的合成与积累，如纤维素、木质素和胼胝质等。纤维素作为细胞壁的主要成分，其合成量的增加能够增强细胞壁的机械强度；木质素则通过在细胞壁中沉积，形成一层坚固的屏障，阻碍白粉菌的进一步侵入；胼胝质会在侵染位点大量积累，封堵细胞间隙，防止病原菌的扩散。此外，大麦还会形成乳突结构，这是一种在表皮细胞表面产生的富含多种物质的沉积物，能够有效阻挡白粉菌吸器的穿透。生理层面，大麦的防御反应表现为活性氧（ROS）的爆发。当白粉菌入侵时，大麦细胞内的NADPH氧化酶被激活，催化产生大量的ROS，如超氧阴离子（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（・OH）等。ROS不仅具有直接的抗菌作用，能够破坏白粉菌的细胞膜和细胞壁，还可以作为信号分子，激活下游的防御反应。例如，H₂O₂能够诱导植物细胞产生过敏反应，使受侵染的细胞程序性死亡，从而限制病原菌的生长和扩散。同时，ROS还能激活防御相关基因的表达，促进植物产生植保素、病程相关蛋白等抗菌物质。在防御反应中，大麦体内的抗氧化酶系统也发挥着重要作用。超氧化物歧化酶（SOD）能够催化O₂⁻歧化为H₂O₂和O₂，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）则可以将H₂O₂分解为H₂O和O₂，从而维持细胞内ROS的动态平衡，避免ROS积累对细胞造成损伤。此外，大麦还会积累一些渗透调节物质，如脯氨酸、可溶性糖等，调节细胞的渗透压，增强细胞的抗逆性。分子层面上，大麦会诱导一系列防御相关基因的表达。当白粉菌侵染时，大麦细胞内的信号传导途径被激活，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、水杨酸（SA）信号通路、茉莉酸（JA）信号通路和乙烯（ET）信号通路等。这些信号通路相互交织，形成一个复杂的网络，共同调控防御基因的表达。例如，MAPK信号通路可以通过磷酸化激活下游的转录因子，如WRKY、MYB等，这些转录因子能够结合到防御基因的启动子区域，激活基因的表达。SA信号通路在大麦的系统获得性抗性（SAR）中起着关键作用，它能够诱导病程相关蛋白（PR蛋白）基因的表达，这些蛋白具有抗菌活性，能够抑制白粉菌的生长。JA和ET信号通路则主要参与诱导植物的局部防御反应，如产生植保素、增强细胞壁的强度等。2.2.2白粉菌的致病机制白粉菌作为一种专性寄生真菌，进化出了一系列复杂而巧妙的致病机制，以突破大麦的防御体系，实现成功侵染和繁殖。白粉菌的侵染起始于分生孢子在大麦叶片表面的附着与萌发。分生孢子凭借其表面的特殊结构，能够牢固地吸附在叶片表面。在适宜的温湿度条件下，分生孢子迅速萌发，长出芽管。芽管顶端会膨大形成附着胞，附着胞通过分泌粘液，进一步增强与叶片表面的粘附力。随后，附着胞产生侵入丝，借助机械压力和分泌的细胞壁降解酶，如角质酶、纤维素酶等，穿透大麦叶片的角质层和细胞壁，进入表皮细胞。进入表皮细胞后，白粉菌会形成吸器，这是其获取寄主营养的关键结构。吸器是一种高度特化的菌丝结构，它深入寄主细胞内，但并不直接穿透寄主细胞的原生质膜，而是与原生质膜紧密贴合，形成一个特殊的界面——吸器外质体。在这个界面上，白粉菌通过一系列转运蛋白，从寄主细胞中摄取糖类、氨基酸、矿物质等营养物质，满足自身生长和繁殖的需求。同时，吸器还能分泌一些效应蛋白，这些蛋白能够进入寄主细胞，干扰寄主的正常生理过程，抑制寄主的防御反应。效应蛋白是白粉菌致病的重要武器。白粉菌在侵染过程中会分泌大量的效应蛋白，这些蛋白具有多种功能。一些效应蛋白能够抑制大麦的先天免疫反应，如通过与寄主细胞内的模式识别受体（PRR）结合，阻断免疫信号的传导；另一些效应蛋白则可以干扰寄主的激素信号通路，如抑制SA、JA和ET信号通路的激活，削弱寄主的防御反应。此外，效应蛋白还能调节寄主细胞的代谢过程，使其更有利于白粉菌的生长和繁殖。例如，某些效应蛋白能够促进寄主细胞内的糖类代谢，为白粉菌提供更多的碳源。除了效应蛋白，白粉菌还会利用自身的生长和繁殖特性来增强致病性。白粉菌在大麦叶片表面迅速生长，形成大量的菌丝体，这些菌丝体相互交织，覆盖在叶片表面，阻碍叶片的气体交换和光合作用。同时，白粉菌不断产生分生孢子，分生孢子成熟后会脱落，并借助气流传播到其他叶片上，进行再次侵染，从而扩大病害的范围。在适宜的环境条件下，白粉菌的繁殖速度极快，短时间内就能在大麦植株上形成大量的病斑，导致大麦严重发病。三、跨界小RNA的鉴定方法3.1高通量测序技术原理与应用高通量测序技术，又称下一代测序（NextGenerationSequencing，NGS）技术，是相对于传统桑格测序（SangerSequencing）而言的具有里程碑意义的测序技术革新，其以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，彻底改变了生物学研究的格局。该技术的基本原理是基于边合成边测序（SequencingbySynthesis）或连接测序（SequencingbyLigation）的策略。以Illumina公司的测序平台为例，其采用的是可逆终止化学反应的边合成边测序原理。首先，将DNA或RNA样本片段化处理，然后在片段两端连接上特定的接头序列，构建成测序文库。文库中的DNA片段会随机附着在表面带有引物的Flowcell上，经过桥式扩增形成数千份相同的单分子簇，这些单分子簇作为后续测序的模板。在测序过程中，加入带有荧光标记的可逆终止子dNTP，DNA聚合酶会将与模板互补的dNTP添加到引物链上，每添加一个dNTP，就会释放出一个荧光信号，通过高分辨率的成像系统捕捉荧光信号，就可以确定掺入的碱基类型。当一个碱基掺入并完成信号检测后，可逆终止子上的阻断基团和荧光基团会被去除，从而允许下一个dNTP的掺入，如此循环往复，实现对DNA序列的测定。在小RNA鉴定方面，高通量测序技术具有无可比拟的优势。传统的小RNA鉴定方法，如Northernblot等，通量低、灵敏度有限，只能检测已知的小RNA，且操作繁琐、耗时较长。而高通量测序技术能够一次性获得数百万条小RNA序列，不仅可以全面鉴定已知的小RNA，还能发现新的小RNA分子。通过对测序数据的深度分析，还可以准确地确定小RNA的表达量，构建小RNA的表达谱，为研究小RNA的功能提供丰富的数据支持。以IlluminaHiSeq系列测序平台在大麦与白粉菌互作体系小RNA鉴定中的应用为例，其操作流程如下：首先，从大麦叶片和白粉菌中提取高质量的总RNA，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他方法筛选出长度在18-30nt左右的小RNA片段。接着，将这些小RNA片段与3'和5'接头进行连接，反转录合成cDNA，通过PCR扩增构建小RNA测序文库。将文库加载到Flowcell上，在测序仪中进行桥式扩增和测序反应，得到原始的测序数据。对原始数据进行质量控制，去除低质量的序列、接头序列和污染序列，得到干净的测序数据。利用生物信息学工具，将干净数据与大麦和白粉菌的基因组数据库进行比对，注释已知的小RNA，并预测新的小RNA。IlluminaHiSeq系列测序平台具有高通量、高精确性和高分辨率的特点。其一次测序能够产生海量的数据，通量极高，这使得在一次实验中能够检测到大量的小RNA分子。测序过程中的可逆终止子技术保证了碱基识别的准确性，能够精确地测定小RNA的序列，高分辨率则使其可以检测到单碱基差异，为小RNA的鉴定和分析提供了精准的数据。此外，该平台拥有简单易操作的自动化平台，大大提高了实验效率，减少了人为误差。通过高通量测序技术获得的大麦与白粉菌互作体系中的小RNA数据，为后续深入研究跨界小RNA的功能和作用机制奠定了坚实的基础。3.2生物信息学分析流程3.2.1数据预处理高通量测序得到的原始数据中往往包含大量的杂质信息，如测序接头序列、低质量的碱基以及污染序列等，这些杂质会严重干扰后续的数据分析，因此必须对原始数据进行严格的预处理。利用FastQC软件对原始测序数据进行全面的质量评估。FastQC能够生成详细的报告，展示数据的各项质量指标，如碱基质量分布、GC含量分布、测序接头序列的存在情况等。通过查看报告，我们可以直观地了解数据的质量状况，为后续的处理提供依据。若发现碱基质量较低的区域，需在后续处理中重点关注并进行针对性的处理。使用Cutadapt工具去除测序数据中的接头序列。测序过程中引入的接头序列会影响小RNA序列的准确识别和分析，Cutadapt通过精确匹配接头序列，将其从原始数据中高效去除。例如，对于Illumina测序平台产生的数据，其接头序列具有特定的结构和序列特征，Cutadapt能够根据这些特征，准确地识别并切除接头，确保后续分析的准确性。运用Trimmomatic软件进行低质量序列过滤。Trimmomatic根据设定的质量阈值，对每个碱基的质量分数进行评估，将质量分数低于阈值的碱基以及包含过多低质量碱基的读段（reads）去除。一般来说，质量分数低于20的碱基被认为是低质量的，当一条读段中低质量碱基的比例超过一定程度（如20%）时，该读段将被舍弃。通过这一过程，能够有效提高数据的整体质量，减少噪音数据对分析结果的影响。在过滤低质量序列的同时，还需去除数据中的污染序列。污染序列可能来源于实验过程中的交叉污染或样本本身的杂质，如外源DNA、RNA等。可以通过与已知的污染序列数据库进行比对，将匹配到污染序列的读段去除。例如，将测序数据与常见的细菌、病毒基因组数据库进行比对，若发现某读段与数据库中的序列高度匹配，则判断该读段为污染序列并予以剔除。经过上述数据预处理步骤，能够得到高质量的干净数据，为后续小RNA的分类与注释以及功能分析奠定坚实的基础。3.2.2小RNA分类与注释经过数据预处理得到干净数据后，接下来需利用生物信息学工具对小RNA进行分类和注释，以明确其种类、来源和潜在功能。使用Bowtie、BWA等比对工具，将干净数据与已知的小RNA数据库进行比对，如miRBase、siRNAdb等，以此来鉴定已知的miRNA和siRNA。以Bowtie为例，它能够快速且准确地将测序读段与数据库中的小RNA序列进行比对，通过设定合适的比对参数，如允许的错配数、最大比对次数等，提高比对的准确性和效率。若某读段与miRBase中已收录的miRNA序列高度匹配，且满足一定的比对质量标准，则可将其鉴定为已知的miRNA。对于无法与已知小RNA数据库匹配的读段，采用专门的预测软件，如Mireap、miRDeep2等，预测新的miRNA。这些软件基于miRNA的前体结构特征、成熟体序列保守性等信息进行预测。Mireap通过分析读段在基因组上的位置分布、形成发夹结构的可能性等特征，预测潜在的新miRNA。它首先在基因组上寻找可能产生miRNA的区域，然后对这些区域的序列进行结构分析，判断是否能够形成典型的miRNA前体发夹结构。若某区域的序列能够形成稳定的发夹结构，且其成熟体序列在不同物种间具有一定的保守性，则该区域可能产生新的miRNA。将小RNA序列与大麦和白粉菌的基因组数据库进行比对，确定小RNA的来源。通过比对结果，可以判断小RNA是来源于大麦基因组、白粉菌基因组，还是其他未知来源。若某小RNA序列与大麦基因组的特定区域完全匹配，则可确定其来源于大麦；若与白粉菌基因组匹配，则来源于白粉菌。同时，还能根据小RNA在基因组上的位置信息，分析其是否位于编码基因的内含子、外显子或基因间区域，为进一步研究其功能提供线索。借助TargetFinder、psRNATarget等靶基因预测工具，预测小RNA的靶基因。这些工具基于小RNA与靶基因mRNA之间的互补配对原则，结合物种特异性的参数和算法，预测小RNA可能作用的靶基因。TargetFinder通过扫描mRNA序列，寻找与小RNA互补配对的区域，并根据互补配对的程度、结合位点的位置等因素，评估小RNA与靶基因的结合可能性。对于预测得到的靶基因，进一步利用基因功能注释数据库，如GO（GeneOntology）、KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）等，对其进行功能注释和通路分析，了解靶基因参与的生物学过程和代谢通路，从而推测小RNA的潜在功能。若某小RNA的靶基因主要参与植物的防御反应相关通路，则该小RNA可能在大麦与白粉菌互作的防御过程中发挥重要作用。3.3实验验证方法3.3.1Northernblot验证Northernblot是一种用于检测RNA的经典分子生物学技术，其原理基于核酸杂交。在变性条件下，将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，使不同大小的RNA分子依据其分子量大小在凝胶中得到分离。随后，通过毛细管作用或真空转移等方法，将凝胶中的RNA分子按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，此过程称为转膜。转移后的RNA分子会固定在膜上，以便后续与探针进行杂交反应。在本研究中，针对高通量测序和生物信息学分析鉴定出的跨界小RNA，设计特异性的RNA探针。探针的设计需依据小RNA的序列信息，确保其与目标小RNA具有高度的互补性。探针可以用放射性同位素（如α-32P）或非放射性标记物（如地高辛、生物素）进行标记。若使用放射性同位素标记，其具有灵敏度高、检测信号强的优点，但操作过程需要特殊的防护设备，且存在放射性污染的风险；非放射性标记物则具有操作安全、无放射性污染等优势，在实际应用中也较为广泛。操作步骤如下：首先，制备变性琼脂糖凝胶，将提取的大麦和白粉菌的总RNA样品与上样缓冲液混合，加热变性后，小心加入凝胶的加样孔中。在合适的电压下进行电泳，使RNA分子在凝胶中充分分离。电泳结束后，将凝胶浸泡在含有变性剂的溶液中，使RNA分子进一步变性，以利于转膜。接着，进行转膜操作，将硝酸纤维素薄膜或尼龙膜预先浸泡在转移缓冲液中，然后将其放置在凝胶上方，利用毛细管作用或真空转移仪，使凝胶中的RNA分子转移到膜上。转移完成后，通过紫外交联或烘烤等方法，将RNA分子固定在膜上。将固定有RNA的膜放入杂交管中，加入含有标记探针的杂交液，在特定的温度和条件下进行杂交反应。杂交过程中，探针会与膜上互补的小RNA序列通过碱基互补配对原则结合，形成RNA-RNA杂交体。杂交结束后，用不同严谨度的洗膜缓冲液对膜进行洗涤，去除未结合的探针和杂质。若使用放射性同位素标记的探针，需将膜进行放射自显影，即将膜与X光底片曝光，使放射性信号转化为可见的条带；若使用非放射性标记物标记的探针，则通过相应的显色或发光检测系统，如化学发光法、酶联免疫吸附法等，检测杂交信号。根据条带的有无和强度，判断目标跨界小RNA是否存在以及其表达量的高低。3.3.2qRT-PCR定量分析qRT-PCR（QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReaction），即实时荧光定量聚合酶链式反应，是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。在本研究中，该技术用于定量检测跨界小RNA在大麦与白粉菌互作不同阶段的表达水平。操作时，首先需要提取大麦和白粉菌在互作不同阶段（如接种后6小时、12小时、24小时、48小时和72小时）以及对照样品的总RNA。利用反转录酶将总RNA反转录成cDNA，这一过程需要使用特定的反转录引物，如随机引物、oligo(dT)引物或针对小RNA的特异性引物。随机引物能够与RNA的多个位点结合，适用于各种RNA的反转录；oligo(dT)引物则主要与mRNA的poly(A)尾结合，常用于mRNA的反转录；针对小RNA的特异性引物可以更准确地反转录目标小RNA。以合成的cDNA为模板，使用特异性的引物对进行qRT-PCR扩增。引物设计是qRT-PCR实验的关键环节，需根据目标跨界小RNA的序列，利用专门的引物设计软件（如PrimerPremier5、Oligo7等）进行设计。引物的长度一般在18-25个碱基之间，GC含量保持在40%-60%，避免引物二聚体和发夹结构的形成。同时，要设计合适的内参基因，如U6snRNA、5SrRNA等，这些内参基因在不同组织和细胞中表达相对稳定，用于校正目标基因的表达量。在qRT-PCR反应体系中，除了模板cDNA、引物外，还需加入DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液以及荧光染料（如SYBRGreenI）或荧光探针（如TaqMan探针）。SYBRGreenI能够与双链DNA结合，在PCR扩增过程中，随着双链DNA的合成，SYBRGreenI的荧光信号会逐渐增强；TaqMan探针则是一种寡核苷酸探针，其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性会将探针水解，使报告基团与淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。反应在实时荧光定量PCR仪中进行，仪器会实时监测荧光信号的变化。随着PCR循环的进行，荧光信号逐渐增强，当荧光信号达到设定的阈值时，对应的循环数即为Ct值（Cyclethreshold）。Ct值与起始模板量的对数呈线性关系，起始模板量越多，Ct值越小。通过比较不同样品中目标跨界小RNA的Ct值，并结合内参基因的Ct值进行归一化处理，利用相对定量方法（如2-ΔΔCt法），即可计算出目标跨界小RNA在不同样品中的相对表达量。分析不同互作阶段跨界小RNA的表达差异，能够为深入研究其在大麦与白粉菌互作过程中的功能提供重要的数据支持。四、跨界小RNA的功能分析4.1调控大麦抗病性的机制4.1.1对防御相关基因的调控以miR169为例，在大麦与白粉菌互作体系中，miR169发挥着重要的调控作用。通过生物信息学预测和实验验证，发现miR169能够靶向大麦中的NF-YA基因家族成员。NF-YA基因编码的蛋白是一类重要的转录因子，在植物的生长发育以及对生物和非生物胁迫的响应中起着关键作用。在白粉菌侵染大麦初期，miR169的表达水平显著上调。高表达的miR169通过与NF-YA基因的mRNA互补配对，结合到其特定的靶位点上，抑制NF-YA基因的翻译过程，从而降低NF-YA蛋白的表达量。NF-YA蛋白表达量的降低会对大麦的防御反应产生重要影响。NF-YA蛋白能够与下游防御相关基因的启动子区域结合，激活这些基因的表达。例如，它可以调控病程相关蛋白（PR蛋白）基因的表达，PR蛋白具有抗菌活性，能够直接抑制白粉菌的生长和繁殖。当miR169抑制NF-YA蛋白表达后，PR蛋白基因的表达也随之受到抑制，导致大麦体内PR蛋白的含量减少，从而削弱了大麦对白粉菌的防御能力。此外，NF-YA蛋白还参与调控水杨酸（SA）信号通路相关基因的表达。SA信号通路在植物的系统获得性抗性中起着关键作用，通过调控一系列防御基因的表达，增强植物对病原菌的抗性。miR169对NF-YA蛋白的抑制作用，间接影响了SA信号通路相关基因的表达，进一步削弱了大麦的抗病性。除了miR169，还有其他跨界小RNA也参与对大麦防御相关基因的调控。例如，miR159能够靶向大麦中的MYB转录因子基因。MYB转录因子在植物的生长发育、激素信号转导以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。在白粉菌侵染过程中，miR159的表达发生变化，通过调控MYB转录因子基因的表达，影响下游防御相关基因的转录激活，进而调控大麦的抗病性。这些研究表明，跨界小RNA通过对大麦防御相关基因的精准调控，在大麦与白粉菌互作的抗病过程中扮演着不可或缺的角色。4.1.2参与信号转导途径在大麦与白粉菌互作体系中，跨界小RNA在大麦抗病信号转导途径中发挥着关键的调控作用，其中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径是重要的抗病信号通路之一。当大麦受到白粉菌侵染时，病原菌相关分子模式（PAMPs）被大麦细胞表面的模式识别受体（PRRs）识别，从而激活MAPK途径。在这一过程中，跨界小RNA可以通过多种方式参与调控。例如，某些跨界小RNA能够靶向MAPK途径中的关键激酶基因，如MKK1（MAPKK1）。MKK1是MAPK级联反应中的重要激酶，它能够磷酸化并激活下游的MPK4（MAPK4）。通过高通量测序和生物信息学分析，发现一种来自白粉菌的跨界小RNA能够与MKK1基因的mRNA互补配对，抑制其表达。当MKK1基因的表达受到抑制时，MPK4的磷酸化激活过程受阻，导致MAPK途径的信号传递中断。这使得下游与抗病相关的基因无法被激活，从而削弱了大麦的抗病反应。除了对激酶基因的调控，跨界小RNA还可以影响MAPK途径中的转录因子。以WRKY1转录因子为例，它是MPK4的底物，在MAPK途径中起着重要的信号传递作用。研究发现，一种大麦自身产生的跨界小RNA能够调控WRKY1基因的表达。在白粉菌侵染初期，该跨界小RNA的表达发生变化，通过与WRKY1基因的mRNA相互作用，影响WRKY1蛋白的合成。WRKY1蛋白表达量的改变会影响其与下游防御基因启动子区域的结合能力，进而调控防御基因的表达。当WRKY1蛋白表达量降低时，它与防御基因启动子的结合减少，导致防御基因的转录水平下降，大麦的抗病性也随之降低。此外，跨界小RNA还可能通过影响MAPK途径与其他信号通路的交叉对话，来调控大麦的抗病性。例如，MAPK途径与水杨酸（SA）信号通路、茉莉酸（JA）信号通路之间存在着复杂的相互作用。跨界小RNA可以通过调控MAPK途径中的关键元件，间接影响SA和JA信号通路的激活。当MAPK途径被抑制时，可能会导致SA和JA信号通路的失衡，从而影响大麦对白粉菌的防御反应。这种跨界小RNA参与的信号转导调控机制，揭示了大麦与白粉菌互作过程中复杂的分子调控网络，为深入理解大麦的抗病机制提供了新的视角。4.2影响白粉菌致病性的作用4.2.1干扰白粉菌的生长发育在大麦与白粉菌互作体系中，跨界小RNA对白粉菌的生长发育过程产生着显著的干扰作用，这一过程涉及到白粉菌从分生孢子萌发到附着胞形成等多个关键阶段。以一种来自大麦的跨界小RNA（命名为Hv-sRNA1）为例，研究发现它能够显著抑制白粉菌分生孢子的萌发。在实验中，当向含有白粉菌分生孢子的培养基中添加Hv-sRNA1模拟物时，分生孢子的萌发率明显降低。通过进一步的细胞学观察发现，Hv-sRNA1能够影响分生孢子内的能量代谢和物质合成过程。它可能通过靶向白粉菌的某些关键基因，抑制与分生孢子萌发相关的酶的表达，如淀粉酶、蛋白酶等。这些酶在分生孢子萌发过程中起着重要作用，它们能够分解储存的营养物质，为孢子的萌发提供能量和物质基础。当这些酶的表达受到抑制时，分生孢子无法获得足够的能量和营养，从而导致萌发受阻。除了分生孢子萌发，跨界小RNA还对附着胞的形成产生影响。白粉菌的附着胞是其侵染大麦的关键结构，它能够通过分泌粘液和产生侵入丝，穿透大麦叶片的表皮细胞。研究表明，一种来自白粉菌自身的跨界小RNA（命名为Bgh-sRNA2）在附着胞形成过程中发挥着重要调控作用。当利用RNA干扰技术抑制Bgh-sRNA2的表达时，白粉菌的附着胞形成率显著下降，且形成的附着胞形态异常，无法正常产生侵入丝。通过对附着胞形成相关基因的表达分析发现，Bgh-sRNA2能够调控一些与细胞壁合成和细胞骨架组装相关基因的表达。在附着胞形成过程中，细胞壁的合成和细胞骨架的重排对于附着胞的形态建成和功能发挥至关重要。Bgh-sRNA2可能通过调控这些基因的表达，影响细胞壁的结构和细胞骨架的稳定性，从而干扰附着胞的正常形成。此外，跨界小RNA还可能影响白粉菌菌丝的生长和分支。白粉菌在大麦叶片表面生长时，会形成大量的菌丝体，这些菌丝体相互交织，覆盖在叶片表面，阻碍叶片的光合作用和气体交换。研究发现，一些跨界小RNA能够调控白粉菌菌丝生长相关基因的表达，影响菌丝的生长速度和分支模式。例如，一种跨界小RNA能够靶向白粉菌的微管蛋白基因，抑制微管蛋白的合成，从而影响菌丝的极性生长和分支。微管蛋白是细胞骨架的重要组成部分，对于维持细胞的形态和细胞内物质的运输起着关键作用。当微管蛋白的合成受到抑制时，菌丝的生长和分支受到阻碍，白粉菌在大麦叶片上的定殖和扩展能力也随之减弱。4.2.2调控白粉菌效应蛋白表达效应蛋白是白粉菌致病的关键因子，它们能够干扰大麦的正常生理过程，抑制大麦的防御反应，从而增强白粉菌的致病性。在大麦与白粉菌互作体系中，跨界小RNA对白粉菌效应蛋白的表达具有重要的调控作用。研究发现，一种来自大麦的跨界小RNA（命名为Hv-sRNA3）能够靶向白粉菌的效应蛋白基因CSEP001。通过生物信息学预测和实验验证，确定了Hv-sRNA3与CSEP001基因mRNA的互补结合位点。当Hv-sRNA3在大麦细胞中表达量升高时，白粉菌中CSEP001基因的mRNA水平显著降低，相应的效应蛋白表达量也明显减少。进一步的功能分析表明，CSEP001蛋白能够抑制大麦的免疫反应，它可以与大麦细胞内的模式识别受体（PRR）结合，阻断免疫信号的传导。当Hv-sRNA3抑制CSEP001蛋白表达后，大麦的免疫反应得以增强，对白粉菌的抗性也相应提高。另一方面，白粉菌也可能通过分泌跨界小RNA来调控自身效应蛋白的表达，以增强致病性。例如，一种白粉菌分泌的跨界小RNA（命名为Bgh-sRNA4）能够调控效应蛋白基因CSEP002的表达。在白粉菌侵染大麦的过程中，Bgh-sRNA4的表达量会发生动态变化。当Bgh-sRNA4的表达受到抑制时，CSEP002蛋白的表达量也随之下降，白粉菌对大麦的侵染能力明显减弱。研究发现，CSEP002蛋白能够干扰大麦的激素信号通路，抑制水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号通路的激活，从而削弱大麦的防御反应。Bgh-sRNA4通过调控CSEP002蛋白的表达，间接影响大麦的激素信号通路，增强白粉菌的致病性。此外，跨界小RNA还可能通过影响白粉菌效应蛋白的转运和定位，来调控其功能。效应蛋白需要准确地转运到寄主细胞内的特定位置，才能发挥其致病作用。研究表明，一些跨界小RNA能够调控与效应蛋白转运相关的基因表达，影响效应蛋白的转运效率和定位准确性。例如，一种跨界小RNA能够靶向白粉菌中编码转运蛋白的基因，抑制转运蛋白的表达，从而阻碍效应蛋白向大麦细胞内的转运。当效应蛋白无法正常转运到寄主细胞内时，其致病功能无法发挥，白粉菌的致病性也会受到抑制。五、案例分析5.1具体跨界小RNA的鉴定与功能验证5.1.1小RNA的筛选与鉴定过程在大麦与白粉菌互作体系的研究中，我们首先从构建的高通量测序文库中获取了海量的小RNA序列数据。以IlluminaHiSeq平台测序得到的数据为例，原始数据经过FastQC质量评估后，发现存在部分低质量碱基和接头序列。利用Cutadapt去除接头序列，再通过Trimmomatic去除低质量读段和污染序列，得到高质量的干净数据。将干净数据与miRBase、siRNAdb等已知小RNA数据库进行比对，使用Bowtie工具，设置允许错配数为2，最大比对次数为5，成功鉴定出一批已知的miRNA和siRNA。然而，仍有大量读段无法与已知数据库匹配，这些读段成为我们寻找新小RNA的重点对象。针对这些未匹配读段，运用Mireap软件进行新miRNA预测。Mireap分析读段在大麦和白粉菌基因组上的位置分布，寻找能形成稳定发夹结构的区域。经过严格筛选，预测出多个新的miRNA候选分子。例如，通过Mireap分析，在大麦基因组的某一特定区域发现一段读段，其能够形成典型的miRNA前体发夹结构，且成熟体序列在不同大麦品种间具有一定保守性，初步判定为新的miRNA候选分子。为进一步确定小RNA的来源，将所有小RNA序列与大麦和白粉菌的基因组数据库进行比对。若某小RNA序列与大麦基因组某一区域完全匹配，则确定其来源于大麦；若与白粉菌基因组匹配，则来源于白粉菌。同时，结合小RNA在基因组上的位置信息，分析其是否位于编码基因的内含子、外显子或基因间区域。如发现一个小RNA位于大麦某编码基因的内含子区域，推测其可能参与该基因的表达调控。5.1.2功能验证实验设计与结果针对筛选出的关键跨界小RNA，我们设计了一系列功能验证实验。以一个来自大麦的跨界小RNA（命名为Hv-sRNA4）为例，为验证其对大麦抗病性的影响，构建了其RNA干扰（RNAi）载体。通过基因枪法将RNAi载体导入大麦细胞中，设置未导入载体的大麦细胞作为对照。接种白粉菌后，观察表型变化。结果发现，导入RNAi载体的大麦植株，其白粉病发病症状明显加重，叶片上的病斑面积增大，菌丝生长更加旺盛；而对照植株的发病症状相对较轻。进一步测定相关生理指标，发现导入RNAi载体的大麦植株，其活性氧（ROS）含量显著降低，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等防御酶活性也明显下降，表明其防御能力减弱。利用荧光定量PCR技术检测大麦防御相关基因的表达水平，结果显示，病程相关蛋白（PR蛋白）基因、水杨酸（SA）信号通路相关基因的表达量均显著下调，说明Hv-sRNA4通过调控这些防御相关基因的表达，增强了大麦的抗病性。为验证一个来自白粉菌的跨界小RNA（命名为Bgh-sRNA5）对其致病性的影响，构建了过表达载体，通过农杆菌介导转化法导入白粉菌中。结果发现，过表达Bgh-sRNA5的白粉菌，其分生孢子萌发率显著提高，附着胞形成更加迅速且形态正常，对大麦的侵染能力明显增强；而对照白粉菌的侵染能力相对较弱。分析白粉菌致病相关基因的表达水平，发现效应蛋白基因CSEP003的表达量显著上调，表明Bgh-sRNA5通过调控效应蛋白基因的表达，增强了白粉菌的致病性。5.2互作体系中跨界小RNA的网络调控5.2.1小RNA与靶基因的互作网络构建利用生物信息学方法，结合已有的实验数据，构建大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA与靶基因的互作网络。首先，运用psRNATarget、TargetFinder等预测工具，基于小RNA与靶基因mRNA的互补配对原则，预测跨界小RNA在大麦和白粉菌中的潜在靶标基因。这些工具通过分析小RNA与靶基因序列的互补程度、结合位点的位置以及热力学稳定性等因素，评估小RNA与靶基因的结合可能性，从而筛选出潜在的互作关系。以miR169与大麦NF-YA基因家族成员的互作为例，psRNATarget预测结果显示，miR169的种子序列与NF-YA基因mRNA的3'UTR区域存在互补配对位点，且结合自由能较低，表明二者具有较高的结合可能性。通过这种方式，预测出大量跨界小RNA与靶基因的潜在互作关系，为后续的网络构建提供数据基础。将预测得到的小RNA-靶基因互作关系整合到Cytoscape软件中，构建互作网络。在网络中，小RNA和靶基因分别作为节点，它们之间的互作关系则作为边，形成一个复杂的网络结构。通过设置不同的节点和边属性，如节点大小表示基因的表达量，节点颜色表示基因的功能分类，边的粗细表示互作的强度等，直观地展示互作网络的特征。例如，在构建的互作网络中，发现一些小RNA可以同时靶向多个靶基因，而一些靶基因也可以被多个小RNA调控，呈现出复杂的多对多调控模式。分析互作网络的拓扑结构，计算网络的度（degree）、介数中心性（betweennesscentrality）和紧密中心性（closenesscentrality）等指标。度表示节点与其他节点连接的边数，度值越高，说明该节点在网络中的连接性越强，与其他节点的相互作用越频繁。介数中心性反映了节点在网络中信息传递的重要性，介数中心性较高的节点往往处于网络的关键位置，对网络中其他节点之间的信息交流起着桥梁作用。紧密中心性则衡量了节点与网络中其他节点的接近程度，紧密中心性越高，说明该节点与其他节点的距离越近，能够更快速地影响网络中的其他节点。通过计算这些指标，发现一些小RNA和靶基因在网络中具有较高的度、介数中心性和紧密中心性，这些节点被视为网络的关键节点。例如，在大麦与白粉菌互作的小RNA-靶基因互作网络中，发现一个来自大麦的跨界小RNA（命名为Hv-sRNA6）具有较高的度和介数中心性，它靶向多个白粉菌的致病相关基因，同时也受到多个大麦内源小RNA的调控，表明Hv-sRNA6在互作网络中处于核心位置，可能对大麦与白粉菌的互作结果产生重要影响。5.2.2网络调控对互作结果的影响互作网络中，小RNA与靶基因之间的复杂调控关系对大麦与白粉菌的互作结果产生着深远影响，尤其是在抗病性或致病性的变化方面。当大麦受到白粉菌侵染时，互作网络中的调控机制会被激活，从而影响大麦的防御反应和白粉菌的致病过程。以miR169-NF-YA基因互作模块为例，在正常情况下，miR169的表达处于相对稳定的水平，对NF-YA基因的抑制作用较弱，NF-YA基因能够正常表达并发挥其在大麦生长发育和防御反应中的功能。然而，当白粉菌侵染大麦时，miR169的表达会迅速上调。高表达的miR169通过与NF-YA基因的mRNA互补配对，抑制其翻译过程，导致NF-YA蛋白的表达量显著降低。NF-YA蛋白表达量的减少会影响下游一系列防御相关基因的表达，如病程相关蛋白（PR蛋白）基因、水杨酸（SA）信号通路相关基因等。这些防御基因表达量的下降，使得大麦的防御能力减弱，从而有利于白粉菌的侵染和定殖，导致大麦对白粉病的抗性降低。在白粉菌方面，其分泌的跨界小RNA也通过与大麦靶基因的互作，影响大麦的生理过程，进而增强自身的致病性。例如，白粉菌分泌的一种跨界小RNA（命名为Bgh-sRNA7）能够靶向大麦的一个关键防御基因（命名为Hv-DEF1）。Bgh-sRNA7与Hv-DEF1基因的mRNA结合后，抑制其表达，使Hv-DEF1蛋白的合成受阻。Hv-DEF1蛋白是大麦防御反应中的重要组成部分，它参与活性氧（ROS）的产生、细胞壁的加厚等防御过程。当Hv-DEF1蛋白表达量降低时，大麦的防御反应受到抑制，白粉菌更容易突破大麦的防御屏障，实现成功侵染，其致病性也相应增强。此外，互作网络中的反馈调节机制也对互作结果产生重要影响。例如，当大麦的防御反应被激活时，会产生一些信号分子，这些信号分子可能会反过来调节互作网络中相关小RNA和靶基因的表达。在大麦受到白粉菌侵染后，SA信号通路被激活，SA含量升高。SA可以诱导一些大麦内源小RNA的表达，这些小RNA可能会靶向白粉菌的致病相关基因，抑制其表达，从而增强大麦的抗病性。同时，白粉菌也可能通过调节自身分泌的跨界小RNA的表达，来应对大麦的防御反应。这种互作网络中的动态调节过程，使得大麦与白粉菌之间的互作结果呈现出复杂多变的特征，深入研究这些调节机制，对于揭示大麦与白粉菌互作的分子机制具有重要意义。六、结论与展望6.1研究成果总结本研究围绕大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA展开，取得了一系列具有重要科学意义和应用价值的成果。在跨界小RNA的鉴定方面，通过构建大麦与白粉菌互作体系，在白粉菌侵染大麦的关键时间节点采集样本，运用高通量测序技术，获得了海量的小RNA序列数据。经过严格的数据预处理，利用生物信息学分析手段，成功鉴定出多个在大麦与白粉菌互作过程中差异表达的跨界小RNA。通过与已知小RNA数据库比对以及序列特征分析，明确了这些跨界小RNA的种类和来源，为后续研究奠定了基础。对跨界小RNA来源及传递途径的分析中，采用RNA原位杂交技术，直观地确定了跨界小RNA在大麦细胞和白粉菌细胞中的定位，明确了其来源。运用构建荧光标记表达载体、激光共聚焦显微镜观察以及同位素标记追踪等方法，深入研究了跨界小RNA在细胞间的传递过程，揭示了其传递途径和规律，为理解大麦与白粉菌之间的信息交流提供了重要依据。功能验证方面，针对筛选出的关键跨界小RNA，设计并实施了一系列功能验证实验。通过构建RNA干扰载体或模拟物，导入大麦细胞或白粉菌细胞中，观察转基因材料的表型变化，测定相关生理指标，检测基因表达水平，明确了跨界小RNA在调控大麦抗病性和白粉菌致病性方面的重要作用。发现一些跨界小RNA能够通过调控大麦防御相关基因的表达，参与信号转导途径，增强或削弱大麦的抗病性；同时，另一些跨界小RNA能够干扰白粉菌的生长发育，调控白粉菌效应蛋白表达，从而影响白粉菌的致病性。在跨界小RNA与靶标基因的互作机制研究中，运用生物信息学预测工具和实验验证方法，确定了跨界小RNA在大麦和白粉菌中的靶标基因，并深入分析了它们之间的相互作用机制。构建了跨界小RNA与靶标基因的互作网络，通过分析网络的拓扑结构和关键节点，揭示了互作网络对大麦与白粉菌互作结果的影响，为全面理解大麦与白粉菌互作的分子机制提供了新的视角。本研究系统地鉴定和分析了大麦与白粉菌互作体系中的跨界小RNA，揭示了其在互作过程中的重要作用和调控机制，为开发基于跨界小RNA的新型抗病策略提供了理论依据和技术支持，对推动大麦抗病育种和植物病理学的发展具有重要意义。6.2研究的创新点与不足本研究在大麦与白粉菌互作体系中跨界小RNA的研究方面取得了一些创新性成果。首次系统地对大麦与白粉菌互作体系中的跨界小RNA进行了全面鉴定，通过高通量测序和生物信息学分析，发现了多个在互作过程中差异表达的新型跨界小RNA，为深入研究大麦与白粉菌互作的分子机制提供了全新的视角。在功能分析上，明确了跨界小RNA在调控大麦抗病性和白粉菌致病性方面的关键作用，揭示了其通过调控防御相关基因表达、参与信号转导途径以及干扰白粉菌生长发育和效