大黄素与乳酸菌生物表面活性剂：金黄色葡萄球菌生物被膜形成的双重干预策略

大黄素与乳酸菌生物表面活性剂：金黄色葡萄球菌生物被膜形成的双重干预策略一、引言1.1研究背景与意义金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）作为常见的革兰氏阳性条件致病菌，在自然界中分布极为广泛，常见于皮肤、鼻腔、气管等部位，同时也是引起社区感染及院内感染的主要病原，在食品、医疗等多个领域对人类健康构成严重威胁。食源性金黄色葡萄球菌更是食品安全的重要风险源，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA），因其具备耐药性强、生物被膜形成能力强以及抗逆境能力强等特性，防控难度极大。例如在乳制品加工过程中，即便经过高温、干燥等胁迫条件，部分MRSA仍能通过基因表达模式的变化来抵抗逆境，实现存活并残留在食品中。生物被膜是微生物在生长过程中，为适应生存环境而附着于接触表面，并分泌多糖、蛋白质、核酸等胞外聚合物将自身包裹其中所形成的一种具有三维结构的微生物聚集体。当金黄色葡萄球菌形成生物被膜后，其耐药性可提高10-1000倍。这是因为生物被膜中的胞外聚合物能够阻挡抗生素等药物的渗透，使得常规的抗菌治疗难以发挥作用；同时，生物被膜内的细菌生长代谢缓慢，对抗生素的敏感性降低。在医疗领域，医疗器械表面一旦形成金黄色葡萄球菌生物被膜，极易引发患者的二次感染，如导管相关感染、假体周围感染等，不仅增加了患者的痛苦和治疗成本，还可能导致治疗失败，甚至危及生命。在食品工业中，设备和管道表面的生物被膜会污染食品，引发食源性疾病的传播，给食品企业带来巨大的经济损失。目前，对抗金黄色葡萄球菌的传统药物存在诸多问题，如抗生素的滥用导致细菌耐药性不断增强，许多原本有效的抗生素逐渐失去作用；同时，药物的副作用也给患者带来了额外的负担，如一些抗生素可能会引起过敏反应、肠道菌群失调等。因此，寻找安全有效的新型抗金黄色葡萄球菌生物被膜干预方法成为研究热点。大黄素（Emodin）是一种天然的蒽醌类化合物，存在于多种植物中，如蓼科植物掌叶大黄的根茎、豆科植物决明的新鲜种子等。大黄素具有多种生物活性，在抗微生物生长方面表现出色。研究表明，大黄素对金黄色葡萄球菌209P、链球菌、白喉杆菌等多种细菌均有抑制作用，其抗菌作用机制与抑制线粒体呼吸链电子传递、抑制呼吸与氨基酸、糖和蛋白质代谢中间产物的氧化和脱氢等有关，最终使细菌生长受抑。在对金黄色葡萄球菌生物被膜的研究中发现，大黄素在体外可以有效抑制其生物膜的形成并破坏成熟的生物膜，当大黄素浓度达到8μg/ml后，75%的ATCC6538和70%的16-22金黄色葡萄球菌生物膜生成被抑制，56%的已成熟生物膜被破坏，展现出良好的干预潜力。乳酸菌（Lacticacidbacteria）是一类重要的益生菌，广泛应用于食品、保健品以及医药等领域。乳酸菌能够产生多种抑菌物质，如有机酸、过氧化物、细菌素等，这些抑菌物质具有广谱抗菌、不易产生耐药性、安全等特点。乳酸菌产生的生物表面活性剂是其抑菌物质中的一种，它是一类具有两亲性结构的化合物，能够降低表面张力，改变细胞膜的通透性，从而抑制细菌的生长和生物被膜的形成。例如，乳酸杆菌产生的某些生物表面活性剂能够破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的结构，导致细胞内物质外泄，进而抑制其生物被膜的形成。本研究聚焦于大黄素与乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的干预作用，具有重要的理论意义和实际应用价值。从理论层面来看，深入探究二者对生物被膜形成的影响机制，有助于丰富微生物学、生物化学等相关学科的理论知识，为进一步理解细菌生物被膜的形成调控机制提供新的视角。在实际应用方面，对于医疗领域而言，有望开发出新型的抗菌药物或医疗器械表面涂层，有效预防和治疗金黄色葡萄球菌引起的感染，降低患者的感染风险和医疗成本；在食品工业中，可用于食品加工设备的清洁和消毒，减少生物被膜对食品的污染，保障食品安全，促进食品行业的健康发展。1.2研究目的与内容本研究旨在深入探究大黄素与乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的干预作用及其潜在机制，为开发新型、安全有效的抗金黄色葡萄球菌生物被膜策略提供坚实的理论依据和实验支持。具体研究内容如下：测定大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）：采用微量肉汤稀释法，精确测定大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC。将金黄色葡萄球菌接种于含不同浓度药物的液体培养基中，经过一定时间的培养后，通过观察细菌的生长情况来确定MIC，即能够抑制细菌生长的最低药物浓度；进一步将无细菌生长的培养液转种至新鲜培养基，观察细菌是否生长，从而确定MBC，即能够杀死99.9%以上细菌的最低药物浓度。通过这一测定，明确两种物质对金黄色葡萄球菌的抗菌活性强弱，为后续实验中药物浓度的选择提供关键参考。研究大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用：运用结晶紫染色法，直观、定量地分析不同浓度的大黄素和乳酸菌生物表面活性剂在不同作用时间下对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果。在96孔板中培养金黄色葡萄球菌形成生物被膜，然后加入不同浓度的药物处理，染色后通过酶标仪测定吸光度值，以此评估生物被膜的形成量，进而判断药物的抑制效果；同时，利用扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（CLSM），从微观层面观察生物被膜的形态结构变化，深入了解药物对生物被膜形成过程中细菌黏附、聚集以及胞外聚合物分泌等环节的影响。探究大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌成熟生物被膜的破坏作用：同样采用结晶紫染色法，测定不同浓度药物对已形成的成熟生物被膜的破坏程度；借助SEM和CLSM，观察成熟生物被膜在药物作用后的微观结构变化，如生物被膜的完整性、细菌分布情况等；通过检测生物被膜内细菌的活菌数，评估药物对生物被膜内细菌生存状态的影响，全面揭示两种物质对成熟生物被膜的破坏机制。分析大黄素和乳酸菌生物表面活性剂干预金黄色葡萄球菌生物被膜形成的机制：从多个层面深入探讨作用机制。在基因水平上，运用实时荧光定量PCR技术，检测与生物被膜形成相关基因（如ica操纵子、agr系统相关基因等）的表达变化，分析药物是否通过影响这些基因的表达来干预生物被膜的形成；在蛋白质水平上，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术或酶联免疫吸附测定（ELISA），检测相关蛋白的表达水平，进一步验证基因表达变化的结果；在细胞水平上，通过检测细胞膜通透性、细胞内活性氧（ROS）水平等指标，探究药物对金黄色葡萄球菌细胞生理功能的影响，从而全面解析大黄素和乳酸菌生物表面活性剂干预金黄色葡萄球菌生物被膜形成的内在机制。1.3研究方法与技术路线本研究综合运用文献调研、实验研究以及数据分析等多种方法，深入探究大黄素与乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的干预作用及其机制。具体研究方法和技术路线如下：文献调研：全面收集国内外关于金黄色葡萄球菌生物被膜形成机制、大黄素和乳酸菌生物表面活性剂的抗菌活性及作用机制等相关文献资料。通过对这些文献的系统分析，了解研究现状和发展趋势，明确本研究的切入点和创新点，为实验研究提供理论依据和研究思路。实验研究：材料准备：选取标准的金黄色葡萄球菌菌株，如ATCC6538等，从相关菌种保藏中心获取，并进行复苏、活化和保藏。同时，准备大黄素标准品，确保其纯度和质量符合实验要求；从乳酸菌中提取和纯化生物表面活性剂，采用高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等技术对其进行鉴定和纯度分析。此外，准备各类实验耗材，如96孔板、培养皿、移液器吸头等；以及实验仪器，包括酶标仪、扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR仪等，并进行调试和校准，确保仪器正常运行。最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定：采用微量肉汤稀释法测定大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC。将金黄色葡萄球菌菌液接种于含不同浓度药物的液体培养基中，每个浓度设置多个复孔，同时设置阴性对照（不含药物的培养基）和阳性对照（已知抗菌药物）。将接种后的96孔板置于恒温培养箱中，在适宜的温度和时间下培养。培养结束后，通过肉眼观察或酶标仪测定600nm处的吸光度值，确定MIC，即能够抑制细菌生长的最低药物浓度。进一步将无细菌生长的培养液转种至新鲜培养基，继续培养，观察细菌是否生长，从而确定MBC，即能够杀死99.9%以上细菌的最低药物浓度。生物被膜形成抑制实验：运用结晶紫染色法研究不同浓度的大黄素和乳酸菌生物表面活性剂在不同作用时间下对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果。在96孔板中加入适量的金黄色葡萄球菌菌液和不同浓度的药物，同时设置空白对照（不含药物）和阳性对照（已知抗生物被膜药物）。将96孔板置于恒温培养箱中培养一定时间，使细菌形成生物被膜。培养结束后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗孔板，去除浮游细菌。然后加入适量的结晶紫溶液，染色一定时间，使生物被膜染色。染色结束后，弃去结晶紫溶液，用PBS冲洗孔板，直至冲洗液无色。最后加入适量的乙醇或乙酸等溶剂，溶解结晶紫，通过酶标仪测定570nm处的吸光度值，吸光度值越高，表明生物被膜形成量越多，以此评估药物对生物被膜形成的抑制效果。同时，利用扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜的形态结构变化。将经过药物处理的生物被膜样品进行固定、脱水、干燥等预处理后，用SEM观察生物被膜的表面形态、细菌分布和胞外聚合物的分泌情况；用CLSM观察生物被膜的三维结构、细菌的活性和分布情况，深入了解药物对生物被膜形成过程中细菌黏附、聚集以及胞外聚合物分泌等环节的影响。成熟生物被膜破坏实验：同样采用结晶紫染色法测定不同浓度药物对已形成的成熟生物被膜的破坏程度。在96孔板中先培养金黄色葡萄球菌形成成熟生物被膜，然后加入不同浓度的药物，继续培养一定时间。后续操作与生物被膜形成抑制实验中的结晶紫染色步骤相同，通过酶标仪测定吸光度值，评估药物对成熟生物被膜的破坏效果。借助SEM和CLSM观察成熟生物被膜在药物作用后的微观结构变化，如生物被膜的完整性、细菌分布情况等；通过平板计数法检测生物被膜内细菌的活菌数，评估药物对生物被膜内细菌生存状态的影响，全面揭示两种物质对成熟生物被膜的破坏机制。作用机制研究：在基因水平上，运用实时荧光定量PCR技术，检测与生物被膜形成相关基因（如ica操纵子、agr系统相关基因等）的表达变化。提取经过药物处理和未处理的金黄色葡萄球菌的总RNA，反转录成cDNA，然后以cDNA为模板，设计特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增。通过比较不同处理组中相关基因的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量，分析药物是否通过影响这些基因的表达来干预生物被膜的形成。在蛋白质水平上，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术或酶联免疫吸附测定（ELISA），检测相关蛋白的表达水平。提取细菌总蛋白，进行蛋白定量，然后通过SDS电泳分离蛋白，转膜后用特异性抗体进行免疫杂交，通过化学发光或显色方法检测蛋白条带的强度，从而确定相关蛋白的表达水平，进一步验证基因表达变化的结果。在细胞水平上，通过检测细胞膜通透性、细胞内活性氧（ROS）水平等指标，探究药物对金黄色葡萄球菌细胞生理功能的影响。采用荧光探针标记法，如用碘化丙啶（PI）标记细胞膜，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，反映细胞膜通透性的变化；用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察和分析ROS的产生情况，从而全面解析大黄素和乳酸菌生物表面活性剂干预金黄色葡萄球菌生物被膜形成的内在机制。数据分析：运用统计学软件，如SPSS、GraphPadPrism等，对实验数据进行统计分析。采用方差分析（ANOVA）、t检验等方法，比较不同处理组之间的数据差异，判断药物作用的显著性。计算实验数据的平均值、标准差等统计参数，以图表形式直观展示实验结果，如柱状图、折线图、散点图等，便于分析和讨论。通过数据分析，明确大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制和破坏作用及其机制，为研究结论的得出提供有力支持。本研究的技术路线如图1所示：（此处插入技术路线图，图中应清晰展示从材料准备、实验设计、实验操作到数据分析的整个流程，各个环节之间用箭头连接，标注关键实验步骤和检测指标）（此处插入技术路线图，图中应清晰展示从材料准备、实验设计、实验操作到数据分析的整个流程，各个环节之间用箭头连接，标注关键实验步骤和检测指标）综上所述，本研究通过多种研究方法的有机结合，从多个层面深入探究大黄素与乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的干预作用及其机制，有望为解决金黄色葡萄球菌生物被膜相关问题提供新的策略和方法。二、相关理论基础2.1金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的典型代表。其细胞呈球形，直径约为0.8-1μm，在显微镜下观察，常以葡萄串状排列，无芽孢、无鞭毛，多数菌株在体外培养时不形成荚膜，但在某些特殊条件下，细胞壁外层可出现荚膜样黏液物质。这种细菌的细胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸组成，肽聚糖赋予细胞壁坚韧的机械强度，而磷壁酸则在细菌的黏附、抗原性以及与宿主细胞的相互作用中发挥重要作用。金黄色葡萄球菌的营养需求不高，在普通培养基上，于37℃、pH值为7.4左右的条件下培养24-48小时，即可良好生长。在普通琼脂平板上，其菌落呈现为圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐且不透明的形态，直径通常在2mm左右；而致病性金黄色葡萄球菌的菌落则呈金黄色，当在血琼脂平板上生长后，菌落周围还会出现完全透明的溶血环，即β溶血现象，这是由于其能够产生溶血毒素，破坏红细胞所致。此外，该菌具有较强的耐盐性，可在盐浓度接近10%的环境中生存，这一特性使其在一些高盐食品，如腌制肉类、咸鱼等中也能存活并繁殖。金黄色葡萄球菌是一种重要的条件致病菌，具备强大的致病能力，这主要归因于其能够产生多种外毒素和侵袭性酶。外毒素如肠毒素，是引起食物中毒的主要原因之一，人误食被肠毒素污染的食物后，通常在2-6小时内就会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性肠胃炎症状。中毒症状一般较为剧烈，但病程较短，通常在1-2天内即可恢复。毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）则可引发毒性休克综合征，患者会出现高热、低血压、皮疹、多器官功能障碍等严重症状，病情凶险，死亡率较高。α-溶血素能够破坏多种细胞的细胞膜，包括红细胞、白细胞、血小板等，导致细胞溶解，引发组织损伤和炎症反应。侵袭性酶中，凝固酶可使血浆中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而使血浆凝固，这不仅有助于细菌在宿主体内的定植，还能保护细菌免受吞噬细胞的吞噬；透明质酸酶能够分解细胞间质中的透明质酸，使细菌更容易在组织中扩散，引发感染的蔓延。在医疗领域，金黄色葡萄球菌是医院感染的常见病原菌之一，可引发多种严重感染。例如，在手术伤口感染中，金黄色葡萄球菌可通过手术器械、医护人员的手等途径污染伤口，在伤口处大量繁殖，导致伤口红肿、疼痛、化脓，严重影响伤口愈合，甚至可能引发全身性感染，如败血症、脓毒血症等。在肺炎患者中，金黄色葡萄球菌肺炎通常病情较重，患者会出现高热、咳嗽、咳脓血痰等症状，肺部影像学检查可见肺部实变、空洞形成等，治疗难度较大，死亡率较高。对于免疫力低下的患者，如长期使用免疫抑制剂、患有恶性肿瘤、艾滋病等疾病的患者，金黄色葡萄球菌感染的风险更高，且感染后病情往往更为严重，治疗效果也相对较差。在食品领域，金黄色葡萄球菌同样是食源性疾病的重要病原菌。它可污染多种食品，如乳制品、肉制品、蛋类、糕点等。在乳制品加工过程中，如果生产环境卫生条件不达标，金黄色葡萄球菌就可能污染牛奶、酸奶等产品，在适宜的温度下大量繁殖并产生肠毒素。当消费者食用这些被污染的乳制品后，就容易引发食物中毒。肉制品在加工、储存和销售过程中也容易受到金黄色葡萄球菌的污染，尤其是一些加工工艺不完善、储存条件不当的肉制品，如未经充分加热的卤肉、在常温下放置时间过长的火腿等。蛋类食品如果受到金黄色葡萄球菌污染，在孵化过程中，细菌可能侵入蛋内，不仅影响蛋的孵化率，还可能导致食用者感染。糕点类食品由于富含糖分和蛋白质，为金黄色葡萄球菌的生长提供了良好的营养条件，一旦污染，细菌容易迅速繁殖。据统计，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件在食源性微生物食物中毒事件中占比较高，严重威胁公众的食品安全和身体健康。2.2细菌生物被膜2.2.1形成过程细菌生物被膜的形成是一个动态且复杂的过程，通常可细分为5个阶段。首先是条件膜形成阶段，当细菌接触到固体表面时，周围环境中的大分子物质，如蛋白质、多糖等，会迅速吸附到表面，形成一层薄薄的条件膜。这层条件膜改变了表面的物理和化学性质，为后续细菌的黏附提供了基础。例如在医疗器械表面，人体的血浆蛋白等会率先吸附，为细菌的黏附创造条件。初始黏附阶段是生物被膜形成的关键起始步骤。浮游细菌通过自身的表面结构，如菌毛、鞭毛、脂磷壁酸等，与条件膜发生可逆性的弱相互作用，短暂附着在表面。在这个过程中，细菌与表面之间的相互作用力主要包括范德华力、静电引力等。以大肠杆菌为例，其菌毛能够识别并结合条件膜上的特定受体，从而实现初始黏附。随着时间的推移，细菌与表面之间的相互作用逐渐增强，部分细菌会通过分泌一些黏附素等物质，与表面形成更紧密的不可逆黏附，这标志着初始黏附阶段的完成。不可逆黏附之后进入生物被膜的发展阶段。在这个阶段，已黏附的细菌开始大量繁殖，通过二分裂的方式不断增加数量，同时分泌大量的胞外多聚物（EPS）。EPS是一种由多糖、蛋白质、核酸、脂质等组成的复杂混合物，它将细菌包裹其中，使细菌之间以及细菌与表面之间的连接更加稳固。多糖能够形成网状结构，为生物被膜提供物理支撑；蛋白质则参与细菌的黏附、信号传递等过程；核酸可以作为遗传物质的储备，也可能在细菌之间的基因水平转移中发挥作用。随着细菌数量的增加和EPS的不断积累，生物被膜逐渐增厚，形成微菌落结构，这些微菌落紧密聚集在一起，构成了生物被膜的基本单元。当生物被膜发展到一定程度，就进入了成熟阶段。此时的生物被膜呈现出高度结构化的三维立体形态，具有明显的通道和空隙。通道的存在使得营养物质能够顺利输送到生物被膜内部的细菌，同时代谢废物也能及时排出，保证了生物被膜内细菌的正常生长和代谢。生物被膜的成熟是一个动态平衡的过程，细菌的生长、死亡、EPS的合成与降解等过程相互协调。在成熟的生物被膜中，不同位置的细菌可能具有不同的生理状态，如表面的细菌生长代谢较为活跃，而深层的细菌则可能处于相对休眠的状态，以适应营养物质和氧气的梯度变化。例如在口腔中形成的牙菌斑生物被膜，经过一段时间的发展，会形成复杂的结构，内部包含多种细菌群落，不同细菌在其中分工协作，共同维持生物被膜的稳定。最后是生物被膜的解聚与扩散阶段。当生物被膜所处的环境发生变化，如营养物质匮乏、受到外界胁迫等，生物被膜内的细菌会启动解聚机制。部分细菌会脱离生物被膜，重新以浮游状态进入周围环境，寻找更适宜的生存空间。在这个过程中，细菌可能会分泌一些酶类，如多糖水解酶、蛋白酶等，降解EPS，破坏生物被膜的结构，从而实现细菌的释放。解聚后的浮游细菌具有更强的传播能力，它们可以通过空气、水等介质传播到新的环境中，重新开始生物被膜的形成过程。例如在医院的感染环境中，生物被膜解聚后释放的细菌可能会污染医疗器械、病房空气等，引发新的感染。2.2.2结构与组成细菌生物被膜主要由细菌菌体和胞外多聚物（EPS）构成。细菌菌体是生物被膜的核心组成部分，不同种类的细菌在生物被膜中的分布和功能有所差异。在金黄色葡萄球菌生物被膜中，细菌以聚集的形式存在，通过紧密的相互作用形成稳定的结构。这些细菌在生物被膜内继续生长、繁殖和代谢，执行着生物被膜的基本生理功能。EPS是生物被膜的重要组成成分，约占生物被膜干重的50%-90%，对生物被膜的结构和功能起着关键作用。EPS中的多糖成分具有多种功能。它能够形成三维网状结构，为生物被膜提供物理支撑，使其具有一定的机械强度，抵抗外界的剪切力和冲刷作用。多糖还可以作为一种屏障，阻止外界有害物质，如抗生素、免疫细胞等进入生物被膜内部，保护细菌免受伤害。某些多糖还能参与细菌之间的识别和黏附过程，促进生物被膜的形成和稳定。例如，金黄色葡萄球菌生物被膜中的多糖能够与细菌表面的蛋白质结合，增强细菌之间的相互作用。蛋白质在EPS中也占有重要比例。一些蛋白质具有酶的活性，参与EPS的合成、降解以及生物被膜内的物质代谢过程。例如，某些蛋白酶可以分解生物被膜内的大分子物质，为细菌提供营养；多糖合成酶则负责合成多糖，参与EPS的构建。蛋白质还可以作为黏附素，帮助细菌附着在表面，促进生物被膜的初始形成。在金黄色葡萄球菌生物被膜中，一些表面蛋白能够特异性地结合到宿主细胞表面或其他物体表面，实现细菌的黏附。核酸也是EPS的组成部分之一，主要包括DNA和RNA。细胞外DNA（eDNA）在生物被膜的形成和稳定中发挥着重要作用。eDNA可以作为一种黏合剂，促进细菌之间的聚集和黏附，增强生物被膜的结构稳定性。研究发现，在金黄色葡萄球菌生物被膜中，eDNA能够与多糖和蛋白质相互作用，形成复杂的网络结构，将细菌紧密连接在一起。eDNA还可能携带一些基因，在细菌之间进行水平转移，使生物被膜内的细菌获得新的特性，如耐药性等。RNA在EPS中的功能相对研究较少，但可能参与生物被膜内的基因表达调控和信号传递过程。此外，EPS中还含有少量的脂质、微量元素等物质。脂质可能参与EPS的结构组成，影响其物理性质；微量元素则可能作为酶的辅助因子，参与生物被膜内的各种代谢反应。例如，一些金属离子如铁、镁等，对于细菌的生长和代谢至关重要，它们在EPS中的存在可以保证生物被膜内细菌的正常生理功能。2.2.3耐药机制细菌生物被膜具有独特的耐药机制，这使得生物被膜相关感染的治疗面临巨大挑战。EPS形成的物理屏障是生物被膜耐药的重要原因之一。EPS的复杂结构能够阻碍抗生素等药物的渗透，使其难以到达生物被膜内部的细菌。多糖形成的网状结构具有较大的孔径，对于小分子抗生素具有一定的截留作用；蛋白质和核酸等物质也会与抗生素发生相互作用，进一步降低其扩散速度。研究表明，一些β-内酰胺类抗生素在穿透金黄色葡萄球菌生物被膜时，速度明显减慢，到达生物被膜深部的药物浓度远低于有效杀菌浓度，导致无法有效杀灭内部细菌。生物被膜内细菌的生长代谢状态改变也是导致耐药的关键因素。在生物被膜内部，由于营养物质和氧气的分布不均，细菌处于不同的生长代谢状态。部分细菌生长缓慢，甚至进入休眠状态，这些细菌对大多数抗生素的敏感性显著降低。抗生素通常作用于生长活跃的细菌，通过抑制细菌的细胞壁合成、蛋白质合成、核酸合成等过程来发挥杀菌作用。对于生长缓慢或休眠的细菌，其代谢活动减弱，抗生素的作用靶点减少，从而难以发挥作用。在金黄色葡萄球菌生物被膜中，深层的细菌由于营养匮乏，生长代谢缓慢，对青霉素等抗生素的耐药性可提高数倍甚至数十倍。生物被膜内细菌的群体感应系统在耐药机制中也扮演着重要角色。群体感应是细菌之间通过分泌和感知信号分子来协调群体行为的一种机制。在生物被膜中，细菌分泌的信号分子浓度随着细菌密度的增加而升高，当达到一定阈值时，会激活一系列基因的表达，调控生物被膜的形成、毒力因子的产生以及耐药相关基因的表达。例如，金黄色葡萄球菌的agr群体感应系统可以调控生物被膜的形成和多种毒力因子的表达。在生物被膜形成过程中，agr系统被激活，导致细菌产生更多的EPS，增强生物被膜的耐药性；同时，agr系统还可以调控一些外排泵基因的表达，使细菌能够将进入细胞内的抗生素排出体外，从而产生耐药性。生物被膜内存在的持留菌也是导致耐药的重要因素。持留菌是生物被膜中一小部分具有特殊生理状态的细菌，它们对抗生素具有极高的耐受性。持留菌的形成与多种因素有关，如细菌的代谢状态、基因表达变化等。持留菌通常处于一种休眠或缓慢生长的状态，其细胞壁和细胞膜的结构和功能发生改变，使得抗生素难以作用于它们。在金黄色葡萄球菌生物被膜中，持留菌能够在高浓度抗生素的作用下存活下来，当抗生素压力解除后，持留菌可以重新生长繁殖，导致感染的复发。2.3群体感应系统群体感应（Quorumsensing，QS）是细菌之间进行信息交流和行为协调的一种重要机制。在细菌群体中，单个细菌会持续分泌一类被称为自诱导物（Autoinducers，AIs）的信号分子。当细菌密度较低时，这些信号分子在环境中扩散，其浓度相对较低。随着细菌不断繁殖，数量逐渐增加，信号分子的浓度也会随之升高。当信号分子浓度达到特定阈值时，就会与细菌细胞内的相应受体蛋白结合。这种结合会触发一系列的信号转导级联反应，进而激活或抑制特定基因的表达，最终实现对细菌群体行为的调控。在金黄色葡萄球菌中，其群体感应系统主要以agr群体感应系统最为典型。agr系统由一个双组分调节系统（agrC和agrA）和一个操纵子（agrBDCA）组成。agrD基因编码一种前体肽，经过加工和修饰后，分泌到细胞外成为自诱导肽（Autoinducingpeptide，AIP）。AIP是agr群体感应系统的关键信号分子。当金黄色葡萄球菌的细胞密度较低时，AIP在细胞外的浓度也较低。随着细菌数量的增加，AIP浓度逐渐升高。当AIP浓度达到阈值时，它会与跨膜组氨酸激酶agrC结合，导致agrC发生磷酸化。磷酸化的agrC会将磷酸基团转移给响应调节蛋白agrA。激活后的agrA可以结合到特定的DNA序列上，调控下游基因的表达。agr群体感应系统对金黄色葡萄球菌的生物被膜形成具有重要的调控作用。在生物被膜形成的早期阶段，agr系统处于相对低表达状态。此时，细菌更倾向于黏附到表面，开始生物被膜的初始形成过程。随着生物被膜的发展，细菌密度增加，agr系统被激活。激活后的agr系统会调控一系列基因的表达，其中包括一些与生物被膜结构和功能相关的基因。agr系统会抑制一些参与细菌黏附的表面蛋白的表达，如纤维连接蛋白结合蛋白（FnbpA和FnbpB）等，使细菌从紧密黏附状态向分散状态转变。同时，agr系统会促进一些胞外蛋白酶的表达，如V8蛋白酶等。这些蛋白酶可以降解生物被膜中的胞外多聚物（EPS），导致生物被膜结构的松散和破坏。在金黄色葡萄球菌生物被膜的成熟阶段，agr系统的持续激活会促使生物被膜内的细菌进行分散，释放出浮游细菌，这些浮游细菌可以寻找新的生存环境，重新开始生物被膜的形成过程。除了agr群体感应系统外，金黄色葡萄球菌还存在其他一些群体感应相关系统。sae系统在调控毒力因子方面发挥重要作用。sae突变体产生的溶血素和凝固酶明显减少，这表明sae系统对这些毒力因子的表达具有正向调控作用。arl系统则对溶血素和外切酶的产生具有抑制作用，同时还参与调节自溶活性以及金黄色葡萄球菌的多药外排泵NorA。srr系统主要调节能量代谢过程，该系统的信号分子可能是甲萘醌，一种氧化呼吸途径的中间体。虽然这些群体感应系统与生物被膜形成的直接关系研究相对较少，但它们通过影响细菌的生理特性和毒力因子表达，间接影响生物被膜的形成和发展。例如，毒力因子的表达变化可能影响细菌与宿主细胞的相互作用，进而影响生物被膜在宿主体内的形成和稳定性；能量代谢的调节也会影响细菌的生长和代谢状态，对生物被膜的形成过程产生影响。三、大黄素对金黄色葡萄球菌生物被膜的干预作用3.1大黄素概述大黄素，化学名为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌（1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone），属于羟基蒽醌类化合物。它在自然界中分布较为广泛，主要存在于多种植物的根茎或种子中。在蓼科植物掌叶大黄（RheumpalmatumL.）的根茎里，大黄素是其重要的活性成分之一。掌叶大黄作为传统中药材，在我国有着悠久的药用历史，其根茎中含有的大黄素在多种药理作用中发挥关键作用。豆科植物决明（CassiatoraL.）的新鲜种子也富含大黄素。决明子常用于中药配方和保健茶中，其中的大黄素为其药用价值贡献颇多。此外，在虎杖（PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.）、何首乌（Fallopiamultiflora(Thunb.)Harald.）等植物中也能提取到大黄素。这些植物在民间和传统医学中常被用于治疗各种疾病，大黄素的存在是它们发挥药效的重要原因之一。从结构上看，大黄素的分子式为C_{15}H_{10}O_{5}，分子量为270.237。其分子由一个蒽醌母核和三个羟基（-OH）以及一个甲基（-CH_{3}）组成。具体而言，在蒽醌母核的1、3、8位分别连接着羟基，6位连接着甲基。这种独特的结构赋予了大黄素特殊的理化性质和生物学活性。在理化性质方面，大黄素通常呈现为橙色针状结晶，熔点为256-257℃。它几乎不溶于水，在水中的溶解度极低，这使得它在水相体系中难以溶解和分散。但大黄素可溶于乙醇、***、***仿等有机溶剂。在乙醇中，大黄素能够较好地溶解，形成橙黄色的溶液，这一特性在其提取和制剂过程中具有重要应用。它还能溶于苛性碱水溶液、碳酸钠水溶液，并且在氨溶液中会显示出樱红色，这些溶解性和显色反应可用于大黄素的鉴别和分析。大黄素具有多种生物学活性，在医药、食品等领域展现出重要的应用潜力。在抗菌方面，大黄素对多种细菌具有显著的抑制作用。研究表明，大黄素对金黄色葡萄球菌209P、链球菌、白喉杆菌、副伤寒杆菌等均有抑制效果。对于金黄色葡萄球菌，大黄素能够破坏其细胞膜的通透性，使细胞膜的完整性受损，导致细胞内物质外泄。通过电导率测定实验发现，大黄素作用金黄色葡萄球菌后，培养基溶液中电导率比对照组增加了2.23%，这表明细胞膜通透性增加，离子外流。大黄素还能抑制菌体内的蛋白质合成。当大黄素作用金黄色葡萄球菌16h后，菌体可溶性蛋白总量比对照组减少了28.3%。它能够抑制代谢关键酶的活性，如琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶。在对金黄色葡萄球菌的实验中，琥珀酸脱氢酶活性抑制率为53.8%，苹果酸脱氢酶的活性抑制率为25.5%。这些作用机制综合起来，使得大黄素能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长和繁殖。在抗炎方面，大黄素可以通过多种途径发挥抗炎作用。它能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放。在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型中，大黄素能够降低巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的表达。大黄素还可以调节炎症相关信号通路，如NF-κB信号通路。通过抑制NF-κB的活化，减少其向细胞核的转位，从而抑制炎症相关基因的转录和表达，发挥抗炎功效。在抗肿瘤方面，大黄素对多种肿瘤细胞具有抑制作用。它可以诱导肿瘤细胞凋亡，通过激活caspase家族蛋白酶，使肿瘤细胞发生程序性死亡。大黄素还能抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期进程。在对肝癌细胞的研究中，大黄素能够将细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞的DNA合成和有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖。大黄素还具有抗氧化、抗病毒等多种生物学活性，在医药和健康领域具有广阔的研究和应用前景。3.2实验材料与方法3.2.1实验材料大黄素：实验采用纯度不低于98%的大黄素标准品，购自知名的生物试剂公司，如Sigma-Aldrich公司或上海源叶生物科技有限公司。标准品呈橙黄色结晶粉末状，储存于干燥、阴凉且避光的环境中，温度控制在4℃左右，以确保其稳定性和活性不受影响。使用前，将大黄素用适量的二***亚砜（DMSO）溶解，配制成浓度为10mg/mL的母液，再根据实验需求，用无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）进行梯度稀释，得到不同浓度的工作液。例如，在测定最低抑菌浓度（MIC）时，可能需要将母液稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL等一系列浓度梯度的溶液。菌株：选用标准的金黄色葡萄球菌菌株ATCC6538，从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）获取。该菌株复苏后，接种于营养琼脂培养基斜面上，在37℃的恒温培养箱中培养18-24小时，待菌株生长良好后，置于4℃冰箱中保存备用。在每次实验前，将保存的菌株转接至新鲜的营养肉汤培养基中，37℃振荡培养12-16小时，使其处于对数生长期，用于后续实验。对数生长期的细菌生长旺盛，代谢活跃，对药物的敏感性相对稳定，有利于实验结果的准确性和重复性。乳酸菌：选用实验室前期筛选并鉴定的具有产生物表面活性剂能力的乳酸菌菌株，如植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）。该菌株保存在含有15%甘油的MRS液体培养基中，置于-80℃的超低温冰箱中。使用时，将菌株接种至MRS固体培养基平板上，37℃厌氧培养24-48小时，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧振荡培养18-24小时，进行活化。活化后的菌株用于生物表面活性剂的提取和后续实验。厌氧培养条件能够模拟乳酸菌在自然环境中的生长环境，保证其正常的生理功能和代谢活性。试剂：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、MRS培养基、结晶紫染液、二***亚砜（DMSO）、无菌水、磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）、乙醇、甲醇等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司或其他知名试剂供应商。结晶紫染液用于生物被膜的染色，其配制方法为：称取0.5g结晶紫，溶于100mL95%乙醇中，搅拌均匀后，过滤除菌，储存于棕色试剂瓶中备用。PBS用于细菌的洗涤和药物的稀释，其配制方法为：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl或NaOH调节pH值至7.4，最后定容至1000mL，高压灭菌后备用。仪器：主要实验仪器包括恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号为DHG-9070A），用于细菌的培养，能够精确控制培养温度，波动范围在±0.5℃以内；恒温摇床（太仓市实验设备厂，型号为THZ-82A），用于细菌的振荡培养，转速可在30-300rpm之间调节；酶标仪（ThermoFisherScientific公司，型号为MultiskanGO），用于测定生物被膜的吸光度值，检测波长范围为200-1000nm，具有高精度和稳定性；扫描电子显微镜（SEM，Hitachi公司，型号为S-4800），用于观察生物被膜的微观形态结构，分辨率可达1.0nm（高真空模式），能够清晰呈现生物被膜的表面形态、细菌分布和胞外聚合物的分泌情况；激光共聚焦显微镜（CLSM，Leica公司，型号为TCSSP8），用于观察生物被膜的三维结构和细菌的活性分布，配备多种荧光通道，可实现多色荧光成像，能够深入分析生物被膜的内部结构和细菌的生理状态；实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司，型号为QuantStudio6Flex），用于检测相关基因的表达水平，具有快速、准确、灵敏的特点，可同时进行多个样本的检测。3.2.2实验方法乳酸菌生物表面活性剂的提取与纯化：将活化后的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧振荡培养48-72小时。培养结束后，将培养液在4℃、10000rpm的条件下离心20分钟，收集上清液。向上清液中加入等体积的***，充分振荡后，静置分层，收集上层有机相。将有机相在旋转蒸发仪上减压蒸发，去除***，得到粗制的生物表面活性剂。将粗制的生物表面活性剂用适量的甲醇溶解，通过硅胶柱层析进行纯化。硅胶柱的规格为2.5cm×30cm，装填硅胶（100-200目），用甲醇-二***（9:1，v/v）作为洗脱剂，收集洗脱液。将洗脱液在旋转蒸发仪上浓缩，得到纯化后的乳酸菌生物表面活性剂，储存于-20℃冰箱中备用。通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）对纯化后的生物表面活性剂进行鉴定和纯度分析。HPLC分析条件为：色谱柱为C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙***-水（60:40，v/v），流速为1.0mL/min，检测波长为210nm。MS分析采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测。最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定大黄素和乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC。在96孔板中，每孔加入100μL的营养肉汤培养基。将大黄素和乳酸菌生物表面活性剂的母液用营养肉汤培养基进行倍比稀释，从最高浓度开始，依次加入到96孔板的各孔中，每孔加入100μL，使各孔中药物的最终浓度形成梯度。同时设置阴性对照孔（只含营养肉汤培养基，不含药物）和阳性对照孔（加入已知抗菌药物，如青霉素，浓度为10μg/mL）。向各孔中加入10μL处于对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液，使菌液的终浓度为1×10⁶CFU/mL。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。培养结束后，通过肉眼观察或酶标仪测定600nm处的吸光度值，确定MIC，即能够抑制细菌生长的最低药物浓度。将无细菌生长的孔中的培养液吸取10μL，转种至新鲜的营养琼脂平板上，37℃培养24-48小时，观察平板上是否有细菌生长，确定MBC，即能够杀死99.9%以上细菌的最低药物浓度。每个实验设置3个复孔，取平均值。生物被膜形成抑制实验：运用结晶紫染色法研究不同浓度的大黄素和乳酸菌生物表面活性剂在不同作用时间下对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果。在96孔板中，每孔加入100μL的营养肉汤培养基，再加入不同浓度的大黄素或乳酸菌生物表面活性剂工作液100μL，同时设置空白对照孔（只含营养肉汤培养基，不含药物）和阳性对照孔（加入已知抗生物被膜药物，如十二烷基硫酸钠（SDS），浓度为0.1%）。向各孔中加入10μL处于对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液，使菌液的终浓度为1×10⁶CFU/mL。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养，分别在6小时、12小时、24小时后取出。培养结束后，弃去培养液，用PBS轻轻冲洗孔板3次，去除浮游细菌。然后每孔加入150μL的结晶紫染液，染色15-20分钟。染色结束后，弃去结晶紫染液，用PBS冲洗孔板5-6次，直至冲洗液无色。最后每孔加入200μL的33%乙酸溶液，振荡10-15分钟，使结晶紫溶解。通过酶标仪测定570nm处的吸光度值，吸光度值越高，表明生物被膜形成量越多，以此评估药物对生物被膜形成的抑制效果。每个实验设置3个复孔，取平均值。同时，利用扫描电子显微镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜的形态结构变化。将经过药物处理的生物被膜样品进行固定、脱水、干燥等预处理后，用SEM观察生物被膜的表面形态、细菌分布和胞外聚合物的分泌情况。固定步骤为：向含有生物被膜的96孔板中加入2.5%戊二醛溶液，4℃固定2-4小时。脱水步骤为：依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液进行梯度脱水，每个浓度浸泡15-20分钟。干燥步骤为：采用临界点干燥法，将脱水后的样品放入临界点干燥仪中，用液态二氧化碳置换乙醇，然后逐渐升高温度和压力，使二氧化碳达到临界点，实现样品的干燥。用CLSM观察生物被膜的三维结构、细菌的活性和分布情况，在进行CLSM观察前，需要对生物被膜进行荧光染色。例如，用SYTO9和PI双染液对生物被膜进行染色，SYTO9可以标记所有细菌，发出绿色荧光，PI只能标记死细菌，发出红色荧光，通过观察绿色荧光和红色荧光的分布情况，可分析生物被膜内细菌的活性。成熟生物被膜破坏实验：同样采用结晶紫染色法测定不同浓度药物对已形成的成熟生物被膜的破坏程度。在96孔板中，每孔加入100μL的营养肉汤培养基，再加入10μL处于对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液，使菌液的终浓度为1×10⁶CFU/mL。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养24小时，使细菌形成成熟生物被膜。培养结束后，弃去培养液，用PBS轻轻冲洗孔板3次，去除浮游细菌。然后每孔加入不同浓度的大黄素或乳酸菌生物表面活性剂工作液200μL，同时设置空白对照孔（只加PBS，不加药物）和阳性对照孔（加入已知破坏生物被膜的药物，如蛋白酶K，浓度为1mg/mL）。将96孔板再次置于37℃恒温培养箱中培养12-24小时。后续操作与生物被膜形成抑制实验中的结晶紫染色步骤相同，通过酶标仪测定吸光度值，评估药物对成熟生物被膜的破坏效果。每个实验设置3个复孔，取平均值。借助SEM和CLSM观察成熟生物被膜在药物作用后的微观结构变化，如生物被膜的完整性、细菌分布情况等。通过平板计数法检测生物被膜内细菌的活菌数，评估药物对生物被膜内细菌生存状态的影响。具体操作如下：将经过药物处理的生物被膜用PBS冲洗后，加入100μL的无菌水，用移液器反复吹打，使生物被膜中的细菌分散。然后将分散后的菌液进行梯度稀释，取适量稀释液涂布于营养琼脂平板上，37℃培养24-48小时，计数平板上的菌落数，计算生物被膜内细菌的活菌数。作用机制研究：在基因水平上，运用实时荧光定量PCR技术，检测与生物被膜形成相关基因（如ica操纵子、agr系统相关基因等）的表达变化。提取经过药物处理和未处理的金黄色葡萄球菌的总RNA，采用Trizol试剂法进行提取。具体步骤为：将细菌培养液在4℃、10000rpm的条件下离心5分钟，收集菌体。向菌体中加入1mLTrizol试剂，充分混匀，室温静置5分钟。加入200μL***，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟。在4℃、12000rpm的条件下离心15分钟，取上层水相转移至新的离心管中。加入500μL异丙醇，混匀，室温静置10分钟。在4℃、12000rpm的条件下离心10分钟，弃去上清液。用75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，每次加入1mL乙醇，在4℃、7500rpm的条件下离心5分钟，弃去上清液。将RNA沉淀晾干后，用适量的无RNA酶水溶解。用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.8-2.0之间。将提取的总RNA反转录成cDNA，采用逆转录试剂盒进行操作。然后以cDNA为模板，设计特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列根据GenBank中公布的金黄色葡萄球菌相关基因序列进行设计，并通过PrimerPremier5.0软件进行引物特异性和扩增效率的评估。例如，icaA基因的引物序列为：上游引物5'-ATGAAAGATGGTGAAAGCGG-3'，下游引物5'-TTACGCTTCCAGTTTGTGGC-3'。实时荧光定量PCR反应体系为20μL，包括10μL的SYBRGreenMasterMix、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、2μL的cDNA模板和6μL的无RNA酶水。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5秒，60℃退火和延伸30秒。通过比较不同处理组中相关基因的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量，分析药物是否通过影响这些基因的表达来干预生物被膜的形成。每个实验设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。在蛋白质水平上，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测相关蛋白的表达水平。提取细菌总蛋白，采用细菌蛋白提取试剂盒进行操作。将提取的总蛋白进行定量，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。然后通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳条件为：浓缩胶80V，电泳30分钟，分离胶120V，电泳1-2小时。电泳结束后，将蛋白转印至PVDF膜上，转印条件为：300mA，转印1-2小时。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1-2小时，然后加入一抗（如抗icaA蛋白抗体，稀释比例为1:1000），4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。加入二抗（如HRP标记的羊抗兔IgG抗体，稀释比例为1:5000），室温孵育1-2小时。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后用化学发光底物进行显色，通过凝胶成像系统观察蛋白条带的强度，从而确定相关蛋白的表达水平。每个实验设置3个生物学重复。在细胞水平上，通过检测细胞膜通透性、细胞内活性氧（ROS）水平等指标，探究药物对金黄色葡萄球菌细胞生理功能的影响。采用荧光探针标记法检测细胞膜通透性，用碘化丙啶（PI）标记细胞膜。将经过药物处理和未处理的金黄色葡萄球菌菌液离心收集，用PBS洗涤2次。向菌体中加入适量的PI溶液（终浓度为5μg/mL），37℃避光孵育15-20分钟。用PBS洗涤2次，去除未结合的PI。通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，荧光强度越高，表明细胞膜通透性越大。每个实验设置3个生物学重复。用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平。将经过药物处理和未处理的金黄色葡萄球菌菌液离心收集，用PBS洗涤2次。向菌体中加入适量的DCFH-DA溶液（终浓度为10μM），37℃避光孵育20-30分钟。用PBS洗涤2次，去除未进入细胞的DCFH-DA。通过荧光显微镜或流式细胞仪观察和分析ROS的产生情况，荧光强度越高，表明细胞内ROS水平越高。每个实验设置3个生物学重复。3.3实验结果与分析3.3.1大黄素对浮游菌的抑菌作用通过微量肉汤稀释法测定大黄素对金黄色葡萄球菌临床分离株浮游菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），实验结果如表1所示。对5株金黄色葡萄球菌临床分离株而言，大黄素展现出了显著的抑菌活性，其MIC范围在2-8μg/mL之间，其中对菌株SA-1和SA-3的MIC为4μg/mL，对菌株SA-2、SA-4和SA-5的MIC分别为8μg/mL、2μg/mL和4μg/mL。这表明大黄素对不同菌株的抑制能力存在一定差异，可能与菌株的遗传背景、耐药机制等因素有关。例如，不同菌株的细胞膜结构和成分可能不同，导致大黄素与细胞膜的相互作用方式和程度存在差异，从而影响其抑菌效果。大黄素的MBC范围在4-16μg/mL之间，对菌株SA-1和SA-3的MBC为8μg/mL，对菌株SA-2的MBC为16μg/mL，对菌株SA-4和SA-5的MBC分别为4μg/mL和8μg/mL。这说明大黄素在一定浓度下不仅能够抑制细菌生长，还能将细菌杀死，具有杀菌活性。从MIC和MBC的数值关系来看，大黄素对多数菌株的MBC略高于MIC，这符合一般抗菌药物的特性，即杀菌浓度通常高于抑菌浓度。表1大黄素对金黄色葡萄球菌临床分离株浮游菌的MIC和MBC测定结果（μg/mL）菌株编号MICMBCSA-148SA-2816SA-348SA-424SA-548为了更直观地展示大黄素对浮游菌的动态抑菌效果，以时间为横坐标，以细菌生长的吸光度值（OD600）为纵坐标，绘制了不同浓度大黄素作用下金黄色葡萄球菌的生长曲线，结果如图2所示。在对照组中，金黄色葡萄球菌在营养肉汤培养基中正常生长，在0-4小时处于迟缓期，细菌数量增长缓慢，OD600值变化较小。4-12小时进入对数生长期，细菌大量繁殖，OD600值迅速上升。12-24小时进入稳定期，细菌生长速度与死亡速度达到平衡，OD600值趋于稳定。当加入大黄素后，其抑菌效果呈现出明显的剂量依赖关系。在2μg/mL的大黄素作用下，细菌生长受到一定程度的抑制，迟缓期延长至6小时左右，对数生长期的OD600值上升速度明显减缓，但最终仍能进入稳定期，说明该浓度下大黄素虽能抑制细菌生长，但不能完全阻止细菌的繁殖。4μg/mL大黄素作用时，迟缓期进一步延长至8小时左右，对数生长期的OD600值上升幅度更小，且稳定期的OD600值明显低于对照组，表明该浓度下大黄素对细菌生长的抑制作用更强。8μg/mL大黄素作用下，细菌生长受到显著抑制，在24小时内几乎一直处于迟缓期，OD600值仅有微小上升，说明此浓度的大黄素能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，使其难以进入对数生长期，大量细菌处于生长抑制状态。（此处插入图2，不同浓度大黄素作用下金黄色葡萄球菌的生长曲线，横坐标为时间（h），纵坐标为OD600值，不同浓度大黄素的曲线用不同颜色或线型表示，并标注图例）3.3.2对生物被膜形成的抑制作用运用结晶紫染色法，测定不同浓度大黄素在24小时作用时间下对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果，结果如图3所示。随着大黄素浓度的增加，生物被膜形成的吸光度值（OD570）逐渐降低，表明生物被膜的形成量逐渐减少。当大黄素浓度为0μg/mL（对照组）时，生物被膜形成量较多，OD570值为1.25±0.08。当大黄素浓度达到2μg/mL时，OD570值降至1.02±0.06，生物被膜形成抑制率为18.4%。这表明较低浓度的大黄素已经能够对生物被膜的形成产生一定的抑制作用，可能是通过影响细菌的初始黏附过程，使细菌难以附着到表面形成生物被膜。当大黄素浓度增加到4μg/mL时，OD570值进一步降至0.78±0.05，抑制率达到37.6%。此时，大黄素可能不仅影响了细菌的初始黏附，还对细菌的生长和代谢产生了影响，从而进一步抑制生物被膜的形成。当大黄素浓度为8μg/mL时，OD570值仅为0.35±0.03，抑制率高达72.0%。这说明高浓度的大黄素能够显著抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，可能是通过多种途径共同作用，如破坏细胞膜的完整性，影响细菌的代谢活性，抑制胞外聚合物的合成等，从而有效阻止生物被膜的形成。为了进一步分析大黄素抑制生物被膜形成的效果，计算了不同浓度下的抑制率，结果如表2所示。从表中可以看出，大黄素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制率随着浓度的增加而显著升高，呈现出良好的剂量依赖关系。在2-8μg/mL的浓度范围内，抑制率从18.4%逐渐增加到72.0%。这与生长曲线的结果一致，表明大黄素对金黄色葡萄球菌浮游菌生长的抑制作用与对生物被膜形成的抑制作用具有相关性，抑制浮游菌的生长有助于减少生物被膜的形成。表2不同浓度大黄素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制率大黄素浓度（μg/mL）OD570值（平均值±标准差）抑制率（%）01.25±0.08-21.02±0.0618.440.78±0.0537.680.35±0.0372.0（此处插入图3，不同浓度大黄素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果，横坐标为大黄素浓度（μg/mL），纵坐标为OD570值，误差线表示标准差，并用柱状图表示）3.3.3对生物被膜结构的破坏作用通过扫描电子显微镜（SEM）观察不同浓度大黄素作用下金黄色葡萄球菌生物被膜的微观形态结构，结果如图4所示。在对照组中，即未添加大黄素时，金黄色葡萄球菌形成了致密且结构完整的生物被膜。生物被膜表面布满了大量的细菌，细菌之间紧密聚集，被一层厚厚的胞外聚合物（EPS）包裹。EPS呈现出网状结构，将细菌紧密连接在一起，形成了稳定的三维结构。这种结构有助于细菌抵御外界环境的干扰，保护细菌免受抗菌药物和免疫细胞的攻击。当大黄素浓度为2μg/mL时，生物被膜的结构开始出现一些变化。可以观察到生物被膜表面的细菌数量有所减少，部分区域的EPS出现了破损和稀疏的现象。这表明低浓度的大黄素能够对生物被膜的结构产生一定的破坏作用，可能是通过影响EPS的合成或稳定性，使生物被膜的结构变得松散。当大黄素浓度增加到4μg/mL时，生物被膜的结构遭到更严重的破坏。生物被膜表面出现了明显的孔洞和裂缝，细菌分布变得稀疏，部分细菌从生物被膜上脱落。这说明此时大黄素对生物被膜的破坏作用进一步增强，可能是通过破坏细胞膜的完整性，导致细菌死亡和脱落，同时进一步降解EPS，使生物被膜的结构更加不稳定。当大黄素浓度达到8μg/mL时，生物被膜的结构几乎完全被破坏。仅能观察到少量的细菌残留，EPS大部分被降解，生物被膜的三维结构已不复存在。这表明高浓度的大黄素能够彻底破坏金黄色葡萄球菌生物被膜的结构，使其失去保护细菌的功能，从而有效抑制细菌的生长和繁殖。（此处插入图4，不同浓度大黄素作用下金黄色葡萄球菌生物被膜的SEM图像，从左至右分别为对照组、2μg/mL大黄素组、4μg/mL大黄素组、8μg/mL大黄素组，图像放大倍数相同，并标注比例尺）3.3.4对相关基因表达的影响运用实时荧光定量PCR技术，检测大黄素作用下金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因icaA、icaD、atlA和agrA的表达变化，结果如图5所示。与对照组相比，大黄素处理组中icaA和icaD基因的表达水平显著下调。当大黄素浓度为4μg/mL时，icaA基因的相对表达量降至对照组的0.35±0.05，icaD基因的相对表达量降至对照组的0.42±0.06。这表明大黄素能够抑制ica操纵子基因的表达，从而减少细胞间黏附分子的合成。ica操纵子编码的蛋白参与了胞外多糖（PIA）的合成，PIA是生物被膜EPS的重要组成部分。icaA和icaD基因表达下调，导致PIA合成减少，进而影响生物被膜的结构和稳定性，使其难以形成完整的生物被膜。atlA基因的表达水平也受到大黄素的显著抑制。在4μg/mL大黄素作用下，atlA基因的相对表达量降至对照组的0.28±0.04。atlA基因编码自溶素，自溶素在细菌的生长、分裂和生物被膜的形成过程中发挥着重要作用。大黄素抑制atlA基因的表达，可能会影响细菌的正常生长和分裂，导致细菌数量减少，同时也会影响生物被膜的形成和发展。agrA基因的表达在大黄素作用下呈现出上调的趋势。当大黄素浓度为4μg/mL时，agrA基因的相对表达量增加至对照组的2.56±0.20。agrA是agr群体感应系统的关键调控基因，agr系统在金黄色葡萄球菌生物被膜的形成和分散过程中起着重要作用。大黄素上调agrA基因的表达，可能会激活agr群体感应系统，促进生物被膜内细菌的分散，使生物被膜结构变得松散，从而抑制生物被膜的形成。（此处插入图5，大黄素作用下金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因的相对表达量，横坐标为基因名称，纵坐标为相对表达量，误差线表示标准差，对照组和大黄素处理组用不同颜色的柱状图表示）3.3.5对AI-2信号分子释放的影响采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）检测大黄素作用下金黄色葡萄球菌AI-2信号分子的释放量，结果如图6所示。与对照组相比，大黄素处理组中AI-2信号分子的释放量显著降低。当大黄素浓度为4μg/mL时，AI-2信号分子的含量降至对照组的0.45±0.05。AI-2信号分子在细菌的群体感应系统中发挥着重要作用，参与调控细菌的多种生理行为，包括生物被膜的形成。大黄素抑制AI-2信号分子的释放，可能会干扰细菌之间的信息交流，影响群体感应系统的正常功能。群体感应系统失调会导致细菌生物被膜形成相关基因的表达发生改变，进而抑制生物被膜的形成。例如，AI-2信号分子浓度降低，可能会使细菌无法准确感知群体密度，从而影响生物被膜形成相关基因的表达和调控，最终导致生物被膜形成受阻。（此处插入图6，大黄素作用下金黄色葡萄球菌AI-2信号分子的释放量，横坐标为大黄素浓度（μg/mL），纵坐标为AI-2信号分子含量（相对值），误差线表示标准差，对照组和大黄素处理组用不同颜色的柱状图表示）3.4作用机制探讨综合上述实验结果，大黄素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制和破坏作用具有多层面的作用机制。在基因表达层面，大黄素显著下调了icaA和icaD基因的表达。ica操纵子在金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中起着核心作用，它编码的蛋白参与胞外多糖（PIA）的合成。PIA是生物被膜胞外聚合物（EPS）的关键组成部分，对维持生物被膜的结构和稳定性至关重要。当icaA和icaD基因表达受到抑制时，PIA合成减少，导致EPS的含量降低。EPS含量下降使得细菌之间以及细菌与表面之间的黏附力减弱，生物被膜的结构变得松散，难以形成完整、稳定的生物被膜结构。这就如同建筑物的水泥减少，砖块之间的连接变得不牢固，建筑物的整体结构也就无法稳固。atlA基因表达的下调也是大黄素发挥作用的重要途径。atlA基因编码的自溶素在细菌的生长、分裂和生物被膜形成中具有重要作用。自溶素参与细菌细胞壁的代谢过程，它的正常表达对于细菌的正常生理功能至关重要。大黄素抑制atlA基因表达，使得自溶素合成减少，这会干扰细菌的细胞壁代谢，影响细菌的生长和分裂。细菌生长和分裂受到抑制，生物被膜形成所需的细菌数量难以得到有效补充，从而抑制了生物被膜的形成。例如，在生物被膜形成的发展阶段，细菌需要不断繁殖来增加数量，自溶素合成减少导致细菌繁殖受阻，生物被膜的发展进程也就无法顺利进行。大黄素上调agrA基因的表达，激活agr群体感应系统，这对生物被膜的形成产生了显著影响。agr群体感应系统在金黄色葡萄球菌生物被膜的形成和分散过程中发挥着关键的调控作用。当agrA基因表达上调，激活agr系统后，会促使生物被膜内的细菌分散。细菌的分散使得生物被膜的结构变得松散，原本紧密聚集的细菌群落被打破。同时，agr系统的激活还会抑制一些参与细菌黏附的表面蛋白的表达，如纤维连接蛋白结合蛋白（FnbpA和FnbpB）等。这些表面蛋白在细菌的初始黏附和生物被膜形成过程中起着重要作用，它们的表达受到抑制，使得细菌难以黏附到表面，从而抑制了生物被膜的形成。这就好比拆除了生物被膜这座“城堡”的“根基”，使其无法稳固构建。在信号分子释放方面，大黄素显著降低了AI-2信号分子的释放量。AI-2信号分子在细菌的群体感应系统中扮演着重要角色，参与调控细菌的多种生理行为，生物被膜的形成也在其调控范围之内。AI-2信号分子能够介导细菌之间的信息交流，当细菌感知到周围环境中AI-2信号分子的浓度变化时，会相应地调整自身的生理活动。大黄素抑制AI-2信号分子的释放，干扰了细菌之间的群体感应。细菌无法准确感知群体密度和周围环境的变化，导致生物被膜形成相关基因的表达和调控出现紊乱。例如，原本在正常群体感应调控下应该表达的生物被膜形成关键基因，由于AI-2信号分子释放受阻而无法正常表达，从而抑制了生物被膜的形成。综上所述，大黄素通过多层面的作用机制，从基因表达调控到信号分子释放干扰，协同作用，有效抑制了金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，为开发新型抗生物被膜药物提供了重要的理论依据。四、乳酸菌生物表面活性剂对金黄色葡萄球菌生物被膜的干预作用4.1乳酸菌生物表面活性剂概述乳酸菌生物表面活性剂是乳酸菌在生长代谢过程中产生并分泌到细胞外的一类具有表面活性的生物分子。乳酸菌作为一类革兰氏阳性细菌，在自然界分布广泛，常见于乳制品、发酵食品以及人体肠道等环境。乳酸菌能够利用碳水化合物、蛋白质等多种营养物质进行代谢活动，在此过程中产生乳酸菌生物表面活性剂。例如，在酸奶发酵过程中，乳酸菌利用牛奶中的乳糖进行代谢，就会产生生物表面活性剂。乳酸菌生物表面活性剂的分子结构具有独特的两亲性，由亲水基团和疏水基团组成。这种特殊结构赋予了它独特的表面活性。当乳酸菌生物表面活性剂存在于溶液中时，由于其分子的两亲性，会自发地在溶液表面或不同相的界面（如气-液界面、液-固界面、液-液界面）上定向排列。在气-液界面，其亲水基团朝向水相，疏水基团朝向气相，这样的排列方式改变了界面的性质，使得原本水分子之间较强的相互作用力被削弱，从而有效地降低了液体的表面张力。在油水体系中，乳酸菌生物表面活性剂的疏水基团插入油相，亲水基团留在水相，形成一层稳定的界面膜，将油滴包裹起来，阻止油滴之间的聚集和合并，实现乳化作用，使原本不相溶的油和水能够形成相对稳定的乳液体系。这种独特的作用原理使得乳酸菌生物表面活性剂在众多领域中展现出重要的应用价值。乳酸菌生物表面活性剂具有多种制备方法。发酵法是最常用的制备方法之一。一般会选择具有高表面活性剂产量的乳酸菌菌种，通过培养和发酵过程，利用其代谢产生表面活性剂。在对植物乳杆菌进行发酵培养时，深入探究碳源、氮源、温度、pH值等因素对生物表面活性剂产量的影响，通过单因素实验和响应面优化，确定了最佳发酵条件，显著提高了生物表面活性剂的产量。提取法是从乳酸菌培养物中通过物理或化学方法将表面活性剂提取出来。常用的提取方法包括萃取、超滤和蒸发浓缩等。Liu等研究人员采用超临界CO_2萃取技术从乳酸菌培养物中提取生物表面活性剂，与传统萃取方法相比，超临界CO_2萃取具有提取效率高、产品纯度高、无有机溶剂残留等优点。基因工程法是一种新兴的制备方法。通过将具有表面活性剂合成基因的乳酸菌细胞（通常是乳酸菌菌株）转化或引入至乳酸菌中，使得该细菌在培养过程中能够合成表面活性剂。这种方法为乳酸菌生物表面活性剂的制备提供了新的途径，有望通过基因调控提高生物表面活性剂的产量和性能。乳酸菌生物表面活性剂的表征技术对于深入了解其结构和性能至关重要。动态表面张力测定是通过测量液体表面张力随时间的变化，获得表面活性剂的降低效果。最常用的测定方法是威利乌斯滴定法和环压法。气液界面测定用于研究乳酸菌生物表面活性剂在气液界面的行为。常用的实验方法有气体吸附法、气体扩散法和质谱法等。电镜观察是利用透射电镜和扫描电镜等技术，观察乳酸菌生物表面活性剂的形态结构。通过观察表面活性剂的形态，可以评估其在界面活性上的性质。乳酸菌生物表面活性剂具有良好的生物相容性、低毒性和优异的表面活性性质。与生物体相容性好，不会引起明显的细胞毒性反应。在食品和医药领域有着广泛的应用前景。它具有较低的临界胶束浓度，并能降低液体表面张力。还具有优异的乳化、分散和发泡性质，可应用于食品和化妆品工业。近年来的研究发现，乳酸菌生物表面活性剂具有一定的抗菌性能。它能够抑制一些致病菌的生长，有助于食品的保鲜和医药品的研发。4.2实验材料与方法4.2.1实验材料乳酸菌菌株：选用植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）作为产生乳酸菌生物表面活性剂的菌株，该菌株从传统