NK细胞培养标准操作流程(SOP)

自然杀伤（NaturalKiller,NK）细胞作为固有免疫的核心效应细胞，在肿瘤免疫监视、抗病毒感染及免疫调节中发挥关键作用。规范化的NK细胞培养流程是保障细胞质量、实现其基础研究与临床转化应用的前提。本标准操作流程（SOP）结合细胞生物学原理与实践经验，系统阐述NK细胞的分离、培养、扩增及鉴定方法，为科研及临床机构提供可重复、标准化的操作指引。一、目的建立NK细胞体外分离、培养、扩增及鉴定的标准化流程，确保细胞活性、纯度及功能的稳定性，满足基础研究（如免疫机制探索）或临床转化（如细胞治疗产品制备）的质量要求。二、适用范围本SOP适用于生物医学实验室、细胞治疗研发机构及临床转化平台开展外周血、脐带血或干细胞来源的NK细胞体外培养与扩增操作。三、操作前准备（一）试剂与耗材准备1.培养基：选择无血清或低血清的NK细胞专用培养基（如NKMACS培养基、或自配含必需氨基酸、维生素、葡萄糖的基础培养基），添加细胞因子（如IL-2、IL-15、IL-12等，浓度根据实验方案优化）。2.分离试剂：淋巴细胞分离液（密度梯度离心法分离PBMC）、肝素钠（外周血抗凝，浓度以维持血液液态且不影响细胞活性为宜）。3.培养耗材：无菌培养瓶/板（根据细胞规模选择规格）、移液管、离心管、注射器（过滤细胞悬液时使用）、流式管（鉴定用）。4.功能试剂：流式抗体（CD56-PE、CD3-FITC等表型鉴定抗体）、细胞毒性检测试剂（如Calcein-AM、LDH检测试剂盒）、ELISA细胞因子检测试剂盒（IFN-γ、TNF-α等）。（二）仪器设备准备1.培养设备：CO₂培养箱（设置温度37℃、CO₂浓度5%、湿度饱和，使用前验证参数稳定性）。2.分离与检测设备：低速离心机（离心力≤400g，避免细胞损伤）、生物安全柜（操作前紫外消毒30分钟，风速验证合格）、倒置显微镜（观察细胞形态）、流式细胞仪（表型与功能鉴定）、超低温冰箱（-80℃保存细胞或试剂）。（三）环境与人员准备1.环境消毒：实验前用75%乙醇擦拭生物安全柜台面、离心机转子及显微镜载物台；实验室开启紫外线消毒1小时（操作前关闭）。2.人员防护：操作人员穿戴无菌实验服、口罩、帽子、手套，操作前用洗手液或75%乙醇消毒双手，进入生物安全柜前通过风淋装置去除浮尘。四、NK细胞分离（以外周血PBMC为例）（一）样本处理采集外周血（肝素抗凝），室温静置30分钟（避免剧烈振荡），待血液自然分层后，吸取上层血浆（可冻存备用），剩余血液与等体积PBS（含2%FBS）混合，制备细胞悬液。（二）密度梯度离心将淋巴细胞分离液（密度1.077g/ml）缓慢加入离心管底部（体积为血液-PBS混合液的1/2），再沿管壁缓慢叠加细胞悬液（保持液层分明）。设置离心机参数：300g，室温离心20分钟（无刹车，避免细胞层紊乱）。（三）PBMC收集与洗涤离心后，管内分为四层：上层血浆、中间白膜层（PBMC）、分离液层、红细胞层。用移液器吸取白膜层（PBMC），转移至新离心管，加入5倍体积的PBS（含2%FBS），轻柔吹打混匀，300g离心10分钟，弃上清。重复洗涤2次，最终用培养基重悬细胞。（四）细胞活力检测取10μl细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合，静置3分钟后镜下计数。活细胞率应≥90%（死细胞呈蓝色，活细胞透明）；若活细胞率＜85%，需重新分离或优化操作。五、NK细胞培养与扩增（一）初始培养调整细胞浓度至1×10⁶cells/ml（或根据培养体系优化），接种于培养瓶/板，加入含细胞因子的培养基（如IL-2终浓度500U/ml、IL-15终浓度20ng/ml，浓度需预实验验证）。置于37℃、5%CO₂培养箱，每日观察细胞形态（倒置显微镜下，NK细胞初期为圆形，增殖后逐渐聚集成团）。（二）半量换液（第2-3天）培养24-48小时后，细胞开始增殖，培养基出现轻微浑浊。轻柔加入新鲜培养基（含同等浓度细胞因子），换液体积为原体积的1/2（避免过度稀释细胞），继续培养。（三）扩增培养（第4-14天）当细胞密度达到5×10⁶cells/ml（或显微镜下细胞聚集明显），进行传代或扩大培养：1.传代：将细胞悬液转移至离心管，300g离心10分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，按1:2或1:3比例接种于新培养容器（根据细胞生长速度调整）。2.饲养细胞辅助扩增（可选）：若需快速扩增，可添加辐照后的K562细胞（辐照剂量使细胞失去增殖能力但保留刺激活性），按NK细胞:饲养细胞=1:1的比例共培养，促进NK细胞增殖（饲养细胞需提前用丝裂霉素C或γ射线处理）。（四）培养终止培养7-14天后（根据细胞生长曲线），NK细胞数量可扩增____倍。此时收集细胞，进行表型与功能鉴定。六、NK细胞鉴定（一）表型鉴定（流式细胞术）1.取1×10⁶cells，加入流式管，300g离心5分钟，弃上清。2.加入荧光标记的CD56-PE、CD3-FITC抗体（按说明书稀释，避光孵育20分钟，室温）。3.加入2mlPBS洗涤，300g离心5分钟，弃上清，加入300μlPBS重悬，上流式细胞仪检测。4.分析结果：NK细胞表型为CD56⁺CD3⁻，纯度应≥80%（科研级）或≥90%（临床级）。（二）功能鉴定（细胞毒性实验）1.靶细胞标记：取肿瘤细胞（如K562），用Calcein-AM染液标记（37℃孵育30分钟，PBS洗涤2次），调整浓度至1×10⁵cells/ml。2.效靶共培养：按效靶比（NK细胞:靶细胞）1:1、5:1、10:1接种于96孔板，37℃、5%CO₂培养4小时。3.检测细胞毒性：离心收集上清，用LDH检测试剂盒测定靶细胞裂解率（或用AnnexinV/PI双染检测凋亡率），计算杀伤率（杀伤率=（实验组OD-自然释放组OD）/（最大释放组OD-自然释放组OD）×100%）。（三）细胞因子分泌检测（ELISA）收集培养上清，按ELISA试剂盒说明书操作，检测IFN-γ、TNF-α等细胞因子浓度，反映NK细胞活化状态。七、注意事项（一）无菌操作所有试剂、耗材需经灭菌处理（培养基过滤除菌，耗材高压灭菌）；操作全程在生物安全柜内进行，避免说话、咳嗽污染；培养箱定期用75%乙醇擦拭，每月更换托盘水（加入抗生素避免污染）。（二）细胞活力维护离心转速≤400g，时间≤15分钟（避免细胞机械损伤）；换液时轻柔吹打，避免产生气泡或过度剪切力；细胞因子现配现用，避免反复冻融（分装后-80℃保存）。（三）培养环境稳定CO₂培养箱每日监测温度、CO₂浓度（误差≤0.5℃、0.1%）；培养基每2-3天更换一次（根据细胞密度调整，密度高时缩短换液周期）；避免频繁开启培养箱，减少温度波动（每次操作不超过3分钟）。八、质量控制（一）过程控制每批细胞培养前，取培养基培养24小时，确认无细菌、真菌污染；培养第3、7、14天，镜下观察细胞形态（如聚团、增殖速度），记录生长曲线；流式鉴定时，设置同型对照，确保抗体特异性。（二）终产品控制细胞纯度：CD56⁺CD3⁻细胞比例≥80%（科研）或≥90%（临床）；细胞活性：台盼蓝染色活细胞率≥90%；细胞毒性：效靶比10:1时，杀伤率≥50%（针对K562细胞）；微生物检测：支原体、细菌、真菌检测均为阴性。九、常见问题及解决（一）细胞污染细菌污染：培养基浑浊、镜下见运动细菌→立即丢弃，更换所有耗材，培养箱用甲醛熏蒸；真菌污染：培养基出现菌丝→丢弃细胞，消毒培养箱，更换培养基和血清；支原体污染：细胞生长缓慢、镜下无明显污染→用支原体检测试剂盒确认，阳性则添加支原体清除试剂（如Mynox）或丢弃细胞。（二）细胞增殖缓慢细胞因子浓度不足→调整IL-2/IL-15浓度（如从500U/ml增至1000U/ml）；起始细胞密度过低→提高接种密度（如从1×10⁶cells/ml增至2×10⁶cells/ml）；培养环境异常→检查CO₂浓度、温度，更换培养箱或调整参数。（三）细胞活性低分离过程损伤→优化离心参数（如降低转速、缩短时间）；培养基质量差→更换批次或品牌，验证血清/无血清培养基的兼容性；自身抗体干扰→改用AB血清或无血清培养基，避免同种异体血清过敏。结语NK细胞培养的标准化操作是实现其基础研究与临床转化的核心环