口蹄疫疫苗抗原定量ELISA检测方法征求意见稿

XX/TXXXXX—XXXX2口蹄疫疫苗抗原定量ELISA检测技术要求下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适GB/T33087仪器分析用高4缩略语FMD：口蹄疫（Foot-and-MouthDiseaFMDV：口蹄疫病毒（Foot-and-MoELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAsXX/TXXXXX—XXXX3PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaHRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidasTMB：四甲基乙二胺联苯胺（3,3’,5,5’OD450nm：450nm波长处的吸光值（Absorbanceat450nm）在酶标板上包被抗O型FMDV146S抗原原-抗体的“夹心”结构，洗去多余抗体后，加入HRP标记链霉亲和（TMB）底物后显色，显色强度与样本中的O型FMDV抗原浓度成正相关；当待检样本中无O型XX/TXXXXX—XXXX4FMDV抗原，待检抗原不能与捕获抗体结合，加入底物后不显色；根据测定样品的OD450nm吸光值，XX/TXXXXX—XXXX5该方法适合对微量抗原样本进行定量检测，其检测置信区间为：0.0625～2.2，细胞培养的病毒抗原，需在生物安全三级实验室5000rpm离心20min,去除细胞碎10min，管内液体分为上层油相、中层固相、下层水相，将下层水相（含疫苗抗原）小心地另外，按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品XX/TXXXXX—XXXX6A1和A2孔加标准抗原（使用稀释液将标排依次进行2倍稀释，最后一排弃去100μL，轻微振荡混匀后，于室温（24～30℃)孵育45min。检测抗体用PBST100倍稀释（1份加99份PBST）后8.3.8读值以系列稀释的标准抗原Log10（OD450nm）值为Y轴数值，轴数值，建立散点图曲线（选择线性回归曲线）R2>0.95，并得出该曲线的回归方程式。将待检样品的Log10（OD450nm）数值带入方程式的Y计9.1操作步骤9.1.1样品采集与保存该方法适合对微量抗原样本进行定量检测，其检测置信区间为：0.0625～2.2，细胞培养的病毒抗原，需在生物安全三级实验室5000rpm离心20min,去除细胞碎片XX/TXXXXX—XXXX710min，管内液体分为上层油相、中层固相、下层水相，将下层水相（含疫苗抗原）小心地另外，按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品A1和A2孔加标准抗原（使用稀释液将排依次进行2倍稀释，最后一排弃去100μL，轻微振荡混匀后，于室温（24～30℃)孵育45min。XX/TXXXXX—XXXX8检测抗体用PBST100倍稀释（1份加99份PBST）后以系列稀释的标准抗原Log10（OD450nm）值为Y轴数值，轴数值，建立散点图曲线（选择线性回归曲线）R2>0.95，并得出该曲线的回归方程式。将待检样品的Log10（OD450nm）数值带入方程式的Y计XX/TXXXXX—XXXX9A.1.1O型FMDV培养扩增使用BHK-21细胞系，含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、5%CO2条件下培养。细胞过蔗糖密度梯度超速离心分离纯化的抗原，500µL/管收集，采用Nano-One型紫外分光光度计，分别测定抗原样品在260nm和280nm波长下的吸光度值（OD₂₆₀和OD₂₈₀),通过吸光值比值（OD₂₆₀/OD₂₈₀)积计算其浓度。依据抗原浓度加入保护剂（30%甘油+30%蔗糖+0.3%BSA）于-20℃冷冻保存。A.2A型FMDV抗原标准品制备A.2.1A型FMDV培养扩增使用BHK-21细胞系，含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、5%CO2条件下培养。细胞在T-175瓶中长至70%单层时用PBS（pH=7.2）洗涤，加入病毒液(A/GDMM/CHA/2013毒株)，吸附60XX/TXXXXX—XXXX过蔗糖密度梯度超速离心分离纯化的抗原，500µL/管收集，采用Nano-One型紫外分光光度计，分别积计算其浓度。依据抗原浓度加入保护剂（30%甘油+30%蔗糖+0.3%BSA）于-20℃冷冻保存。XX/TXXXXX—XXXXpTT5-Ab1,pTT5-Ab2，pTT5-Ab3由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。分别将pTT5-Ab1XX/TXXXXX—XXXXXX/TXXXXX—XXXX称取氯化钠（NaCl）4g，氯化钾（KCl）0.1g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.72g，磷酸二氢钾称取氯化钠（NaCl）80g、氯化钾（KCl）2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2