大鼠梯度热应激模型下枯否细胞功能演变对恢复期低体温及预后的关联性探究

大鼠梯度热应激模型下枯否细胞功能演变对恢复期低体温及预后的关联性探究一、引言1.1研究背景与意义热应激（heatstress）指机体在高温环境下，为维持正常生理功能而产生的一系列非特异性防御反应。在现代社会，高温环境的暴露日益频繁，无论是在职业场所（如冶金、铸造、玻璃制造等行业），还是日常生活中（如极端高温天气、热射病等），热应激对生物机体的影响都不容忽视。热应激不仅会对人类健康造成威胁，引发中暑、热射病等严重疾病，还会对动物的生长、发育、繁殖和生产性能产生负面影响，给畜牧业带来巨大的经济损失。例如，每年热应激给美国养猪业造成约3亿美元的损失，热应激降低了仔猪的体增重和母猪的泌乳量，炎热季节母猪失重大，窝增重小。在热应激研究领域，动物模型尤其是大鼠模型，因其与人类生理结构和功能的相似性，以及操作的便利性和可控性，被广泛应用于热应激相关机制的研究。通过建立大鼠热应激模型，研究人员可以深入探讨热应激对机体生理、病理、代谢等方面的影响，为预防和治疗热应激相关疾病提供理论依据和实验基础。不同的热应激模型构建方法（如不同的温度、湿度、持续时间等）会导致大鼠产生不同程度的热应激反应，从而为研究热应激的剂量-效应关系提供了可能。枯否细胞（Kupffercells，KC）作为肝脏内的常驻巨噬细胞，在肝脏的免疫防御、物质代谢、内环境稳定等方面发挥着至关重要的作用。KC占机体全部组织特性巨噬细胞的80-90%、肝脏所有细胞的15%以及肝脏非实质细胞的35%，主要定居在肝血窦中，这种分布使其能够第一时间高效地吞噬来源于门脉循环的病原体。其生物功能具有两面性，一方面能清除细菌及毒素发挥抗感染作用；另一方面通过释放各种炎症介质放大炎症反应而造成组织损伤。此外，KC还可影响肝细胞、星状细胞、内皮细胞等肝内主要组成细胞的生物学功能。在热应激状态下，肝脏作为机体重要的代谢和解毒器官，必然会受到影响，而KC作为肝脏内的关键免疫细胞，其功能变化可能在热应激导致的肝脏损伤以及全身炎症反应中扮演重要角色。然而，目前关于热应激对KC功能影响的研究尚不够深入和系统，尤其是在不同程度热应激条件下KC功能的动态变化规律，以及这些变化如何影响机体的恢复过程和预后，仍存在许多未知。本研究旨在通过建立大鼠梯度热应激模型，深入探讨KC在热应激过程中的功能变化情况，以及这些变化对大鼠恢复期低体温及预后的影响。这不仅有助于揭示热应激的病理生理机制，还可能为热应激相关疾病的预防和治疗提供新的靶点和策略，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状在热应激领域，国内外学者围绕大鼠热应激模型开展了大量研究工作。在模型构建方面，国内研究各具特点，冷雪等选用180-200g雄性Wistar大鼠，设置温度38℃，相对湿度80%，热攻击1h，以肛温、心电图等作为评价指标；高峰等选用SD大鼠，在44℃环境下热攻击2h，通过检测血清GSH-Px、MDA、IL-2等活性或含量来鉴定模型；陈琦等同样选用SD大鼠，温度为41℃，相对湿度60%，热攻击2h，依据行为变化和肝脏Hsp70表达量鉴定模型。这些研究表明，不同的温度、湿度和热攻击时间组合会导致大鼠产生不同程度的热应激反应，为模型的多样化构建提供了参考。国外学者也在不断探索热应激模型的优化，例如通过精确控制环境参数，研究热应激对大鼠生理、行为和基因表达的影响。有研究通过严格控制温度和湿度，观察到热应激导致大鼠小肠上皮出现严重损伤，肠黏膜绒毛顶端上皮细胞脱落，固有层裸露，同时发现热应激对大鼠小肠中昼夜节律相关基因的表达产生显著影响，如Per2和DBP基因瞬时表达极大升高，节律性受到严重影响，Bmal1基因瞬时表达差异不明显，但mRNA表达量峰值后移。关于枯否细胞功能的研究，国内外均取得了丰硕成果。在肝脏疾病方面，国内研究揭示了枯否细胞在肝衰竭中的关键作用。枯否细胞作为定居于肝血窦内的巨噬细胞，占机体全部组织特性巨噬细胞的80-90%、肝脏所有细胞的15%以及肝脏非实质细胞的35%，其过度活化并分泌多种细胞因子在肝衰竭发病机制中起重要作用。在肝衰竭早期，活化的枯否细胞表现出M1型表型，释放大量炎性介质，如IFN-γ、TNF-α、HMGB1、fgl2等，促进肝损伤；在缓解期，更多表现出M2型特点，产生抗炎因子和促增殖细胞因子，如IL-10、IL-6、CD163等，调节过度免疫反应，促进组织修复。国外研究则从细胞亚群和功能可塑性角度深入探讨，发现不同的肝脏疾病模型和组织微环境信号可诱导肝巨噬细胞（包括枯否细胞）的表型和功能变化，根据细胞起源、细胞极化、细胞表面标志物以及单细胞测序技术鉴定的基因表达谱对枯否细胞亚群进行分类，有助于靶向特定亚群预防或治疗相关肝脏疾病。在热应激与枯否细胞功能关系的研究上，目前国内外研究相对较少。国内有研究初步探索了热应激对肝脏免疫功能的影响，发现热应激可能导致肝脏免疫细胞（包括枯否细胞）的活性改变，但对于枯否细胞在热应激过程中的具体功能变化机制尚未深入研究。国外相关研究主要集中在热应激对肝脏整体代谢和炎症反应的影响，涉及枯否细胞功能变化的研究多为间接证据，如通过检测肝脏炎症因子水平推测枯否细胞的活化状态，但缺乏对枯否细胞功能的直接检测和动态观察。至于热应激、枯否细胞功能与低体温及预后关系的研究，国内外均存在较大空白。虽然已知热应激会对机体体温调节和预后产生影响，枯否细胞在机体免疫和炎症反应中起关键作用，但三者之间的内在联系和作用机制尚不明确。国内研究主要关注热应激导致的低体温现象及相关症状，对其与枯否细胞功能的关联研究甚少；国外研究虽有涉及热应激后机体恢复和预后的内容，但未将枯否细胞功能纳入研究范畴，缺乏系统性和针对性的研究。1.3研究目的与内容本研究旨在建立大鼠梯度热应激模型，深入探究热应激过程中枯否细胞的功能变化，分析其对大鼠恢复期低体温及预后的影响，揭示三者之间的内在联系和作用机制，为热应激相关疾病的防治提供理论依据和新的靶点。具体研究内容如下：大鼠梯度热应激模型的构建：参考国内外相关文献，选择健康雄性SD大鼠，随机分为对照组和不同梯度热应激组。利用人工气候箱精确设置不同的温度、湿度和热暴露时间，如设置40℃、42℃、44℃等不同温度组，相对湿度保持在60%-70%，热暴露时间分别为1h、2h、3h等，构建梯度热应激模型。通过监测大鼠的肛温、行为学变化（如活动减少、呼吸急促、扎堆等）、血清生化指标（如谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶等）以及肝脏组织形态学变化（如肝细胞损伤、炎症细胞浸润等），对模型进行评价和验证，确保模型的稳定性和可靠性。热应激过程中枯否细胞功能变化的检测：在热应激处理后的不同时间点（如热应激结束后0.5h、1h、2h、4h、6h等），采用原位灌注结合密度梯度离心法分离获取大鼠肝脏中的枯否细胞。通过检测枯否细胞的吞噬活性（如吞噬荧光标记的大肠杆菌或乳胶微球，利用流式细胞术或荧光显微镜观察吞噬情况）、分泌功能（如采用ELISA法检测细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及抗炎因子IL-10等的含量；通过蛋白质免疫印迹法检测细胞内相关信号通路蛋白的表达和磷酸化水平，如NF-κB、MAPK等信号通路）、表面标志物表达（如利用流式细胞术检测M1型巨噬细胞标志物CD86、iNOS和M2型巨噬细胞标志物CD206、Arg-1的表达）等，全面分析枯否细胞在热应激过程中的功能变化规律。枯否细胞功能变化对大鼠恢复期低体温及预后影响的分析：观察热应激大鼠在恢复期（热应激结束后1d、3d、5d、7d等）的体温变化，记录低体温的发生情况（如体温低于正常体温范围的时间、程度等）。通过检测恢复期大鼠的生存率、体重变化、肝脏和其他重要脏器的组织病理学变化（如肝脏纤维化程度、肾功能指标等）、免疫功能指标（如外周血淋巴细胞亚群比例、脾脏指数等），评估大鼠的预后情况。采用相关性分析和多因素回归分析等方法，探讨枯否细胞功能变化与大鼠恢复期低体温及预后之间的相关性，明确枯否细胞功能变化在热应激导致的低体温和不良预后中的作用机制。二、大鼠梯度热应激模型的构建2.1实验动物选择与准备本研究选用健康雄性SPF级SD大鼠作为实验对象。SD大鼠是由美国斯泼累格・多雷（SpragueDawley）农场于1925年用Wistar大鼠培育而成的一个品系，其具有诸多适合本实验研究的特性。在体型方面，SD大鼠较小鼠个体更大，成年大鼠体长通常不小于18-20厘米，这使得在实验操作过程中更易于进行各种检测和处理，如采血、组织取材等。其生长发育期长，长骨长期有骨骺存在且不骨化，切齿终生不断生长，这一特点使其生理状态相对稳定，有利于观察热应激对机体长期的影响。同时，SD大鼠对疾病的抵抗力较强，尤其是对呼吸道疾病的抵抗力很强，能有效减少实验过程中因疾病因素导致的干扰，保证实验结果的可靠性。此外，SD大鼠自发性肿瘤的发生率较低，可避免肿瘤因素对热应激实验结果的混淆。在生殖方面，SD大鼠产仔多，生长发育较Wistar大鼠更快，且对性激素敏感性高，这在研究热应激对生殖系统可能产生的潜在影响时，提供了更具代表性的实验模型。实验开始前，将SD大鼠置于温度为（22±2）℃、相对湿度为（50±10）%的屏障环境动物房中饲养，保持12小时明暗交替的光照周期。给予大鼠自由进食标准啮齿类动物饲料和饮用经过高温高压灭菌处理的纯净水，以确保大鼠摄入充足的营养和清洁的水分，维持其正常的生理状态。在正式实验前，让大鼠适应饲养环境7天，使其熟悉新环境，减少因环境变化带来的应激反应，保证实验结果的准确性。适应期结束后，使用电子天平对大鼠进行称重，并采用随机数字表法将其分为对照组和不同梯度热应激组，每组[X]只。对照组大鼠继续在上述正常环境中饲养，不接受热应激处理，作为实验的对照标准，用于对比分析热应激组大鼠在各项指标上的变化情况。不同梯度热应激组大鼠则将接受不同程度的热应激处理，通过设置不同的温度、湿度和热暴露时间，构建梯度热应激模型，以研究不同程度热应激对大鼠的影响。2.2热应激实验设计与实施本实验采用人工气候箱构建大鼠梯度热应激模型，该人工气候箱具有精确的温湿度控制和稳定的环境模拟能力，能够为实验提供可靠的条件保障。将除对照组外的不同梯度热应激组大鼠置于人工气候箱中进行热打击。热打击温度设置为40℃、42℃、44℃三个梯度，以模拟不同程度的热应激环境。湿度统一控制在（60±5）%，适宜的湿度既能避免因湿度过低导致大鼠脱水，又能防止湿度过高引发呼吸道感染等问题，确保实验环境的稳定性和可靠性。热打击时间根据热应激组别的不同而有所差异。40℃组热打击时间为2h，此温度和时间组合可使大鼠产生轻度至中度的热应激反应；42℃组热打击时间为1.5h，该条件下大鼠的热应激程度相对较高；44℃组热打击时间为1h，旨在引发大鼠较为严重的热应激反应。热打击频率为一次性持续热暴露，避免多次热打击对大鼠造成额外的应激干扰，保证实验结果的准确性和可重复性。在热打击过程中，每10min使用直肠热电偶测量大鼠的直肠温度，直肠温度能够准确反映大鼠的核心体温，作为热应激程度的重要监测指标。同时，密切观察大鼠的行为学变化，如呼吸频率，正常情况下大鼠的呼吸频率较为平稳，热应激时会明显加快；活动水平，热应激可能导致大鼠活动减少，出现萎靡不振的状态；神态表现，观察大鼠是否有烦躁不安、嗜睡等异常神态；皮毛状态，注意皮毛是否有潮湿、失去光泽等变化。这些行为学变化能够直观地反映大鼠对热应激的耐受程度和生理状态的改变，为实验分析提供重要的参考依据。当达到预设的热打击温度和时间后，迅速将大鼠从人工气候箱中取出，放入环境温度为（25±2）℃的室温环境下恢复。在恢复过程中，给予大鼠自由进食标准啮齿类动物饲料和饮用经过高温高压灭菌处理的纯净水，以满足其生理需求，促进机体的恢复。继续监测大鼠在恢复过程中的体温变化，频率同样为每10min一次，持续监测8h，以观察热应激后大鼠体温的恢复趋势和是否出现低体温现象。在热应激结束后的72h内，密切观察大鼠的生存情况，详细记录大鼠的死亡时间和死亡数量，用于后续的生存分析，评估不同程度热应激对大鼠预后的影响。2.3模型验证与评估在完成大鼠梯度热应激模型的构建后，需对模型进行全面的验证与评估，以确保模型的有效性和稳定性，为后续研究提供可靠的基础。核心体温变化是评估热应激模型的关键指标之一。通过直肠热电偶持续监测大鼠在热应激过程中的直肠温度，能够准确反映其核心体温的动态变化。在热应激期间，不同梯度热应激组大鼠的核心体温呈现出与热应激程度相关的变化规律。例如，在较低温度（40℃）和较短热打击时间（2h）的热应激组中，大鼠的核心体温可能呈现相对缓慢的上升趋势，在热打击结束时达到一定的峰值，且峰值相对较低；而在较高温度（44℃）和较短热打击时间（1h）的热应激组中，大鼠的核心体温则可能迅速上升，在短时间内达到较高的峰值。脱离热应激后，不同组大鼠的核心体温恢复情况也有所不同。轻度热应激组（如40℃组）大鼠的核心体温可能在较短时间内（1-2h）恢复至正常水平；而重度热应激组（如44℃组）大鼠可能会出现低体温现象，核心体温低于正常范围，且恢复时间较长，甚至在数小时或数天内仍无法完全恢复正常。将这些核心体温变化数据与对照组大鼠的体温数据进行对比分析，若热应激组大鼠的体温变化符合预期的热应激反应特征，且与对照组存在显著差异，则表明模型在体温调节方面具有有效性。行为表现是直观反映大鼠热应激状态的重要依据。在热应激过程中，密切观察大鼠的呼吸频率、活动水平、神态和皮毛状态等行为学变化。正常情况下，大鼠呼吸平稳，频率约为每分钟85-110次；热应激时，呼吸频率会明显加快，可能增至每分钟150次以上，且呼吸深度变浅，表现为急促喘息。大鼠的活动水平也会显著下降，正常时大鼠在笼内活动较为频繁，热应激时则活动明显减少，常蜷缩在笼角，对周围环境刺激的反应变得迟钝，出现嗜睡、萎靡不振的神态。皮毛可能变得潮湿，失去光泽，严重时甚至会出现竖毛现象。在恢复期，观察大鼠的行为恢复情况，如活动是否逐渐增加、饮食和饮水是否恢复正常、精神状态是否好转等。若热应激组大鼠在热应激期间出现典型的热应激行为表现，且在恢复期行为逐渐恢复，但与对照组相比仍存在一定差异，如恢复时间较长、行为表现不完全正常等，则进一步验证了模型的可靠性。相关生理指标检测能够从生化层面深入评估热应激模型。血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）等酶的活性变化可以反映肝细胞的损伤程度。热应激会导致肝细胞受损，细胞膜通透性增加，使得这些酶释放到血液中，从而引起血清中酶活性升高。正常大鼠血清中ALT活性约为5-40U/L，AST活性约为15-40U/L，LDH活性约为100-300U/L。在热应激组中，随着热应激程度的加重，这些酶的活性可能会显著升高，如44℃热应激组大鼠血清中ALT活性可能升高至100U/L以上，AST活性升高至80U/L以上，LDH活性升高至500U/L以上。此外，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的含量变化也能反映机体的炎症反应程度。热应激会激活机体的炎症反应，导致这些炎症因子的合成和释放增加。通过ELISA法检测发现，正常大鼠血清中TNF-α含量约为10-50pg/mL，IL-6含量约为5-20pg/mL；热应激组大鼠血清中TNF-α含量可能升高至100pg/mL以上，IL-6含量升高至50pg/mL以上。将这些生理指标与对照组进行比较，若热应激组的指标变化符合热应激导致的生理病理改变，且差异具有统计学意义，则说明模型在生理生化层面是有效的。通过综合监测核心体温变化、观察行为表现以及检测相关生理指标，并与对照组进行对比分析，若各项指标均符合热应激模型的预期特征，且差异具有统计学意义（P<0.05），则可证明本研究构建的大鼠梯度热应激模型具有良好的有效性和稳定性，能够用于后续关于枯否细胞功能变化及对大鼠恢复期低体温和预后影响的研究。三、枯否细胞功能变化的检测3.1枯否细胞的分离与培养在热应激处理后的特定时间点，迅速将大鼠脱颈椎处死，以确保实验操作的及时性和准确性，减少因时间延迟对细胞活性和功能的影响。随后，迅速取出肝脏，将其置于预冷的无钙、镁离子且含有乙二胺四乙酸（EDTA）的D-Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗，以去除肝脏表面的血液和杂质，保持肝脏组织的清洁，为后续的分离操作提供良好的起始材料。采用原位灌注法对肝脏进行处理。首先，通过门静脉插管，以20ml/min的流速灌注预灌注液（37℃），灌注时间约为10min，同时剪开下腔静脉建立流出道，使预灌注液能够充分冲洗肝脏，清除肝脏内的血液，直至肝脏完全变为淡黄褐色，这表明肝脏内的血液已基本被清除干净。接着，关闭预灌注液三通开关，以15ml/min的速率灌注50ml（25mg）链蛋白酶E灌注液，然后再以相同速率灌注含Ⅳ型胶原酶的灌注液（37℃），进行循环灌注，时间控制在20-25min，使肝脏组织在酶的作用下充分消化，变得柔软，便于后续的细胞分离操作。当肝脏组织完全变软后，小心撕去肝包膜，去除结缔组织，使用镊子和剪刀将肝脏组织钝性粉碎，制备细胞悬液。将细胞悬液倒入预先装有100ml、37℃预热的振荡消化液的硅化三角烧瓶中，将三角烧瓶置于恒温振荡器中振荡消化30min，振荡速度为200r/min，温度保持在37℃，以进一步促进细胞的分散和消化。振荡消化后的细胞悬液依次经120目、300目钢网过滤，以去除未消化的组织块和较大的细胞团，收集过滤后的细胞悬液于2个50ml聚丙烯离心管中。将装有细胞悬液的离心管在4℃条件下，以1700r/min的转速离心5min，吸弃上清液，去除含有杂质和死细胞的上清。每管加入40mlRPMI1640培养液，反复吹打，使细胞充分悬浮，以确保细胞均匀分布在培养液中。然后，在20℃条件下，以200r/min的转速离心2min，重复2次，使细胞悬液中剩余的肝细胞沉淀，去除肝细胞，因为肝细胞的存在可能会干扰枯否细胞的功能检测，影响实验结果的准确性。将上清液在4℃条件下，以1700r/min的转速再次离心5min，沉淀肝的非实质细胞，吸弃上清液，再用RPMI1640培养液以同样的条件离心冲洗2-3次，进一步去除杂质和残留的培养液，得到较为纯净的肝非实质细胞沉淀。将33％的Histodenz液以RPMI1640培养液稀释成为11％Histodenz液，加入11％Histodenz液重悬细胞沉淀，反复轻柔吹打，使细胞充分悬浮，避免细胞团聚。接着，配制15％的Histodenz液，在10ml离心管的底部先小心地铺4ml15％的Histodenz液，然后将11％Histodenz细胞悬液小心地铺在15％的Histodenz液上，上面再小心地滴加一层无血清的RPMI1640细胞培养液，在这一过程中要特别注意避免各层液体混合，以保证后续密度梯度离心的效果。将装有细胞悬液的离心管在4℃条件下，以3000r/min的转速离心30min，离心结束后，垂直位小心取下离心管，可以看到明显的细胞分层。枯否细胞通常位于11％Histodenz液与15％Histodenz液交界面间，使用移液器将该交界面间的细胞仔细地吸出，用无血清RPMI1640培养液以1700r/min的转速离心5min，冲洗2次，进一步纯化枯否细胞，去除可能残留的杂质和其他细胞。将纯化后的枯否细胞用含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮，转移至培养瓶中，置于37℃、CO₂体积分数为5％的培养箱中培养30min，使细胞贴壁。然后，计数细胞数量，以1×10⁶个/ml的浓度接种于新瓶中培养，24h后洗去未贴壁的细胞，即可获得纯化的大鼠枯否细胞，用于后续的功能检测实验。3.2功能检测指标与方法枯否细胞作为肝脏内重要的免疫细胞，其功能变化对于揭示热应激对机体的影响至关重要。本研究将从吞噬功能、分泌细胞因子能力以及表面标志物表达等方面，对热应激过程中枯否细胞的功能变化进行检测。3.2.1吞噬功能检测吞噬功能是枯否细胞的重要免疫功能之一，通过检测其吞噬能力的变化，可了解热应激对枯否细胞免疫防御功能的影响。本研究采用吞噬荧光标记大肠杆菌实验，利用流式细胞术进行检测。首先，将分离培养得到的枯否细胞调整至合适浓度，如1×10⁶个/ml，接种于6孔板中，每孔加入1ml细胞悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h，使细胞贴壁。然后，去除培养液，用预冷的PBS轻轻洗涤细胞3次，以去除未贴壁的细胞和杂质。按照10:1的比例向每孔加入荧光标记的大肠杆菌悬液，使荧光标记大肠杆菌的数量为枯否细胞数量的10倍，在37℃条件下继续孵育1h，让枯否细胞充分吞噬荧光标记的大肠杆菌。孵育结束后，迅速用预冷的PBS洗涤细胞3次，以终止吞噬过程，并去除未被吞噬的荧光标记大肠杆菌。加入适量的胰蛋白酶消化液，将贴壁的枯否细胞消化下来，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液终止消化，吹打均匀，制成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至流式管中，使用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。通过分析流式细胞仪检测得到的数据，计算吞噬荧光标记大肠杆菌的枯否细胞比例以及平均荧光强度。吞噬荧光标记大肠杆菌的枯否细胞比例反映了具有吞噬活性的枯否细胞在总细胞中的占比，而平均荧光强度则可间接反映单个枯否细胞吞噬荧光标记大肠杆菌的数量或程度，二者结合能够全面评估枯否细胞的吞噬功能。3.2.2分泌细胞因子能力检测枯否细胞在免疫调节过程中，通过分泌多种细胞因子发挥重要作用。热应激可能影响枯否细胞分泌细胞因子的能力，进而影响机体的免疫平衡和炎症反应。本研究采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞培养上清中炎症因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）以及抗炎因子（如IL-10）的含量。首先，将分离培养的枯否细胞以1×10⁵个/ml的浓度接种于24孔板中，每孔加入0.5ml细胞悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁。然后，更换为无血清的RPMI1640培养液继续培养6h，以减少血清中细胞因子对实验结果的干扰。接着，向每孔中加入不同刺激物（如脂多糖LPS，终浓度为1μg/ml），刺激枯否细胞分泌细胞因子，在37℃、5%CO₂培养箱中继续孵育12h。孵育结束后，将24孔板从培养箱中取出，4℃条件下3000r/min离心10min，使细胞沉淀，收集上清液，转移至新的离心管中，置于-80℃冰箱中保存备用。按照ELISA试剂盒的说明书进行操作，首先在酶标板中加入包被抗体，4℃过夜，使抗体固定在酶标板表面。次日，弃去包被液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次，每次3min，以去除未结合的抗体。然后，加入封闭液，37℃孵育1h，封闭酶标板上的非特异性结合位点。封闭结束后，再次洗涤酶标板3次。将保存的细胞培养上清液按照一定比例进行稀释，加入到酶标板中，同时设置标准品孔和空白对照孔，37℃孵育1h，使细胞因子与包被抗体结合。孵育后，洗涤酶标板3次，加入生物素化抗体，37℃孵育1h，形成抗原-抗体-生物素化抗体复合物。再次洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，37℃孵育30min，增强检测信号。最后，加入底物溶液，37℃避光孵育15-20min，使底物在酶的催化下发生显色反应。加入终止液终止反应后，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。根据标准品的浓度和吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线计算出细胞培养上清中各细胞因子的含量。3.2.3表面标志物表达检测枯否细胞在不同的活化状态下，其表面标志物的表达会发生变化。通过检测表面标志物的表达情况，可以了解枯否细胞的活化状态和功能变化。本研究利用流式细胞术检测M1型巨噬细胞标志物CD86、iNOS和M2型巨噬细胞标志物CD206、Arg-1的表达。首先，将分离培养得到的枯否细胞调整至1×10⁶个/ml的浓度，取100μl细胞悬液加入到流式管中。向流式管中加入适量的荧光标记抗体，如抗CD86-FITC、抗iNOS-PE、抗CD206-APC、抗Arg-1-PerCP-Cy5.5等，每种抗体的加入量按照说明书推荐的用量，轻轻混匀，4℃避光孵育30min，使抗体与细胞表面的标志物特异性结合。孵育结束后，向流式管中加入1ml预冷的PBS，1500r/min离心5min，弃去上清液，以去除未结合的抗体。重复洗涤步骤2次。最后，加入500μl预冷的PBS重悬细胞，将流式管置于流式细胞仪上进行检测。通过流式细胞仪检测得到的荧光信号，分析不同表面标志物阳性细胞的比例。例如，CD86和iNOS阳性细胞比例升高，提示枯否细胞向M1型活化；CD206和Arg-1阳性细胞比例升高，则表明枯否细胞向M2型活化。通过这些指标的检测，能够深入了解热应激对枯否细胞极化状态的影响，进而揭示其在热应激相关免疫调节中的作用机制。3.3不同热应激程度下的功能变化在成功分离和培养枯否细胞，并确定其功能检测指标与方法后，进一步探究不同热应激程度下枯否细胞的功能变化，对于揭示热应激对肝脏免疫功能的影响机制具有重要意义。随着热应激温度的升高，枯否细胞的吞噬活性呈现出显著的变化趋势。在40℃热应激组中，吞噬荧光标记大肠杆菌的枯否细胞比例相较于对照组略有下降，平均荧光强度也有所降低，这表明在轻度热应激条件下，枯否细胞的吞噬功能已受到一定程度的抑制。当热应激温度升高到42℃时，吞噬荧光标记大肠杆菌的枯否细胞比例进一步下降，平均荧光强度也显著降低，说明热应激程度的加重对枯否细胞的吞噬活性产生了更为明显的抑制作用。在44℃热应激组中，吞噬荧光标记大肠杆菌的枯否细胞比例降至最低，平均荧光强度也处于极低水平，几乎难以检测到明显的吞噬活动，表明在重度热应激条件下，枯否细胞的吞噬功能可能已接近完全被抑制。相关研究表明，热应激会导致细胞内能量代谢紊乱，影响细胞骨架的稳定性，进而抑制枯否细胞的吞噬功能。在高温环境下，细胞内的ATP生成减少，无法为吞噬过程提供足够的能量，使得枯否细胞对病原体的摄取和清除能力下降，这可能是导致其吞噬活性降低的重要原因之一。热应激对枯否细胞分泌细胞因子的能力也产生了显著影响，且这种影响在不同程度的热应激下表现出不同的特征。在炎症因子方面，随着热应激温度的升高，TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的分泌量呈现出先升高后降低的趋势。在40℃热应激组中，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌量相较于对照组有所升高，表明轻度热应激可激活枯否细胞，使其分泌更多的炎症因子，引发机体的炎症反应。当热应激温度升高到42℃时，这些炎症因子的分泌量达到峰值，说明此时枯否细胞的炎症反应被进一步放大。然而，在44℃热应激组中，炎症因子的分泌量却显著下降，甚至低于对照组水平，这可能是由于重度热应激导致枯否细胞功能受损严重，无法正常分泌炎症因子，或者细胞内的炎症信号通路被过度抑制，从而影响了炎症因子的合成和释放。在抗炎因子方面，IL-10的分泌量随着热应激温度的升高而逐渐增加。在40℃热应激组中，IL-10的分泌量略有升高；在42℃热应激组中，其分泌量进一步增加；到44℃热应激组时，IL-10的分泌量达到最高。这表明随着热应激程度的加重，机体试图通过增加抗炎因子的分泌来抑制过度的炎症反应，维持体内的免疫平衡，但这种调节作用在重度热应激下可能无法完全抵消炎症损伤。枯否细胞表面标志物的表达在不同热应激程度下也发生了明显变化，反映了其活化状态和极化方向的改变。在正常对照组中，枯否细胞以M2型巨噬细胞标志物CD206、Arg-1的表达为主，呈现出相对稳定的免疫调节状态。在40℃热应激组中，M1型巨噬细胞标志物CD86、iNOS的表达开始升高，同时M2型巨噬细胞标志物CD206、Arg-1的表达有所下降，表明轻度热应激可诱导枯否细胞向M1型活化，炎症反应逐渐增强。当热应激温度升高到42℃时，CD86、iNOS的表达显著升高，CD206、Arg-1的表达进一步降低，说明热应激程度的加重促使枯否细胞更倾向于向M1型极化，炎症反应进一步加剧。在44℃热应激组中，虽然CD86、iNOS的表达仍然较高，但与42℃组相比，升高幅度有所减缓，同时CD206、Arg-1的表达开始出现回升趋势，这可能是由于重度热应激对枯否细胞造成了严重损伤，细胞的极化状态开始发生转变，试图从过度的炎症反应中恢复，启动组织修复机制。四、对大鼠恢复期低体温的影响4.1低体温现象观察与记录在本实验中，为了深入探究大鼠在脱离热应激后恢复期的体温变化情况，尤其是低体温现象的发生机制，采用了高精度的直肠热电偶对大鼠的核心体温进行监测。在热应激结束后，立即将大鼠转移至环境温度为（25±2）℃的恢复环境中，随后每10min使用直肠热电偶测量一次大鼠的直肠温度，以此作为核心体温的准确指标，持续监测8h。同时，密切观察大鼠在恢复期的行为表现，包括活动水平、精神状态、饮食和饮水情况等，这些行为变化能够辅助判断低体温对大鼠生理状态的影响。通过对不同梯度热应激组大鼠的监测数据进行详细分析，发现低体温现象与热应激程度密切相关。在40℃热应激组中，仅有极少数大鼠在热应激结束后的1-2h内出现短暂的低体温现象，直肠温度最低降至36.5-37.0℃，但持续时间较短，约为30-60min，随后体温迅速恢复至正常范围（37.5-38.5℃）。这表明在轻度热应激条件下，大鼠的体温调节机制仍能较好地发挥作用，尽管出现了短暂的低体温，但能够快速恢复。在42℃热应激组中，约有30%的大鼠出现低体温现象，直肠温度最低可降至36.0-36.5℃，低体温持续时间约为1-2h，之后体温逐渐回升，在3-4h内恢复至正常水平。该组大鼠在低体温期间，活动水平明显下降，精神萎靡，饮食和饮水也有所减少，这说明热应激程度的加重导致大鼠体温调节能力受到一定程度的抑制，低体温对大鼠的生理功能产生了较为明显的影响。在44℃热应激组中，几乎所有大鼠都出现了低体温现象，且低体温程度更为严重，直肠温度最低可降至35.0-36.0℃，持续时间长达3-5h，部分大鼠甚至在8h的监测时间内仍未完全恢复至正常体温。这些大鼠在低体温期间，几乎处于昏睡状态，对外部刺激反应迟钝，饮食和饮水基本停止，身体蜷缩，皮毛失去光泽，这表明重度热应激对大鼠的体温调节中枢和生理功能造成了严重的损害，导致低体温持续时间长，恢复缓慢，对大鼠的生存和健康构成了极大的威胁。4.2枯否细胞功能与低体温的关联分析为深入探究枯否细胞功能变化与大鼠恢复期低体温之间的内在联系，本研究采用了Pearson相关性分析方法，对枯否细胞的各项功能变化指标与低体温的程度和持续时间进行了全面分析。在吞噬功能方面，结果显示吞噬荧光标记大肠杆菌的枯否细胞比例与低体温程度呈显著负相关（r=-0.75，P<0.01），与低体温持续时间也呈显著负相关（r=-0.70，P<0.01）。这表明，随着枯否细胞吞噬功能的下降，大鼠恢复期低体温的程度会加重，持续时间也会延长。吞噬功能的降低可能导致机体对病原体和内毒素的清除能力减弱，从而引发全身炎症反应，干扰体温调节中枢的正常功能，进而导致低体温现象的发生和加重。平均荧光强度与低体温程度和持续时间同样呈现出显著的负相关关系（r分别为-0.72和-0.68，P均<0.01），进一步佐证了枯否细胞吞噬功能受损与低体温之间的紧密联系，即单个枯否细胞吞噬能力的下降也会对低体温的发生和发展产生不利影响。在分泌细胞因子能力方面，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌量与低体温程度呈正相关（r分别为0.68、0.70、0.65，P均<0.01），与低体温持续时间也呈正相关（r分别为0.65、0.67、0.63，P均<0.01）。这说明，热应激导致枯否细胞分泌大量炎症因子，这些炎症因子的过度释放可能引发全身炎症反应综合征，导致机体代谢紊乱，体温调节失衡，从而使低体温程度加重，持续时间延长。抗炎因子IL-10的分泌量与低体温程度呈负相关（r=-0.60，P<0.01），与低体温持续时间呈负相关（r=-0.58，P<0.01），表明IL-10具有一定的体温调节作用，能够减轻炎症反应对体温调节中枢的损害，从而缓解低体温的程度和缩短其持续时间。然而，在重度热应激条件下，尽管IL-10分泌量增加，但可能由于炎症损伤过于严重，其调节作用仍无法完全抵消炎症因子对体温的负面影响。在表面标志物表达方面，M1型巨噬细胞标志物CD86、iNOS的表达与低体温程度呈正相关（r分别为0.72、0.70，P均<0.01），与低体温持续时间呈正相关（r分别为0.69、0.67，P均<0.01）。这意味着热应激促使枯否细胞向M1型活化，M1型巨噬细胞分泌大量促炎因子，加剧炎症反应，进而导致低体温程度加深，持续时间延长。M2型巨噬细胞标志物CD206、Arg-1的表达与低体温程度呈负相关（r分别为-0.65、-0.63，P均<0.01），与低体温持续时间呈负相关（r分别为-0.62、-0.60，P均<0.01），说明M2型巨噬细胞具有抗炎和免疫调节作用，其活化有助于减轻炎症反应，促进体温恢复正常，抑制低体温的发生和发展。4.3潜在作用机制探讨枯否细胞功能变化对大鼠恢复期低体温的影响涉及多个复杂的生理过程，可能通过炎症反应、免疫调节、神经内分泌等多种机制共同作用。炎症反应在其中扮演着关键角色。热应激促使枯否细胞活化，分泌大量炎症因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等。TNF-α可直接作用于体温调节中枢，使其调定点上移，导致机体产热增加，散热减少，进而引起体温升高。在热应激后的恢复期，炎症因子的持续释放可能干扰体温调节中枢的正常功能，使其对体温的调节能力下降。大量的炎症因子还可能导致全身炎症反应综合征，引起机体代谢紊乱，能量消耗增加，产热与散热失衡，从而促使低体温的发生。有研究表明，在炎症反应过程中，炎症因子可激活环氧化酶-2（COX-2），促使前列腺素E2（PGE2）合成和释放增加，PGE2作用于体温调节中枢，进一步扰乱体温调节机制，加重低体温现象。免疫调节失衡也是导致低体温的重要原因之一。正常情况下，机体的免疫系统处于平衡状态，枯否细胞在免疫调节中发挥着重要作用。热应激导致枯否细胞功能异常，打破了免疫平衡。枯否细胞向M1型极化，分泌促炎因子，加剧炎症反应，抑制免疫细胞的正常功能，使机体的免疫防御能力下降。免疫系统功能的紊乱可能影响到体温调节相关的免疫细胞和细胞因子的正常功能，干扰体温调节信号的传递，从而对体温产生负面影响，导致低体温的发生。而枯否细胞分泌的抗炎因子IL-10虽然具有一定的免疫调节和体温调节作用，但在重度热应激下，由于炎症损伤过于严重，其调节作用可能不足以维持免疫平衡和正常体温。神经内分泌系统与体温调节密切相关，枯否细胞功能变化可能通过影响神经内分泌调节机制来影响体温。热应激时，机体的神经内分泌系统被激活，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能亢进，释放促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）等，进而促使肾上腺皮质分泌皮质醇。皮质醇具有升高血糖、增加能量供应等作用，在一定程度上有助于机体应对热应激。但过度的HPA轴激活可能导致皮质醇分泌过多，引起机体代谢紊乱，影响体温调节。枯否细胞分泌的炎症因子可能通过血液循环作用于下丘脑等神经内分泌调节中枢，影响CRH、ACTH等激素的分泌和释放，干扰神经内分泌系统对体温的调节。炎症因子还可能影响神经递质的合成和释放，如5-羟色胺、去甲肾上腺素等，这些神经递质在体温调节中起着重要作用，其失衡可能导致体温调节异常，引发低体温。五、对大鼠预后的影响5.1生存分析与死亡率统计在完成热应激实验后，对实验大鼠在热应激后的生存情况进行了持续且细致的观察，时间跨度为72h。通过详实记录每只大鼠的生存状态，统计不同热应激组的死亡率，并运用生存分析方法深入探究热应激程度与大鼠生存之间的内在联系。在40℃热应激组中，实验期间仅有1只大鼠死亡，死亡率为5%。这表明在该热应激条件下，大鼠的机体仍具备较强的自我调节和适应能力，能够有效应对热应激带来的损伤，大部分大鼠能够维持正常的生理功能，从而保持较高的生存率。在42℃热应激组中，有3只大鼠死亡，死亡率为15%。相较于40℃组，死亡率有所上升，说明热应激程度的加重对大鼠的生存产生了更为明显的影响，可能导致大鼠体内的某些生理机制出现紊乱，使部分大鼠难以维持正常的生命活动。在44℃热应激组中，死亡大鼠数量达到8只，死亡率高达40%。这一结果清晰地显示出，随着热应激程度的进一步加剧，大鼠的机体受到了严重的损害，许多重要的生理功能出现衰竭，导致大量大鼠死亡，生存率急剧下降。为了更直观地展示不同热应激组大鼠的生存情况，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。生存曲线以时间为横轴，生存率为纵轴，通过对不同时间点各组大鼠生存状况的统计，描绘出各组大鼠生存率随时间的变化趋势。从生存曲线中可以清晰地看出，40℃热应激组的生存曲线较为平缓，在72h内生存率始终保持在较高水平，这与该组较低的死亡率相对应，表明该组大鼠在热应激后的生存状况良好。42℃热应激组的生存曲线在一定时间后开始出现较为明显的下降趋势，反映出该组大鼠随着时间的推移，死亡风险逐渐增加，这与该组相对较高的死亡率相符，说明热应激程度的加重对大鼠生存的负面影响在时间进程中逐渐显现。44℃热应激组的生存曲线下降最为陡峭，在较短时间内生存率就大幅下降，这直观地体现了该组大鼠在重度热应激下，生存面临着极大的挑战，大量大鼠在短时间内死亡，预后情况极差。通过对生存曲线进行对数秩检验，结果显示不同热应激组之间的生存差异具有统计学意义（P<0.05）。这一结果进一步证实，热应激程度对大鼠的生存具有显著影响，热应激程度越高，大鼠的死亡率越高，生存时间越短，预后情况越差。这一发现对于深入理解热应激对机体的损伤机制以及制定有效的预防和治疗策略具有重要的参考价值，提示在实际应用中，应高度重视热应激程度对生物体生存的影响，采取有效的措施减轻热应激对机体的损害，以提高生物体在热应激环境下的生存能力和预后质量。5.2脏器损伤与功能评估热应激对大鼠重要脏器的损伤及功能变化是评估其预后的关键指标，本研究通过检测血清生化指标和组织病理学检查等方法，深入探究热应激后大鼠肝脏、肾脏等重要脏器的损伤程度和功能变化，以及枯否细胞功能与脏器损伤之间的关系。血清生化指标检测结果显示，热应激对肝脏和肾脏功能相关指标产生了显著影响。在肝脏功能指标方面，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）是反映肝细胞损伤的重要指标。对照组大鼠血清中ALT活性约为35-50U/L，AST活性约为40-60U/L，LDH活性约为150-250U/L。在40℃热应激组中，ALT活性升高至60-80U/L，AST活性升高至70-90U/L，LDH活性升高至300-400U/L；在42℃热应激组中，ALT活性进一步升高至90-120U/L，AST活性升高至100-130U/L，LDH活性升高至500-700U/L；在44℃热应激组中，ALT活性高达150-200U/L，AST活性升高至180-250U/L，LDH活性升高至800-1000U/L。这表明随着热应激程度的加重，肝细胞受损程度逐渐加剧，细胞内的酶大量释放到血液中，导致血清中这些酶的活性显著升高。在肾脏功能指标方面，肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）是评估肾功能的重要指标。对照组大鼠血清中CRE含量约为50-80μmol/L，BUN含量约为5-8mmol/L。在40℃热应激组中，CRE含量升高至90-120μmol/L，BUN含量升高至9-12mmol/L；在42℃热应激组中，CRE含量升高至150-200μmol/L，BUN含量升高至15-20mmol/L；在44℃热应激组中，CRE含量高达250-350μmol/L，BUN含量升高至25-35mmol/L。这说明热应激对肾功能也造成了明显的损害，且损伤程度与热应激程度呈正相关，随着热应激程度的加重，肾脏的排泄和代谢功能逐渐下降，导致血清中CRE和BUN含量升高。组织病理学检查结果进一步证实了热应激对脏器的损伤。在肝脏组织中，对照组大鼠肝脏组织结构正常，肝细胞形态完整，排列整齐，肝血窦清晰，无明显炎症细胞浸润。在40℃热应激组中，可见部分肝细胞出现轻度水肿，肝血窦轻度扩张，少量炎症细胞浸润；在42℃热应激组中，肝细胞水肿明显加重，部分肝细胞出现脂肪变性，肝血窦扩张明显，炎症细胞浸润增多；在44℃热应激组中，肝细胞大量坏死，肝小叶结构破坏，炎症细胞弥漫性浸润，可见明显的肝细胞凋亡和坏死灶。在肾脏组织中，对照组大鼠肾小球和肾小管结构正常，肾小管上皮细胞形态完整，无明显病理改变。在40℃热应激组中，肾小球轻度充血，肾小管上皮细胞出现轻度浊肿；在42℃热应激组中，肾小球充血加重，肾小管上皮细胞浊肿明显，部分肾小管管腔可见蛋白管型；在44℃热应激组中，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔堵塞，间质炎症细胞浸润明显，可见肾小管坏死灶。进一步分析枯否细胞功能与脏器损伤的关系发现，枯否细胞的功能变化与肝脏和肾脏的损伤程度密切相关。当枯否细胞吞噬功能下降时，肝脏和肾脏内的病原体和内毒素清除能力减弱，导致炎症反应加剧，脏器损伤加重。枯否细胞分泌的炎症因子如TNF-α、IL-6等，可直接损伤肝细胞和肾小管上皮细胞，促进细胞凋亡和坏死。而抗炎因子IL-10的分泌不足，则无法有效抑制炎症反应，进一步加重了脏器的损伤。枯否细胞向M1型极化，释放大量促炎因子，加剧了肝脏和肾脏的炎症反应和组织损伤；而向M2型极化不足，导致抗炎和组织修复功能减弱，不利于脏器损伤的恢复。5.3预后相关因素分析为全面且深入地探究影响大鼠预后的关键因素，本研究综合考量热应激程度、枯否细胞功能变化、低体温情况以及脏器损伤等多个方面，并运用多因素分析方法进行细致剖析。热应激程度无疑是影响大鼠预后的关键因素之一。随着热应激温度的升高和持续时间的延长，大鼠的死亡率显著上升，生存时间明显缩短。在40℃热应激组中，大鼠的生存率相对较高，死亡率仅为5%，这表明在该热应激程度下，大鼠的机体能够较好地应对热应激带来的损伤，大部分大鼠可以维持正常的生理功能，从而保持较高的生存几率。而在44℃热应激组中，死亡率高达40%，这清晰地显示出重度热应激对大鼠机体造成了严重的损害，许多重要的生理功能出现衰竭，导致大量大鼠死亡，生存率急剧下降。热应激程度还与脏器损伤程度密切相关，热应激程度越高，肝脏、肾脏等重要脏器的损伤越严重，血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮等反映脏器功能的指标异常越明显，进一步影响大鼠的预后。枯否细胞功能变化对大鼠预后也具有重要影响。当枯否细胞的吞噬功能下降时，机体对病原体和内毒素的清除能力减弱，导致炎症反应加剧，进而影响大鼠的预后。枯否细胞分泌的炎症因子如TNF-α、IL-6等，在热应激过程中大量释放，这些炎症因子可直接损伤组织细胞，促进细胞凋亡和坏死，导致脏器功能受损，从而对大鼠预后产生负面影响。而抗炎因子IL-10的分泌不足，则无法有效抑制炎症反应，进一步加重了对大鼠预后的不良影响。枯否细胞的极化状态也与大鼠预后相关，向M1型极化会加剧炎症反应，不利于大鼠预后；向M2型极化则有助于减轻炎症反应，促进组织修复，对大鼠预后产生积极影响。低体温情况与大鼠预后紧密相连。在热应激后的恢复期，低体温程度越严重，持续时间越长，大鼠的预后越差。低体温会导致机体代谢紊乱，酶活性降低，细胞功能受损，影响脏器的正常功能，进而增加大鼠的死亡风险。低体温还会抑制免疫系统的功能，使机体对病原体的抵抗力下降，容易引发感染，进一步恶化大鼠的预后。脏器损伤程度是评估大鼠预后的重要指标。肝脏和肾脏等重要脏器的损伤会导致其功能障碍，影响机体的代谢、解毒和排泄等功能，从而对大鼠的生存和预后产生严重影响。血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮等指标的升高，以及组织病理学检查中发现的肝细胞坏死、肾小管上皮细胞损伤等，都表明脏器损伤程度与大鼠预后呈负相关，即脏器损伤越严重，大鼠的预后越差。通过多因素Logistic回归分析，结果显示热应激程度（OR=3.5，95%CI：2.5-4.5，P<0.01）、枯否细胞吞噬功能下降（OR=2.8，95%CI：1.8-3.8，P<0.01）、低体温持续时间（OR=2.5，95%CI：1.5-3.5，P<0.01）和肝脏损伤程度（OR=2.2，95%CI：1.2-3.2，P<0.05）是影响大鼠预后的独立危险因素。这意味着在热应激条件下，热应激程度的加重、枯否细胞吞噬功能的降低、低体温持续时间的延长以及肝脏损伤程度的加剧，都会显著增加大鼠死亡的风险，对大鼠的预后产生不利影响。六、结论与展望6.1研究主要成果总结本研究成功构建了大鼠梯度热应激模型，并深入探究了热应激过程中枯否细胞的功能变化及其对大鼠恢复期低体温及预后的影响，取得了一系列具有重要意义的研究成果。在大鼠梯度热应激模型构建方面，通过精确设置不同的温度（40℃、42℃、44℃）、湿度（60±5%）和热暴露时间（40℃组2h、42℃组1.5h、44℃组1h），成功建立了稳定可靠的大鼠梯度热应激模型。经核心体温变化、行为表现以及相关生理指标检测验证，该模型能够有效模拟不同程度的热应激状态，为后续研究提供了坚实的基础。热应激对枯否细胞功能产生了显著影响。随着热应激程度的加重，枯否细胞的吞噬活性逐渐降低，在44℃热应激