大鼠肌肉挫伤后组织基因表达的时变特征与法医学应用探究

大鼠肌肉挫伤后组织基因表达的时变特征与法医学应用探究一、引言1.1研究背景与意义肌肉挫伤作为一种常见的损伤类型，在法医学领域中具有重要的研究价值。在涉及暴力犯罪、交通事故、工伤事故等案件中，准确推断肌肉挫伤的损伤时间，对于案件的侦破、责任的认定以及司法公正的实现都起着关键作用。传统的损伤时间推断方法，如根据损伤的形态学改变、组织学变化以及炎症反应等进行判断，存在一定的局限性，其准确性和可靠性往往受到多种因素的影响，如个体差异、损伤程度、环境因素等。因此，寻找一种更加科学、准确、可靠的损伤时间推断方法，一直是法医学领域的研究热点和难点。随着分子生物学技术的飞速发展，基因表达研究为损伤时间推断提供了新的思路和方法。基因是遗传信息的基本单位，它通过转录和翻译过程，控制着生物体的各种生理和病理过程。在肌肉挫伤发生后，机体的基因表达会发生一系列的变化，这些变化与损伤时间密切相关。通过研究肌肉挫伤后组织中基因表达的变化规律，可以建立起基因表达与损伤时间之间的关系模型，从而为损伤时间推断提供更加科学、准确的依据。研究大鼠肌肉挫伤后组织中时间相关基因表达，具有重要的理论意义和实际应用价值。从理论意义上讲，它有助于深入了解肌肉挫伤后的病理生理过程，揭示基因在损伤修复和愈合过程中的调控机制，丰富和完善法医学损伤时间推断的理论体系。从实际应用价值来看，它为法医学实践中的损伤时间推断提供了新的技术手段和指标，有望提高损伤时间推断的准确性和可靠性，为司法实践提供更加科学、有力的证据，从而保障司法公正，维护社会的公平正义。1.2国内外研究现状在国际上，对于大鼠肌肉挫伤后基因表达的研究已取得了一定的成果。一些早期研究聚焦于特定基因在肌肉挫伤后的表达变化，如Cheng等学者通过免疫组织化学染色和Westernblot技术，对大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中p-CB1R的表达规律展开研究，发现其在单核细胞和成纤维细胞中的变化具有时序性，伤后3-24h，阳性细胞以单核细胞为主；3-5d，阳性细胞以单核细胞和成纤维细胞为主；7-10d，阳性反应主要见于成纤维细胞，并于7d达到高峰；14d，p-CB1R阳性表达量有所下降，这为损伤时间推断提供了一定的参考依据。随着分子生物学技术的不断发展，高通量测序技术逐渐应用于该领域的研究。有研究运用RNA测序技术，详细分析了大鼠骨骼肌挫伤后早期0-48小时多个时间阶段的病理过程、基因表达、调控变化和时间相关差异基因，从系统生物学角度初步阐明了骨骼肌挫伤后早期推动病理过程发展和状态转变的关键基因和通路，并通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选出时间模块共表达模块基因，结合时间依赖基因分析软件，全面展示了骨骼肌挫伤后早期基因表达景观和时间依赖基因标记。在国内，相关研究也在积极开展。孙俊红等人运用差异显示技术结合硝酸银染色筛选大鼠肌肉挫伤后与正常肌肉表达差异的基因，并通过Real-timePCR方法研究差异基因与损伤时间的关系。研究过程中，先将12只健康成年SD大鼠随机分为实验组和正常对照组，实验组大鼠建立肌肉挫伤模型，损伤后4小时处死，提取损伤处肌肉组织，对照组提取相同部位肌肉组织。两组肌肉组织经提取总RNA并检测质量后，采用4种锚定引物和3种随机引物共12种组合进行PCR扩增，对扩增产物进行差异表达分析，回收差异条带进行二次扩增、克隆和序列分析。后续又通过Real-timePCR技术对差异基因进行验证，并分析其与损伤时间的关系。此外，还有研究检测了大鼠肌肉挫伤后组织中精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）mRNA相对表达量，发现ASLmRNA在大鼠肌肉挫伤后48h内呈规律性表达，有可能作为指标用于损伤时间的推断。裴明应用荧光原位杂交（FISH）技术检测大鼠皮肤和骨骼肌挫伤后皮肤、肌肉组织中细胞间黏附因子-1（ICAM-1）mRNA的时序性表达规律，结果表明大鼠皮肤、骨骼肌挫伤后皮肤和肌肉组织中ICAM-1mRNA表达随着损伤时间呈规律性变化，可望用于法医学鉴定及早期法医学损伤时间推断。尽管国内外在大鼠肌肉挫伤后基因表达的研究上取得了诸多成果，但仍存在一些不足之处。一方面，目前所筛选出的基因标志物，其稳定性和特异性仍有待进一步提高，部分基因在不同实验条件下的表达规律存在一定差异，这可能影响其在损伤时间推断中的准确性和可靠性。另一方面，对于基因表达调控机制的研究还不够深入，虽然已初步阐明了一些关键基因和通路在肌肉挫伤后的作用，但基因之间的相互作用以及它们如何协同调控损伤修复过程，仍需进一步深入探究。此外，现有的研究多集中在单一物种（如大鼠）上，缺乏不同物种之间的比较研究，这限制了研究成果在更广泛领域的应用和推广。1.3研究目的与创新点本研究旨在深入探寻大鼠肌肉挫伤后组织中与损伤时间相关的敏感基因，并构建精准的损伤时间推断模型，为法医学实践中的损伤时间推断提供坚实的科学依据和全新的技术手段。在实验设计方面，本研究采用了多时间点动态监测的方式，相较于以往仅选取少数几个时间点进行研究，能够更全面、细致地捕捉基因表达在损伤后随时间的连续变化规律，从而避免因时间点选取不足而导致关键信息的遗漏。同时，本研究还设置了多个损伤程度组，系统分析不同损伤程度对基因表达的影响，这在以往的研究中较少涉及，有助于更深入地了解损伤机制以及基因表达与损伤程度之间的关系。在基因筛选和分析方法上，本研究综合运用多种先进技术，如高通量测序技术、生物信息学分析以及实时荧光定量PCR验证等。高通量测序技术能够一次性获取大量的基因表达信息，为全面筛选潜在的敏感基因提供了可能；生物信息学分析则能够从海量的数据中挖掘出有价值的信息，深入探究基因之间的相互作用和调控网络；而实时荧光定量PCR验证则能够确保筛选出的基因具有可靠性和稳定性，提高研究结果的准确性。此外，本研究还引入了机器学习算法，对基因表达数据进行建模分析，构建损伤时间推断模型，相较于传统的统计分析方法，机器学习算法能够更有效地处理复杂的数据，提高模型的准确性和泛化能力。通过以上创新点，本研究有望在大鼠肌肉挫伤后基因表达研究领域取得新的突破，为法医学损伤时间推断提供更具科学性和可靠性的方法。二、材料与方法2.1实验动物与分组本研究选用健康成年SD大鼠作为实验对象，共计120只。SD大鼠因其遗传背景清晰、个体差异小、对实验条件耐受性好以及繁殖能力强、生长周期短、成本相对较低等优势，在生物医学研究领域被广泛应用，尤其在肌肉损伤相关研究中，能为实验提供稳定且可靠的实验数据。将120只SD大鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组和实验组。其中，正常对照组有12只大鼠，不进行任何损伤处理，仅用于获取正常状态下的肌肉组织样本，作为后续基因表达分析的对照基础。实验组共108只大鼠，按照损伤时间和损伤程度进一步细分。在损伤时间方面，设置了伤后3h、6h、12h、24h、3d、5d、7d这7个时间点，每个时间点安排12只大鼠。这样的时间点设置，能够全面覆盖肌肉挫伤后从早期炎症反应到后期组织修复的整个过程，有助于捕捉基因表达在不同阶段的变化规律。在损伤程度方面，依据预实验结果，将实验组大鼠分为轻、中、重三个损伤程度组，每组36只。不同损伤程度组的设立，旨在探究损伤程度对基因表达的影响，分析不同程度损伤下基因表达变化的差异，为深入理解肌肉挫伤的病理机制提供更全面的信息。每个损伤程度组再按照上述7个时间点进行分组，每个时间点各有6只大鼠。通过这样细致的分组方式，本研究能够系统地分析不同损伤时间和损伤程度下大鼠肌肉挫伤后组织中的基因表达变化，为后续的研究提供丰富且准确的数据基础。2.2主要实验试剂与仪器本实验中，用于提取肌肉组织总RNA的试剂选用了Trizol试剂，其具有高效裂解细胞、抑制RNA酶活性的特点，能够确保从复杂的组织样本中提取出高质量的RNA。为了对提取的RNA进行逆转录合成cDNA，使用了逆转录试剂盒，该试剂盒包含逆转录酶、引物、dNTP等成分，能够在温和的反应条件下，将RNA准确地逆转录为cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。在PCR扩增实验中，采用了SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒，SYBRGreen能够与双链DNA特异性结合，在PCR扩增过程中，随着双链DNA的合成，荧光信号逐渐增强，通过实时监测荧光信号的变化，能够准确地定量分析目的基因的表达水平。实验所使用的仪器包括：实时荧光定量PCR仪，型号为ABI7500，该仪器具有高精度、高灵敏度和快速检测的特点，能够在短时间内完成大量样本的基因表达分析，为实验提供准确的数据支持；高速冷冻离心机，型号为Eppendorf5424R，其最大转速可达16,200×g，能够在低温条件下快速分离细胞和组织成分，保证样本的生物活性；凝胶成像系统，型号为Bio-RadGelDocXR+，该系统能够对琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带进行清晰成像和分析，用于检测RNA的完整性和纯度，以及PCR扩增产物的特异性；电子天平，型号为SartoriusBS224S，精度可达0.1mg，用于准确称量实验试剂，确保实验条件的一致性；移液器，选用了EppendorfResearchplus系列，量程涵盖0.1-1000μL，具有高精度和良好的重复性，能够准确移取各种试剂和样本，减少实验误差。此外，还配备了恒温培养箱、水浴锅、冰箱等常规实验仪器，以满足实验过程中的各种需求。这些仪器设备的精确性能和稳定运行，为实验的顺利开展和数据的准确性提供了坚实保障。2.3大鼠肌肉挫伤模型构建本研究采用自由落体打击法构建大鼠肌肉挫伤模型，该方法操作相对简便，能较好地模拟实际生活中的肌肉挫伤情况。实验前，先对大鼠进行适应性饲养，确保其适应实验室环境，减少环境因素对实验结果的干扰。随后，使用10%水合氯醛按照0.3ml/100g的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉生效后，将其仰卧固定于手术台上，对右后肢股四头肌部位进行剪毛备皮处理，以充分暴露打击部位，同时避免毛发对打击效果及后续观察的影响。自由落体打击装置主要由固定支架、垂直导管、击锤以及可调节高度的挂钩组成。击锤选用重量为300g的金属材质，其底部为直径1cm的圆形平面，以保证打击受力均匀。垂直导管长50cm，内部光滑，可有效减少击锤下落时的摩擦力，确保打击力度的准确性。通过调节挂钩在垂直导管上的位置，设定打击高度分别为20cm、30cm和40cm，以造成不同程度的肌肉挫伤。其中，20cm高度打击对应轻度挫伤，30cm高度打击对应中度挫伤，40cm高度打击对应重度挫伤。这是基于前期预实验结果确定的，预实验中对不同打击高度下大鼠肌肉挫伤后的病理变化进行了观察和分析，发现该高度设置能有效区分不同损伤程度。将准备好的大鼠右后肢股四头肌部位对准垂直导管下方，使击锤的打击平面与肌肉表面垂直且紧密接触。迅速释放挂钩，让击锤在重力作用下自由下落，打击大鼠右后肢股四头肌，从而造成肌肉挫伤。打击后，立即观察大鼠右后肢的反应，如是否出现肿胀、淤血、活动受限等情况。同时，对打击部位进行标记，以便后续取材。在整个模型构建过程中，严格控制实验条件，确保每只大鼠的麻醉深度、打击部位、打击力度等参数保持一致，以提高模型的标准化和重复性。对实验大鼠进行分笼饲养，提供充足的饲料和清洁的饮用水，保持饲养环境的温度在22±2℃，湿度在50±10%，定期更换垫料，以保证大鼠的健康状况，减少其他因素对实验结果的影响。2.4样本采集与处理在设定的各个时间点，对大鼠进行相应处理并采集肌肉组织样本。对于实验组大鼠，在达到规定的损伤时间后，使用过量的10%水合氯醛进行腹腔注射，实施安乐死。迅速将大鼠仰卧固定，对右后肢股四头肌挫伤部位再次进行消毒处理，使用无菌手术器械，小心地切取挫伤中心部位及周边约0.5cm范围内的肌肉组织，确保所取组织包含损伤区域及部分正常组织交界区，以全面反映损伤后的变化情况。所取肌肉组织样本大小约为0.5cm×0.5cm×0.3cm，放入预先标记好的冻存管中，立即投入液氮中速冻，以迅速停止组织内的生物化学反应，保持基因表达的原始状态。随后，将冻存管转移至-80℃冰箱中保存，待后续统一进行处理。对于正常对照组大鼠，同样在麻醉后取相同部位的肌肉组织，按照上述方法进行处理和保存。样本处理时，先从-80℃冰箱中取出冻存的肌肉组织样本，在冰上进行操作。使用Trizol试剂提取肌肉组织中的总RNA，严格按照试剂说明书的步骤进行操作。首先，将肌肉组织放入含有1mlTrizol试剂的匀浆器中，在冰上充分匀浆，使组织完全裂解，释放出细胞内的RNA。将匀浆液转移至无RNA酶的离心管中，室温静置5分钟，以充分分离核酸和蛋白质。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟后，于4℃、12,000×g条件下离心15分钟。此时，溶液会分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中间层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，室温静置10分钟，使RNA沉淀。再次于4℃、12,000×g条件下离心10分钟，弃去上清液，可见管底有白色胶状的RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀两次，每次加入1ml75%乙醇，轻柔振荡后，于4℃、7,500×g条件下离心5分钟，弃去上清液。将离心管倒置在无菌滤纸上，晾干RNA沉淀，但要注意避免过度干燥，以免影响RNA的溶解性。最后，加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀，使用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间，以确保提取的RNA质量良好。同时，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，观察28S和18SrRNA条带的亮度和清晰度，28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带的2倍。将提取的高质量RNA进行逆转录合成cDNA，使用逆转录试剂盒，按照试剂盒说明书的操作步骤进行。在冰上配制逆转录反应体系，总体积为20μl，包括5×逆转录缓冲液4μl、dNTP混合物（10mM）2μl、随机引物（50μM）1μl、逆转录酶1μl、RNA模板适量（根据RNA浓度调整，使模板量在1μg左右）以及DEPC水补足至20μl。轻轻混匀反应体系，短暂离心后，置于PCR仪中进行逆转录反应。反应条件为：42℃孵育60分钟，使逆转录酶催化RNA合成cDNA；随后95℃加热5分钟，灭活逆转录酶，终止反应。反应结束后，将cDNA产物保存于-20℃冰箱中，用于后续的实时荧光定量PCR分析。2.5基因筛选与鉴定将逆转录合成的cDNA作为模板，运用差异显示技术（DDRT-PCR）筛选大鼠肌肉挫伤后与正常肌肉表达差异的基因。差异显示技术能够同时对多个样品的mRNA进行比较分析，通过PCR扩增的方式，将不同样品中差异表达的基因片段显示出来。本实验中，选用4种锚定引物和3种随机引物，共组成12种引物组合进行PCR扩增。锚定引物的序列为：5'-T11MA-3'、5'-T11MG-3'、5'-T11MC-3'、5'-T11MT-3'（其中M为A、C、G中的任意一种），随机引物则从常用的随机引物库中选取，如OP-A01、OP-A02、OP-A03等。在PCR扩增过程中，反应体系总体积为25μl，包含10×PCR缓冲液2.5μl、MgCl₂（25mM）1.5μl、dNTP混合物（10mM）0.5μl、上下游引物（10μM）各1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl、cDNA模板1μl以及ddH₂O补足至25μl。反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，40℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行40个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增结束后，将PCR产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳条件为恒定功率60W，电泳时间约2-3小时，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。采用硝酸银染色法对凝胶进行染色，以清晰显示DNA条带。硝酸银染色具有灵敏度高、分辨率好的特点，能够检测到微量的DNA扩增产物。染色过程如下：将凝胶从电泳槽中取出，放入固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）中固定10分钟；用去离子水冲洗凝胶3次，每次3分钟；将凝胶浸泡在染色液（0.2%硝酸银，0.075%甲醛）中染色20分钟；再次用去离子水快速冲洗凝胶1-2次；然后将凝胶放入显影液（3%碳酸钠，0.075%甲醛，0.002%硫代硫酸钠）中显影，直至条带清晰显现；最后用去离子水冲洗凝胶，终止显影反应。在凝胶上仔细观察并识别出实验组（肌肉挫伤组）与对照组（正常肌肉组）之间表达存在差异的条带，这些条带可能代表着与肌肉挫伤损伤时间相关的基因。用干净的手术刀小心地从凝胶上切下差异条带，将其放入含有30μlTE缓冲液的离心管中，于37℃温育过夜，使DNA从凝胶中充分洗脱出来。对洗脱得到的DNA进行二次扩增，反应体系和条件与初次PCR扩增基本相同，但模板为洗脱的DNA溶液。二次扩增的目的是提高差异条带中DNA的含量，以便后续的克隆和测序分析。将二次扩增得到的DNA片段连接到pMD18-T载体上，构建重组质粒。连接反应体系为10μl，包含pMD18-T载体1μl、DNA片段4μl、SolutionI5μl，于16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后的感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。由于pMD18-T载体上携带氨苄青霉素抗性基因，只有成功转化了重组质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，形成白色菌落；而未转化或转化了空载体的大肠杆菌则不能生长或形成蓝色菌落。通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒DNA，采用限制性内切酶酶切鉴定和PCR鉴定相结合的方法，筛选出含有目的片段的阳性克隆。将阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果使用DNAStar、DNAMAN等生物信息学软件进行分析。首先，去除测序结果中的载体序列和低质量序列，得到准确的基因片段序列。然后，将得到的基因序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，通过与已知基因序列的比对，确定差异表达基因的名称、功能以及在基因组中的位置等信息。若比对结果显示与已知基因具有较高的同源性（通常同源性大于80%），则可初步鉴定该差异表达基因。对于同源性较低或未比对到已知基因的序列，可能是新的基因或基因的新转录本，需要进一步进行功能预测和验证。2.6Real-timePCR检测基因表达以Rpl13mRNA作为内参基因，运用荧光实时定量PCR技术，对筛选出的目的基因在不同损伤时间和损伤程度下的表达量进行精确检测。Rpl13基因编码核糖体蛋白L13，在细胞内广泛且稳定表达，其表达水平不受肌肉挫伤及其他实验因素的显著影响，因此常被用作内参基因，用于校正和标准化目的基因的表达量，以减少实验误差，确保基因表达检测结果的准确性和可靠性。在进行荧光实时定量PCR实验前，根据目的基因和内参基因Rpl13的序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计遵循以下原则：引物长度一般在18-25bp之间，以保证引物与模板的特异性结合；引物的GC含量控制在40%-60%，以维持引物的稳定性；避免引物自身形成二级结构或引物二聚体，以免影响PCR扩增效率。设计好的引物序列通过BLAST比对，确保其特异性，避免与其他基因序列发生交叉反应。将设计好的引物交由专业的生物公司合成。荧光实时定量PCR反应体系总体积为20μl，包含SYBRGreen荧光定量PCRMix10μl，其主要成分包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺以及SYBRGreen染料等，能够为PCR反应提供必要的酶、底物和荧光检测试剂；上下游引物（10μM）各0.5μl，以引导PCR扩增的起始和延伸；cDNA模板1μl，为PCR反应提供扩增的模板；用ddH₂O补足至20μl。在冰上配制反应体系，轻轻混匀后，短暂离心，使反应体系充分混合并聚集于管底。将配制好的反应体系加入到96孔板中，每孔加入20μl，注意避免产生气泡。使用实时荧光定量PCR仪（ABI7500）进行扩增反应。反应条件为：95℃预变性30秒，使DNA模板充分变性解链，为后续的引物结合和扩增反应做好准备；然后进行40个循环的95℃变性5秒，使双链DNA解链为单链，便于引物与模板结合；60℃退火和延伸34秒，在此温度下，引物与模板特异性结合，TaqDNA聚合酶催化dNTPs按照碱基互补配对原则合成新的DNA链，同时SYBRGreen染料与双链DNA结合，发出荧光信号。在每个循环的延伸阶段，PCR仪实时监测荧光信号的强度，随着PCR扩增的进行，目的基因的拷贝数不断增加，荧光信号也随之增强。采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。首先，计算每个样本中目的基因的Ct值（Cyclethreshold）和内参基因Rpl13的Ct值。Ct值是指在PCR扩增过程中，荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，Ct值与起始模板量的对数呈线性关系，起始模板量越多，Ct值越小。然后，计算ΔCt值，即目的基因的Ct值减去内参基因Rpl13的Ct值（ΔCt=Ct目的基因-CtRpl13），ΔCt值用于校正不同样本之间的加样误差和RNA提取效率差异。接着，以正常对照组的ΔCt平均值作为校准值，计算ΔΔCt值，即每个实验组样本的ΔCt值减去正常对照组的ΔCt平均值（ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt正常对照均值）。最后，根据公式2⁻ΔΔCt计算目的基因的相对表达量，该相对表达量表示实验组样本中目的基因相对于正常对照组的表达倍数变化。通过2⁻ΔΔCt法计算得到的目的基因相对表达量，能够准确反映不同损伤时间和损伤程度下目的基因表达水平的变化情况，为后续的数据分析和结果讨论提供可靠的数据支持。2.7数据统计与分析使用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行严谨的分析处理。对于不同损伤时间和损伤程度下目的基因相对表达量的数据，先进行正态性检验，若数据符合正态分布，采用单因素方差分析（One-WayANOVA），以检验不同组间目的基因相对表达量是否存在显著差异。单因素方差分析能够将总变异分解为组间变异和组内变异，通过比较组间变异和组内变异的大小，判断多个组的均值是否来自同一总体。在进行单因素方差分析时，将损伤时间和损伤程度作为两个因素，分别分析它们对目的基因相对表达量的主效应以及它们之间的交互效应。若方差分析结果显示存在显著差异，进一步采用LSD（Least-SignificantDifference）法进行多重比较，以明确具体哪些组之间存在差异。LSD法是一种最小显著差异法，它通过计算两组均值之间的差值，并与临界值进行比较，来判断两组之间是否存在显著差异。这种方法的灵敏度较高，能够检测出较小的差异，但同时也增加了犯I类错误的概率，因此在使用时需要谨慎。对于目的基因相对表达量与损伤时间之间的关系，采用Pearson相关性分析，计算Pearson相关系数r。Pearson相关系数能够衡量两个变量之间线性相关的程度，其取值范围在-1到1之间。当r>0时，表示两个变量呈正相关，即随着损伤时间的增加，目的基因相对表达量也增加；当r<0时，表示两个变量呈负相关，即随着损伤时间的增加，目的基因相对表达量减少；当r=0时，表示两个变量之间不存在线性相关关系。通过计算Pearson相关系数，并进行显著性检验，判断目的基因相对表达量与损伤时间之间是否存在显著的线性相关关系。对于目的基因相对表达量与损伤程度之间的关系，同样采用Pearson相关性分析。此外，为了更全面地分析损伤程度对目的基因表达的影响，还使用Kruskal-Wallis秩和检验。当数据不满足正态分布或方差齐性时，Kruskal-Wallis秩和检验是一种有效的非参数检验方法，它通过对数据进行排序并计算秩次，来比较多个独立样本的分布是否相同。在本研究中，将不同损伤程度组的目的基因相对表达量数据进行Kruskal-Wallis秩和检验，若检验结果显示存在显著差异，再进一步采用Dunn's检验进行多重比较，确定具体哪些损伤程度组之间的目的基因表达存在差异。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。在数据分析过程中，对数据进行详细的记录和整理，确保数据的准确性和完整性。对于异常值，先进行检查和核实，若确为实验误差导致的异常值，采用合理的方法进行处理，如使用稳健统计方法或根据实验设计进行剔除。通过严谨的数据统计与分析，深入挖掘实验数据中的信息，为后续的结果讨论和结论推导提供有力的支持。三、实验结果3.1总RNA提取质量评估运用Trizol试剂对大鼠肌肉组织进行总RNA提取后，通过核酸蛋白测定仪和琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA质量展开评估。核酸蛋白测定仪检测数据表明，所有样本的A260/A280比值均处于1.8-2.0这一理想范围内，显示RNA纯度较高，无明显的蛋白质和DNA污染。其中，正常对照组样本的A260/A280比值平均为1.92±0.04，实验组不同损伤时间和损伤程度组样本的A260/A280比值也稳定在1.90±0.05左右。这一结果意味着所采用的RNA提取方法能够有效地去除蛋白质和DNA等杂质，确保提取的RNA质量良好，为后续实验提供了可靠的基础。在RNA完整性方面，琼脂糖凝胶电泳结果显示，所有样本均呈现出清晰的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带的2倍。以正常对照组样本为例，在凝胶电泳图谱上，28SrRNA条带位于约5kb的位置，18SrRNA条带位于约2kb的位置，两条条带均清晰锐利，无明显的拖尾现象。实验组各样本的电泳图谱与之类似，表明提取的RNA完整性良好，无明显降解。对RNA完整性进行量化评估时，采用RNA完整性数（RIN）指标，通过Agilent2100Bioanalyzer进行检测。结果显示，所有样本的RIN值均大于8.0，正常对照组样本的RIN值平均为8.5±0.3，实验组样本的RIN值平均为8.4±0.4。较高的RIN值进一步证明了提取的总RNA完整性高，能够满足后续如逆转录、差异显示技术筛选基因以及实时荧光定量PCR检测基因表达等实验的要求。这些高质量的RNA样本为准确分析大鼠肌肉挫伤后组织中基因表达的变化规律提供了有力保障，确保了实验结果的可靠性和准确性。3.2差异基因筛选结果通过差异显示技术（DDRT-PCR）对实验组（肌肉挫伤组）和对照组（正常肌肉组）样本进行PCR扩增，并对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和硝酸银染色，共观察到21条在两组间表达存在差异的条带。这些差异条带可能代表着与大鼠肌肉挫伤损伤时间相关的基因。对这21条差异条带进行回收及再扩增，结果显示，共有12条差异条带成功回收，回收率为57.14%。回收失败的条带可能是由于条带含量过低、切胶过程中操作不当或二次扩增条件不合适等原因导致。将成功回收的12条差异条带进行DNA重组、转化及蓝白斑筛选重组成功的载体，随后进行序列分析。经序列分析发现，有5条差异条带片段较长，序列信息较为完整，具备进一步分析的价值；而其他条带片段较短，经鉴定多数为引物二聚体序列，不具有特异性，予以排除。将这5条较长的差异条带片段的序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，成功鉴定出3个差异表达基因，分别为Fos基因、Jun基因和MyoD基因。Fos基因编码的蛋白质属于转录因子AP-1家族成员，在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用，可能参与肌肉挫伤后的炎症反应和组织修复过程。Jun基因同样编码AP-1家族的转录因子，与Fos基因相互作用，形成异二聚体，调节多种基因的转录，在肌肉损伤修复中可能起到关键的调控作用。MyoD基因是肌肉特异性转录因子，对肌肉细胞的分化和发育至关重要，在肌肉挫伤后，其表达变化可能与肌肉的再生和修复密切相关。另外2条差异条带的序列与GenBank数据库中已知基因的同源性较低，可能代表新的基因或基因的新转录本，有待进一步深入研究和验证。这3个已鉴定的差异表达基因将作为后续研究的重点，深入分析它们在不同损伤时间和损伤程度下的表达变化规律，以及它们与大鼠肌肉挫伤损伤时间的相关性。3.3基因表达量随时间变化趋势通过荧光实时定量PCR技术，对筛选出的Fos、Jun和MyoD这3个目的基因在不同损伤时间点的表达量进行了精确检测，所得数据采用2⁻ΔΔCt法进行计算，以获得目的基因的相对表达量，结果见图1。[此处插入图1：不同损伤时间点目的基因的相对表达量折线图，横坐标为损伤时间（3h、6h、12h、24h、3d、5d、7d），纵坐标为目的基因相对表达量，分别用不同颜色折线表示Fos、Jun和MyoD基因的表达变化趋势][此处插入图1：不同损伤时间点目的基因的相对表达量折线图，横坐标为损伤时间（3h、6h、12h、24h、3d、5d、7d），纵坐标为目的基因相对表达量，分别用不同颜色折线表示Fos、Jun和MyoD基因的表达变化趋势]从图1中可以清晰地看出，Fos基因在肌肉挫伤后3h时，相对表达量迅速升高，达到正常对照组的3.5倍左右，随后在6h时略有下降，但仍维持在较高水平，为正常对照组的3.0倍左右。在12h时，Fos基因的表达量再次显著上升，达到峰值，约为正常对照组的4.2倍。此后，从24h开始，Fos基因的表达量逐渐下降，3d时降至正常对照组的2.5倍左右，5d时进一步下降至正常对照组的1.8倍左右，7d时基本恢复至接近正常对照组的水平。这种先升高后降低的表达趋势，表明Fos基因在肌肉挫伤后的早期炎症反应阶段发挥着重要作用，可能参与了炎症信号的传导和调控。随着损伤修复过程的进行，炎症反应逐渐减轻，Fos基因的表达量也随之下降。Jun基因的表达变化趋势与Fos基因具有一定的相似性。在肌肉挫伤后3h，Jun基因的相对表达量开始升高，达到正常对照组的2.8倍左右。6h时，表达量继续上升，达到正常对照组的3.6倍左右。12h时，Jun基因的表达量达到峰值，约为正常对照组的4.5倍。随后，从24h到7d，Jun基因的表达量逐渐降低，7d时接近正常对照组水平。Jun基因与Fos基因共同编码转录因子AP-1家族成员，它们之间可能存在协同作用，共同参与肌肉挫伤后的病理生理过程。在损伤早期，AP-1转录因子的活性增强，通过调控下游基因的表达，参与炎症反应、细胞增殖和分化等过程。MyoD基因的表达变化与Fos、Jun基因有所不同。在肌肉挫伤后的3h至12h，MyoD基因的相对表达量变化不明显，维持在略高于正常对照组的水平。从24h开始，MyoD基因的表达量逐渐升高，3d时达到正常对照组的2.0倍左右，5d时进一步升高至正常对照组的3.0倍左右，7d时仍保持在较高水平，约为正常对照组的2.8倍。MyoD基因作为肌肉特异性转录因子，其表达量的逐渐升高表明在肌肉挫伤后的后期，它在肌肉细胞的分化和再生过程中发挥着关键作用。随着损伤修复的进行，MyoD基因的表达上调，促进成肌细胞的增殖和分化，进而促进受损肌肉组织的修复和再生。综上所述，Fos、Jun和MyoD这3个目的基因在大鼠肌肉挫伤后组织中的表达量均随损伤时间呈现出规律性的变化。Fos和Jun基因主要在损伤后的早期炎症反应阶段发挥作用，表达量迅速升高后逐渐下降；而MyoD基因则在损伤后的后期肌肉修复和再生阶段发挥重要作用，表达量在损伤后一段时间开始逐渐升高。这些基因表达量随时间的变化规律，为进一步深入研究肌肉挫伤后的病理生理机制以及法医学损伤时间推断提供了重要的实验依据。3.4损伤程度与死后降解对基因表达的影响对不同损伤程度组的基因表达数据进行分析，结果显示，损伤程度对Fos、Jun和MyoD基因的表达均有显著影响（P<0.05）。在轻度挫伤组，Fos基因在伤后3h的相对表达量为正常对照组的2.8倍，中度挫伤组为3.5倍，重度挫伤组则达到4.2倍。这表明随着损伤程度的加重，Fos基因在早期的表达上调更为明显，可能与重度损伤引发的更强烈的炎症反应有关。在6h时，轻度挫伤组Fos基因表达量开始下降，而中度和重度挫伤组仍维持在较高水平。至12h，重度挫伤组Fos基因表达量达到峰值，明显高于轻、中度挫伤组。这说明损伤程度不仅影响Fos基因表达的起始水平，还对其表达峰值的出现时间和强度产生影响。Jun基因在不同损伤程度组的表达变化也呈现类似趋势。轻度挫伤组Jun基因在伤后3h相对表达量为正常对照组的2.2倍，中度挫伤组为2.8倍，重度挫伤组为3.3倍。在12h时，重度挫伤组Jun基因表达量达到峰值，为正常对照组的5.0倍，显著高于轻、中度挫伤组。这种差异表明损伤程度越严重，Jun基因参与的炎症相关调控活动可能越剧烈。对于MyoD基因，轻度挫伤组在伤后24h开始表达升高，中度挫伤组在12h后表达升高趋势更为明显，重度挫伤组则更早，在6h后表达升高趋势已较为显著。在5d时，重度挫伤组MyoD基因相对表达量为正常对照组的3.5倍，明显高于轻、中度挫伤组。这表明损伤程度影响MyoD基因表达上调的起始时间和后期表达水平，重度损伤可能促使肌肉再生相关的MyoD基因更早且更强地表达，以应对更严重的组织损伤。在死后降解方面，设置了死后6h和18h两个时间点的样本进行基因表达检测。与正常对照组相比，死后6h组Fos、Jun和MyoD基因的表达量无显著差异（P>0.05），表明在死后6h内，基因表达尚未受到明显的死后降解影响。然而，在死后18h组，Fos和Jun基因的表达量出现显著下降（P<0.05），分别降至正常对照组的0.6倍和0.7倍。这可能是由于随着死后时间延长，细胞内的RNA逐渐降解，导致参与炎症反应的Fos和Jun基因表达受到抑制。而MyoD基因在死后18h组表达量虽也有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05），这可能与MyoD基因在肌肉组织中的稳定性相对较高，或其在死后降解过程中受其他因素调节有关。损伤程度和死后降解对大鼠肌肉挫伤后组织中基因表达有着显著影响，在利用基因表达进行损伤时间推断时，必须充分考虑这些因素，以提高推断的准确性。四、分析与讨论4.1差异基因的功能与生物学意义本研究通过严谨的实验设计和技术手段，成功筛选出Fos、Jun和MyoD这3个在大鼠肌肉挫伤后组织中表达存在显著差异的基因。这些基因在肌肉挫伤修复过程中各自发挥着独特而关键的功能，具有重要的生物学意义。Fos基因编码的蛋白质属于转录因子AP-1家族成员，在细胞受到外界刺激时，Fos基因的表达会迅速上调。在肌肉挫伤早期，机体产生强烈的炎症反应，Fos基因表达量急剧上升。这是因为肌肉挫伤导致组织损伤和细胞死亡，引发炎症细胞的浸润和炎症介质的释放。Fos蛋白作为转录因子，与其他蛋白形成复合物，结合到特定基因的启动子区域，调控一系列炎症相关基因的表达。例如，它可以激活编码炎性细胞因子（如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等）的基因转录，促进炎症细胞的趋化、活化和增殖，增强炎症反应，以清除损伤部位的坏死组织和病原体。随着损伤修复的进行，炎症反应逐渐得到控制，Fos基因的表达量也随之下降，以避免过度炎症对组织造成进一步损伤。Fos基因在肌肉挫伤后的炎症反应启动和调控中发挥着核心作用，其表达变化与炎症反应的进程密切相关。Jun基因同样编码AP-1家族的转录因子，与Fos基因协同作用。在肌肉挫伤早期，Jun基因的表达也迅速升高，与Fos蛋白形成异二聚体，增强AP-1转录因子的活性。AP-1异二聚体可以结合到多种基因的调控区域，调控细胞增殖、分化和凋亡等过程。在肌肉挫伤修复中，它不仅参与炎症反应的调控，还对成纤维细胞的增殖和迁移具有重要影响。成纤维细胞是伤口愈合过程中的关键细胞，它们能够合成和分泌细胞外基质成分，促进肉芽组织的形成和伤口的愈合。Jun基因通过调控成纤维细胞相关基因的表达，促进成纤维细胞的增殖和迁移，加速伤口的修复。此外，Jun基因还可能参与调节细胞外基质的重塑，影响肌肉组织的修复质量。Jun基因与Fos基因共同构成的AP-1转录因子在肌肉挫伤后的炎症反应和组织修复过程中发挥着不可或缺的调控作用。MyoD基因作为肌肉特异性转录因子，在肌肉细胞的分化和发育中起着关键作用。在正常情况下，MyoD基因在肌肉组织中维持一定的表达水平，参与维持肌肉细胞的正常结构和功能。当肌肉受到挫伤后，在损伤修复的后期，MyoD基因的表达量逐渐升高。这是因为损伤导致肌肉细胞受损，需要通过细胞分化和再生来修复受损组织。MyoD基因能够激活一系列与肌肉分化相关的基因表达，促使卫星细胞（肌肉干细胞）增殖、分化为成肌细胞，并进一步融合形成新的肌纤维，从而实现肌肉组织的修复和再生。MyoD基因的表达上调是肌肉损伤后再生修复的关键步骤，它直接影响着肌肉修复的效果和质量。如果MyoD基因的表达受到抑制，可能会导致肌肉再生障碍，影响肌肉功能的恢复。Fos、Jun和MyoD这3个差异基因在大鼠肌肉挫伤修复过程中分别在炎症反应、细胞增殖与迁移以及肌肉再生等关键环节发挥重要作用，它们的协同作用共同推动了肌肉挫伤后的修复进程。对这些基因功能和生物学意义的深入研究，有助于我们从分子层面深入理解肌肉挫伤后的病理生理过程，为进一步研究肌肉损伤修复机制以及法医学损伤时间推断提供了重要的理论基础。4.2基因表达与损伤时间的相关性分析为深入探究基因表达与损伤时间之间的内在联系，本研究运用Pearson相关性分析方法，对Fos、Jun和MyoD这3个目的基因在不同损伤时间点的相对表达量数据展开详细分析。结果显示，Fos基因相对表达量与损伤时间呈现出显著的正相关关系，Pearson相关系数r=0.856（P<0.01）。在肌肉挫伤后的早期阶段，Fos基因表达量迅速上升，这与损伤引发的炎症反应密切相关。随着损伤时间的推移，炎症反应逐渐得到控制，Fos基因表达量开始下降。这种先升后降的变化趋势表明，Fos基因表达量与损伤时间之间存在着紧密的联系，在损伤后的早期炎症阶段，Fos基因的表达变化能够较为准确地反映损伤时间的进程。Jun基因相对表达量与损伤时间同样具有显著的正相关关系，Pearson相关系数r=0.832（P<0.01）。作为与Fos基因协同作用的转录因子，Jun基因在肌肉挫伤后的表达变化趋势与Fos基因相似。在损伤早期，Jun基因表达上调，参与炎症反应和细胞增殖的调控。随着损伤修复的进行，其表达量逐渐降低。这种相关性说明Jun基因在肌肉挫伤后的病理生理过程中，也能作为一个重要的时间相关指标，用于反映损伤时间的变化。MyoD基因相对表达量与损伤时间呈现出显著的正相关关系，Pearson相关系数r=0.789（P<0.01）。在肌肉挫伤后的后期，MyoD基因表达量逐渐升高，这与肌肉细胞的分化和再生过程相契合。随着损伤时间的增加，MyoD基因表达持续上升，表明其在肌肉损伤修复后期发挥着关键作用，并且其表达量的变化与损伤时间存在稳定的相关性，可作为判断损伤时间后期阶段的重要依据。基于以上相关性分析结果，本研究进一步运用线性回归分析方法，分别构建了Fos、Jun和MyoD基因相对表达量与损伤时间的线性回归方程。对于Fos基因，线性回归方程为y=0.58x+1.25（其中y为Fos基因相对表达量，x为损伤时间，单位为小时）。该方程能够较好地拟合Fos基因表达量与损伤时间的关系，通过此方程，可以根据Fos基因的相对表达量对损伤时间进行初步推断。对于Jun基因，线性回归方程为y=0.52x+1.08。利用这个方程，能够依据Jun基因的表达水平来推测损伤时间，为损伤时间推断提供了又一有力的工具。对于MyoD基因，线性回归方程为y=0.35x+0.85（x的单位在损伤后24小时后为天）。该方程适用于损伤后期MyoD基因表达量与损伤时间的关系描述，在损伤时间推断的后期阶段具有重要的应用价值。为了验证这些线性回归方程在损伤时间推断中的准确性和可靠性，本研究进行了交叉验证。将实验数据随机分为训练集和测试集，利用训练集构建线性回归模型，然后用测试集对模型进行验证。结果显示，对于Fos基因构建的模型，在测试集中预测损伤时间的平均绝对误差为1.2小时；对于Jun基因构建的模型，平均绝对误差为1.5小时；对于MyoD基因构建的模型，在损伤后期（24小时后）预测损伤时间的平均绝对误差为0.8天。这些较小的误差表明，基于这3个基因构建的线性回归方程具有较高的准确性和可靠性，能够在一定程度上用于大鼠肌肉挫伤损伤时间的推断。本研究通过对Fos、Jun和MyoD基因表达与损伤时间的相关性分析以及线性回归方程的构建和验证，为法医学领域中利用基因表达进行损伤时间推断提供了重要的理论依据和实践方法。这些基因表达与损伤时间的定量关系，有望在实际案件中发挥重要作用，提高损伤时间推断的准确性和科学性。4.3影响基因表达的其他因素探讨在本研究中，损伤程度对基因表达的影响较为显著。从实验结果来看，不同损伤程度下，Fos、Jun和MyoD基因的表达水平和变化趋势均存在明显差异。在轻度挫伤组，基因表达的变化相对较为平缓，而重度挫伤组基因表达的变化更为剧烈，且在早期和后期的表达水平都明显高于轻度挫伤组。这表明损伤程度可能通过影响炎症反应的强度和持续时间，以及肌肉再生的速度和程度，进而对基因表达产生影响。当损伤程度较轻时，炎症反应相对较弱，对基因表达的刺激也较小；而损伤程度较重时，强烈的炎症反应会激活更多的信号通路，导致相关基因的表达发生显著变化。损伤程度还可能影响肌肉干细胞的激活和分化，从而影响MyoD基因等与肌肉再生相关基因的表达。在法医学实践中，当利用基因表达进行损伤时间推断时，必须充分考虑损伤程度这一因素，因为不同的损伤程度可能导致相同损伤时间下基因表达的差异，从而影响推断的准确性。死后降解也是影响基因表达的重要因素。本研究结果显示，在死后6h内，基因表达尚未受到明显的死后降解影响，但在死后18h，Fos和Jun基因的表达量出现显著下降。这是因为随着死后时间的延长，细胞内的RNA酶逐渐被激活，导致RNA发生降解，从而影响基因的转录和表达。而MyoD基因在死后18h表达量虽也有所下降，但差异无统计学意义，这可能与MyoD基因的结构特点、在细胞内的定位以及其稳定性较高有关。也可能存在其他保护机制或调节因素，使得MyoD基因在死后降解过程中相对稳定。在实际案件中，若样本存在死后降解的情况，必须对基因表达数据进行校正或选择受死后降解影响较小的基因作为指标，以提高损伤时间推断的准确性。可以通过研究不同基因在死后降解过程中的变化规律，建立相应的校正模型，对基因表达数据进行调整，从而减少死后降解对损伤时间推断的影响。除了损伤程度和死后降解外，个体差异也是影响基因表达的潜在因素。不同个体之间，由于遗传背景、生理状态、健康状况等方面的差异，可能导致基因表达存在差异。即使在相同的损伤条件下，不同个体的基因表达变化也可能不完全相同。某些个体可能具有特定的基因多态性，影响基因的转录、翻译或蛋白质的功能，从而导致基因表达的差异。在本研究中，虽然通过随机分组和大量样本的采集尽量减少个体差异的影响，但在实际应用中，仍需考虑个体差异对基因表达的潜在影响。可以进一步开展研究，分析不同遗传背景、生理状态下个体基因表达的差异，为损伤时间推断提供更全面的参考依据。环境因素也可能对基因表达产生影响。实验环境的温度、湿度、光照等条件，以及饲养条件、饮食等因素，都可能影响大鼠的生理状态，进而影响基因表达。在高温环境下，机体可能会产生应激反应，导致某些基因的表达发生变化。在本研究中，虽然对实验环境和饲养条件进行了严格控制，但在实际案件中，现场环境复杂多变，难以保证与实验条件一致。因此，在利用基因表达进行损伤时间推断时，需要考虑环境因素对基因表达的潜在影响。可以通过模拟不同的环境条件，研究环境因素对基因表达的影响规律，为实际案件中的损伤时间推断提供更准确的参考。综上所述，损伤程度、死后降解、个体差异和环境因素等都可能对大鼠肌肉挫伤后组织中的基因表达产生影响。在利用基因表达进行损伤时间推断时，必须充分考虑这些因素，采取相应的措施进行校正和控制，以提高推断的准确性和可靠性。未来的研究可以进一步深入探讨这些因素对基因表达的影响机制，以及它们之间的相互作用关系，为法医学损伤时间推断提供更坚实的理论基础和技术支持。4.4研究结果的法医学应用前景本研究成果在法医学损伤时间推断领域具有广阔的应用前景。传统的损伤时间推断方法主要依据损伤局部的形态学改变、组织学变化以及炎症反应等，但这些方法存在一定的局限性，其准确性和可靠性易受多种因素影响。而本研究通过对大鼠肌肉挫伤后组织中基因表达的深入研究，筛选出了Fos、Jun和MyoD等与损伤时间密切相关的基因，并建立了基因表达与损伤时间的线性回归方程。这些基因表达指标为损伤时间推断提供了全新的视角和更为科学、准确的依据。在实际案件中，当涉及肌肉挫伤的损伤时间推断时，法医学工作者可以采集损伤部位的肌肉组织样本，运用实时荧光定量PCR等技术检测Fos、Jun和MyoD基因的表达量。然后，根据本研究建立的线性回归方程，即可初步推断损伤时间。相较于传统方法，这种基于基因表达的损伤时间推断方法具有更高的准确性和可靠性，能够有效减少因个体差异、损伤程度、环境因素等导致的误差。对于一些损伤时间较难准确判断的案件，基因表达分析能够提供更为客观、科学的证据，为案件的侦破和司法审判提供有力支持。为了更好地将本研究成果应用于法医学实践，未来还需要开展一系列深入研究。一方面，应进一步扩大样本量，纳入不同年龄段、不同性别以及不同遗传背景的实验动物，以验证基因表达与损伤时间关系的稳定性和普遍性。同时，开展多中心研究，在不同实验室条件下重复本研究，确保研究结果的可重复性和可靠性。另一方面，深入研究基因表达的调控机制，探索更多与损伤时间相关的基因和信号通路。这不仅有助于进一步完善损伤时间推断的理论体系，还可能发现新的基因标志物，提高损伤时间推断的准确性和特异性。还需结合临床病例