大鼠骨癌痛中脊髓背角TDAG8的作用机制与干预研究

大鼠骨癌痛中脊髓背角TDAG8的作用机制与干预研究一、引言1.1研究背景与意义骨癌痛（BoneCancerPain,BCP）是晚期癌症患者常见且极为严重的症状之一，严重影响患者的生活质量。据统计，约70%-80%的晚期癌症患者会遭受不同程度的疼痛困扰，其中骨癌痛占相当大的比例。这种疼痛不仅给患者带来身体上的痛苦，还对其心理、精神状态造成极大的负面影响，导致患者出现焦虑、抑郁等情绪障碍，甚至降低患者的生存意愿。骨癌痛通常呈进行性加重，从最初的间歇性隐痛逐渐发展为持续性剧痛，常规的止痛药物往往难以有效控制。骨癌痛的发生机制极为复杂，涉及肿瘤细胞对骨组织的直接破坏、肿瘤细胞分泌的细胞因子和炎性介质引发的炎症反应、神经病理性改变以及中枢神经系统的敏化等多个方面。在骨癌痛的病理过程中，肿瘤细胞侵袭骨组织，导致骨质溶解和破坏，释放出多种炎性介质和细胞因子，如前列腺素E2（PGE2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等，这些物质可以激活和敏化伤害感受器，导致疼痛信号的产生和传递增强。肿瘤细胞还可以侵犯周围的神经组织，引起神经损伤和神经病理性疼痛。脊髓背角在疼痛信号的传递和调制中起着关键作用，是痛觉传导的重要枢纽。脊髓背角接收来自外周神经的疼痛信号，并对这些信号进行初步的整合和处理，然后将其传递至大脑皮层产生痛觉感知。在骨癌痛状态下，脊髓背角的神经元活动发生显著改变，包括兴奋性增强、抑制性减弱以及神经递质和受体表达的变化等。T细胞死亡相关基因8（T-celldeathassociatedgene8,TDAG8）是一种质子（H+）敏感的G蛋白偶联受体，可表达于脊髓及背根神经节（DorsalRootGanglion,DRG）等处。在炎性痛的研究中发现，TDAG8参与了疼痛信号的传导和调制过程。当组织发生炎症时，局部环境中的H+浓度升高，可激活TDAG8，进而引发一系列细胞内信号转导通路的激活，导致神经元的兴奋性改变和疼痛敏感性增加。骨癌痛与炎性痛存在一定的差异，骨癌痛中常伴有组织酸化的过程，这应可激活TDAG8，但目前关于TDAG8直接参与骨癌痛的报道相对较少。深入研究脊髓背角TDAG8在大鼠骨癌痛中的作用，对于揭示骨癌痛的发病机制具有重要的科学意义。通过明确TDAG8在骨癌痛中的具体作用及相关信号通路，有望为骨癌痛的治疗提供新的靶点和思路。目前临床上对于骨癌痛的治疗主要依赖于阿片类药物、非甾体抗炎药以及放疗、化疗等方法，但这些治疗手段存在诸多局限性，如阿片类药物的成瘾性、耐受性和不良反应等。若能以TDAG8为靶点开发新型镇痛药物，将为骨癌痛患者提供更有效的治疗选择，从而显著改善患者的生活质量，具有重要的临床应用价值。1.2研究目的与内容本研究旨在深入探讨脊髓背角TDAG8在大鼠骨癌痛中的作用及相关机制，为骨癌痛的治疗提供新的理论依据和潜在靶点。具体研究内容如下：建立大鼠骨癌痛模型并评估：采用经典方法，将Walker256乳腺癌肿瘤细胞注入雌性SD大鼠左侧胫骨骨髓腔内，建立骨癌痛模型。同时设置正常对照组和假手术组，正常对照组不做任何处理，假手术组于左侧胫骨骨髓腔内注射生理盐水。通过观察大鼠的行走痛评分、vonFrey触诱发痛阈值以及X线摄片、HE染色等方法，对模型进行评估，以确定模型是否成功建立。观察脊髓背角TDAG8的表达变化：在成功建立的骨癌痛模型基础上，于接种肿瘤前1天及接种后不同时间点（如第6、9、12、15、18天），处死大鼠并取L4-6脊髓。运用免疫组化染色、免疫荧光、real-timePCR及Westernblot等技术，测定脊髓背角TDAG8的表达变化，明确其在骨癌痛发展过程中的表达趋势。探究TDAG8对骨癌痛大鼠痛行为学的影响：设计并合成针对TDAG8的小干扰RNA（siRNA），利用阳离子聚合物纳米粒jetPEI介导转染技术，将siRNA转染至大鼠脊髓背角神经细胞，以抑制TDAG8的表达。将雌性SD大鼠随机分为正常对照组、骨癌痛组、siRNA组、阴性对照组和转染试剂组，除正常对照组外，其余各组均建立骨癌痛模型。在接种肿瘤同时，对siRNA组、阴性对照组和转染试剂组行鞘内置管，并于接种肿瘤细胞后第6天开始，分别鞘内注射siRNA、错配的siRNA以及siRNA的转染质粒。通过测定各组大鼠接种前1天及接种后不同时间点的左后肢机械缩足阈值，观察鞘内注射siRNA对骨癌痛大鼠痛行为学的影响。分析TDAG8下游信号通路：采用神经药理学的方法，研究TDAG8下游的蛋白激酶A（PKA）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、蛋白激酶C（PKC）和细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）等信号通路是否参与骨癌痛的过程。在正常组、假手术组、BCP6d、BCP12d、BCP18d大鼠L4-6脊髓背角，运用Westernblot等技术，测定PKA、CREB、PKC和ERK1/2的表达变化。使用信号通路抑制剂分别阻断这些信号通路，观察对骨癌痛大鼠痛行为学及TDAG8表达的影响。1.3研究方法与技术路线动物实验：选用雌性SD大鼠，适应性饲养后进行分组。将大鼠分为正常对照组、假手术组和骨癌痛组。采用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射对大鼠进行麻醉，待其完全麻醉后，固定四肢并仰卧于操作台上。对左后肢进行脱毛处理，依次用酒精、碘酒充分擦拭消毒、备皮。在大鼠左后肢胫骨关节下约1cm处切开，用手术刀和止血钳逐层分离肌肉、筋膜并避开血管，暴露胫骨骨面。用1mL注射器在胫骨平台上段离关节处约0.5cm以45度角插入胫骨骨髓腔，有明显落空感后拔出注射器，换用10μL微量注射器，沿着小孔插入胫骨髓腔中，骨癌痛组打入10μLWalker256乳腺癌肿瘤细胞混悬液（1×107个/ml），注射后停针1min，缓慢抽出，快速以无菌骨蜡封针孔，如有溢出，用75%酒精消毒杀死溢出的肿瘤细胞。假手术组大鼠予以胫骨同样位置注射等体积生理盐水。逐层缝合皮肤，涂抹青霉素粉末预防感染。行为学检测：在接种肿瘤前1天及接种后不同时间点（如第1、3、6、9、12、15、18天），采用vonFrey细丝测定大鼠左后肢机械缩足阈值（MWT），评估大鼠的机械痛敏程度。将大鼠置于底部由铁丝网构成的透明玻璃箱中，使其适应环境30min。采用特制的纤维丝构造的刺激针，透过下层铁丝网，将纤维丝以垂直方式刺激大鼠后肢足底中心位置，先是缓慢接触，而后逐渐用力，直至大鼠回缩，记录大鼠回缩时的最小刺激力度，取平均值，连续测量5次，每次测量间隔1min。脊髓组织取材：在相应时间点，将大鼠用过量10%水合氯醛腹腔注射处死，迅速取出L4-6脊髓组织。一部分脊髓组织用于免疫组化、免疫荧光检测，将其固定于4%多聚甲醛溶液中；另一部分脊髓组织用于real-timePCR及Westernblot检测，保存于液氮中备用。免疫组化染色：将固定好的脊髓组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋等处理，制成石蜡切片。切片脱蜡至水后，进行抗原修复，用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性。加入正常山羊血清封闭非特异性抗原，然后滴加兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体，4℃孵育过夜。次日，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育30min，再滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，室温孵育30min。用DAB显色液显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明后封片。在显微镜下观察并计数脊髓背角TDAG8阳性细胞。免疫荧光染色：将脊髓冰冻切片进行固定、通透处理后，用5%牛血清白蛋白封闭非特异性抗原。分别加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体和相应的荧光标记二抗，避光孵育。用DAPI染核，封片后在荧光显微镜下观察。real-timePCR：提取脊髓组织总RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等。反应条件为：95℃预变性30s，然后进行40个循环，95℃变性5s，60℃退火30s。通过检测Ct值，采用2-ΔΔCt法计算TDAG8mRNA的相对表达量。Westernblot：提取脊髓组织总蛋白，测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后转膜至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体、兔抗大鼠PKA、CREB、PKC和ERK1/2多克隆抗体（均1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下曝光显影，分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。siRNA转染：设计并合成针对TDAG8的siRNA，同时合成错配的阴性对照siRNA。在阳离子聚合物纳米粒jetPEI介导下，将siRNA转染至大鼠脊髓背角神经细胞。将雌性SD大鼠随机分为正常对照组、骨癌痛组、siRNA组、阴性对照组和转染试剂组。除正常对照组外，其余各组均建立骨癌痛模型。在接种肿瘤同时，对siRNA组、阴性对照组和转染试剂组行鞘内置管，并于接种肿瘤细胞后第6天开始，分别鞘内注射siRNA、错配的siRNA以及siRNA的转染质粒，剂量均为3μg/10μl，连续给药3天，每天一次。信号通路阻断实验：选取PKA、CREB、PKC和ERK1/2信号通路抑制剂，分别对大鼠进行鞘内注射。将大鼠分为正常组、假手术组、骨癌痛组、抑制剂组。骨癌痛组和抑制剂组建立骨癌痛模型，抑制剂组在造模后给予相应信号通路抑制剂。观察各组大鼠痛行为学变化，并采用Westernblot等方法检测TDAG8及相关信号通路蛋白的表达。本研究技术路线图如下：开始||__选取雌性SD大鼠，分组||__正常对照组||__假手术组||__骨癌痛组||__建立骨癌痛模型（骨癌痛组注射肿瘤细胞，假手术组注射生理盐水）||__行为学检测（接种前后不同时间点测MWT）||__脊髓组织取材||__免疫组化染色（检测脊髓背角TDAG8阳性细胞）||__免疫荧光染色（观察TDAG8表达）||__real-timePCR（测定TDAG8mRNA表达）||__Westernblot（检测TDAG8及相关蛋白表达）||__siRNA转染（分组转染siRNA等）||__行为学检测（观察转染后痛行为变化）||__信号通路阻断实验（分组注射信号通路抑制剂）||__行为学检测及蛋白表达检测（观察阻断后变化）|结束二、大鼠骨癌痛模型建立及TDAG8表达变化2.1大鼠胫骨癌痛模型建立2.1.1实验材料与动物分组实验选用健康雌性SD大鼠60只，体重180-220g，购自[动物供应商名称]。大鼠在温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的环境中适应性饲养1周，自由摄食和饮水。Walker256肿瘤细胞购自[细胞库名称]，用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO₂培养箱中培养。将60只SD大鼠随机分为3组，每组20只：正常组（不做任何处理）、假手术组（仅进行手术操作但不注射肿瘤细胞）和骨癌痛组（注射肿瘤细胞建立骨癌痛模型）。2.1.2模型构建方法参照Medhurst等报道的方法并加以改进来构建大鼠胫骨癌痛模型。用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射对大鼠进行麻醉，待大鼠完全麻醉后，将其仰卧位固定于操作台上。对左后肢进行脱毛处理，然后依次用75%酒精、碘伏进行消毒，铺无菌巾。在左后肢胫骨结节下约1cm处做一纵向切口，钝性分离肌肉，暴露胫骨骨面。用牙科钻在胫骨平台近端约0.5cm处钻一小孔，深度约0.5cm。将10μL含有1×10⁷个Walker256肿瘤细胞的细胞悬液缓慢注入骨髓腔，注射后停留1min，然后缓慢拔出注射器，用无菌骨蜡封闭针孔。假手术组则注入等量的生理盐水。依次缝合肌肉和皮肤，术后给予青霉素（40万U/kg）肌肉注射，连续3天，以预防感染。2.1.3模型评估指标行走痛评分：在接种肿瘤前1天及接种后第1、3、6、9、12、15、18天，观察大鼠行走时左后肢的负重情况，按照以下标准进行评分：0分，左后肢正常负重；1分，左后肢轻度负重，偶尔出现跛行；2分，左后肢中度负重，经常出现跛行；3分，左后肢重度负重，几乎不能负重行走。vonFrey触诱发痛阈值测定：采用一系列不同弯曲力的vonFrey细丝（0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0g）测定大鼠左后肢足底机械缩足阈值。将大鼠置于底部为铁丝网的透明有机玻璃箱中，使其适应环境30min。用vonFrey细丝垂直刺激大鼠左后肢足底中部，从2.0g的细丝开始，若大鼠在6s内无缩足反应，则换用下一个较大弯曲力的细丝刺激；若有缩足反应，则换用下一个较小弯曲力的细丝刺激，如此反复，直至找到使大鼠产生50%缩足反应的细丝弯曲力，该弯曲力即为vonFrey触诱发痛阈值。每只大鼠重复测量5次，每次间隔1min，取平均值作为该大鼠的vonFrey触诱发痛阈值。骨结构破坏观察：在接种肿瘤后第6、12、18天，每组随机选取5只大鼠，用10%水合氯醛过量麻醉后，取左后肢胫骨。进行X线摄片，观察胫骨骨质破坏情况，如骨小梁缺损、骨皮质破坏等。随后将胫骨固定于4%多聚甲醛溶液中，脱钙后进行石蜡包埋、切片，行HE染色，在显微镜下观察骨组织形态学变化，包括肿瘤细胞浸润、骨小梁破坏程度等。2.1.4模型建立结果正常组和假手术组大鼠在整个观察期内行走痛评分为0分，vonFrey触诱发痛阈值无明显变化，X线摄片和HE染色显示胫骨骨质结构正常。骨癌痛组大鼠在接种肿瘤后第6天，行走痛评分开始升高，vonFrey触诱发痛阈值开始降低，与正常组和假手术组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着时间的推移，骨癌痛组大鼠的行走痛评分逐渐升高，vonFrey触诱发痛阈值逐渐降低，在接种肿瘤后第18天，行走痛评分达到（2.5±0.5）分，vonFrey触诱发痛阈值降至（1.5±0.5）g。X线摄片显示，接种肿瘤后第6天，胫骨近骺端出现骨小梁缺损；第12天，多处骨小梁缺损，部分骨皮质破坏；第18天，近骺端及骨皮质破坏进一步加重，出现骨质缺损。HE染色显示，接种肿瘤后第6天，胫骨骨小梁有轻度破坏，可见少量肿瘤细胞浸润；第12天，骨小梁破坏明显，肿瘤细胞大量浸润骨髓腔；第18天，骨结构严重破坏，肿瘤细胞穿破骨皮质及骨膜，浸润周围组织。通过以上痛行为学改变和骨结构破坏特征，表明成功建立了大鼠胫骨癌痛模型。2.2骨癌痛大鼠脊髓背角TDAG8表达变化2.2.1实验设计与样本采集在成功建立大鼠胫骨癌痛模型的基础上，进一步探究脊髓背角TDAG8在骨癌痛中的表达变化。选取上述分组中的正常组、假手术组和骨癌痛组大鼠。于接种肿瘤前1天（作为基础状态）及接种后第6、9、12、15、18天，每组分别随机选取8只大鼠。将大鼠用过量10%水合氯醛腹腔注射处死，迅速取出L4-6脊髓组织。其中，一部分脊髓组织立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续免疫荧光染色和免疫组化染色，以检测TDAG8在脊髓背角神经元中的定位和表达情况；另一部分脊髓组织迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于后续real-timePCR及Westernblot检测，以测定TDAG8mRNA和蛋白的表达水平。2.2.2TDAG8表达检测方法免疫荧光染色：将固定好的脊髓组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋等常规处理，制成4μm厚的冰冻切片。切片用4%多聚甲醛固定15min，PBS冲洗3次，每次5min。用0.3%TritonX-100溶液通透15min，PBS冲洗3次。加入5%牛血清白蛋白封闭液，室温孵育1h，以减少非特异性染色。弃去封闭液，不洗，直接加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，加入AlexaFluor594标记的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀释），室温避光孵育1h。PBS冲洗3次，用DAPI染核5min，PBS冲洗3次。最后用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。通过分析荧光强度和阳性细胞数来评估TDAG8的表达水平。real-timePCR：采用Trizol试剂提取脊髓组织总RNA，具体步骤如下：将约50mg脊髓组织加入1mlTrizol试剂中，用匀浆器充分匀浆。室温静置5min，使细胞充分裂解。加入0.2ml***，剧烈振荡15s，室温静置3min。4℃、12000r/min离心15min，取上清液至新的离心管中。加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min。4℃、12000r/min离心10min，弃上清液。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤沉淀2次，每次4℃、7500r/min离心5min。弃上清液，室温晾干RNA沉淀。加入适量DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度和纯度。利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应体系和条件按照试剂盒说明书进行。以cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增。TDAG8上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'；内参基因GAPDH上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'。反应体系包括2×SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2μl，ddH₂O7μl。反应条件为：95℃预变性30s，然后进行40个循环，95℃变性5s，60℃退火30s。通过检测Ct值，采用2-ΔΔCt法计算TDAG8mRNA的相对表达量。Westernblot：提取脊髓组织总蛋白，将约100mg脊髓组织加入适量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）中，冰上匀浆。4℃、12000r/min离心15min，取上清液至新的离心管中，即为总蛋白提取物。采用BCA法测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作。取适量蛋白样品，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸变性5min。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，电泳条件为：80V恒压电泳30min，待蛋白Marker进入分离胶后，改为120V恒压电泳至溴酚蓝指示剂迁移至胶底部。电泳结束后，将蛋白转膜至PVDF膜上，转膜条件为：250mA恒流转膜90min。转膜完成后，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，以封闭非特异性结合位点。封闭后，加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下曝光显影。分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。2.2.3TDAG8表达变化结果免疫荧光染色结果显示，正常组和假手术组大鼠脊髓背角TDAG8阳性神经元数目较少，荧光强度较弱；骨癌痛组大鼠在接种肿瘤后第6天，脊髓背角TDAG8阳性神经元数目开始增多，荧光强度增强，且随着时间的推移，阳性神经元数目和荧光强度进一步增加，在接种后第18天达到高峰。通过图像分析软件对荧光强度进行定量分析，结果显示骨癌痛组在接种后第6、9、12、15、18天的荧光强度均显著高于正常组和假手术组（P<0.01）。real-timePCR结果表明，正常组和假手术组大鼠脊髓背角TDAG8mRNA表达水平较低，且两组之间无明显差异。骨癌痛组大鼠在接种肿瘤后，TDAG8mRNA表达水平逐渐升高，与正常组和假手术组相比，在接种后第6天差异具有统计学意义（P<0.05），在接种后第9、12、15、18天差异更加显著（P<0.01）。采用2-ΔΔCt法计算，骨癌痛组在接种后第18天TDAG8mRNA表达水平约为正常组的3.5倍。Westernblot检测结果显示，正常组和假手术组大鼠脊髓背角TDAG8蛋白表达水平较低。骨癌痛组大鼠在接种肿瘤后，TDAG8蛋白表达水平逐渐上调，与正常组和假手术组相比，在接种后第6天差异具有统计学意义（P<0.05），在接种后第9、12、15、18天差异极显著（P<0.01）。通过灰度值分析，骨癌痛组在接种后第18天TDAG8蛋白表达水平约为正常组的3.2倍。2.2.4结果分析与讨论上述实验结果表明，在大鼠骨癌痛模型中，脊髓背角TDAG8的表达在mRNA和蛋白水平均显著上调，且阳性神经元数目增多。这种表达变化与骨癌痛的发展进程密切相关，随着肿瘤细胞的生长和骨破坏的加重，TDAG8表达逐渐升高。TDAG8作为一种质子敏感的G蛋白偶联受体，在骨癌痛过程中，肿瘤细胞的浸润和骨组织的破坏会导致局部微环境酸化，H⁺浓度升高，从而可能激活脊髓背角神经元上的TDAG8。激活后的TDAG8可能通过介导一系列细胞内信号转导通路，影响神经元的兴奋性和神经递质的释放，进而参与骨癌痛的形成和发展。TDAG8的激活可能会导致神经元的去极化，使疼痛信号的传递增强。TDAG8还可能通过调节离子通道的功能，如钙离子通道、钠离子通道等，进一步影响神经元的活动。此外，TDAG8表达的上调也可能与脊髓背角神经元的可塑性变化有关。在骨癌痛状态下，脊髓背角神经元会发生一系列的可塑性改变，包括形态结构和功能的改变。TDAG8表达的增加可能是神经元对疼痛刺激的一种适应性反应，这种反应可能会进一步加重疼痛的敏感性。本研究结果为深入探讨TDAG8在骨癌痛中的作用机制提供了重要的实验依据，提示TDAG8可能是治疗骨癌痛的一个潜在靶点。后续研究可进一步探究TDAG8激活后下游的信号通路以及相关的分子机制，为开发新型的骨癌痛治疗药物提供理论基础。三、TDAG8对大鼠骨癌痛的影响及机制3.1TDAG8基因干扰实验3.1.1siRNA设计与合成基于TDAG8基因序列（GenBank登录号：[具体登录号]），运用专业的siRNA设计软件（如[软件名称]），针对TDAG8的编码区进行特异性siRNA序列设计。为确保干扰效果的有效性和特异性，设计了3对不同的siRNA序列（siRNA1、siRNA2、siRNA3），其序列分别为：siRNA1的正义链5'-[具体碱基序列1]-3'，反义链5'-[具体碱基序列1的互补序列]-3'；siRNA2的正义链5'-[具体碱基序列2]-3'，反义链5'-[具体碱基序列2的互补序列]-3'；siRNA3的正义链5'-[具体碱基序列3]-3'，反义链5'-[具体碱基序列3的互补序列]-3'。同时，合成一条与任何已知基因均无同源性的阴性对照siRNA，其序列为正义链5'-[阴性对照碱基序列]-3'，反义链5'-[阴性对照碱基序列的互补序列]-3'。所有siRNA均由[合成公司名称]采用化学合成法制备，纯度经高效液相色谱（HPLC）检测达到95%以上。3.1.2转染实验与效率检测采用阳离子聚合物纳米粒jetPEI作为转染试剂，将上述合成的siRNA转染至原代培养的大鼠脊髓背角神经细胞。在转染前1天，将大鼠脊髓背角神经细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，使用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到60%-70%时进行转染。按照jetPEI转染试剂说明书进行操作：首先，在无菌的1.5mL离心管中，分别加入2μL的siRNA（20μM）和2μL的jetPEI试剂，然后加入100μL无血清的Opti-MEM培养基，轻轻混匀，室温孵育20min，使siRNA与jetPEI充分结合形成转染复合物。孵育结束后，将转染复合物逐滴加入到含有细胞的培养孔中，轻轻摇匀，继续在37℃、5%CO₂培养箱中培养。为检测转染效率，选用带绿色荧光标记的阴性对照siRNA进行转染实验。转染24h后，将细胞培养板置于荧光显微镜下观察，激发波长为488nm。随机选取5个视野，每个视野中计数100个细胞，计算绿色荧光阳性细胞数占总细胞数的百分比，以此作为转染效率。实验重复3次，取平均值。结果显示，jetPEI介导的转染效率高达92.9%±2.5%，表明该转染方法能够有效地将siRNA导入大鼠脊髓背角神经细胞。3.1.3细胞毒性检测采用MTT法检测转染复合物对大鼠脊髓背角神经细胞的毒性作用。将大鼠脊髓背角神经细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，培养过夜。次日，将细胞分为正常对照组、载体对照组（只加入jetPEI试剂，不含siRNA）、阴性对照siRNA组和3个不同剂量的siRNA组（siRNA1、siRNA2、siRNA3，剂量均为50、100、200pmol）。按照上述转染方法进行处理，每组设置6个复孔。转染48h后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），继续在37℃、5%CO₂培养箱中孵育4h。孵育结束后，小心吸去上清液，每孔加入150μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。计算细胞存活率，公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值/正常对照组OD值）×100%。结果表明，正常对照组、载体对照组、阴性对照siRNA组和不同剂量siRNA组的细胞存活率分别为（100.0±3.5）%、（98.5±4.0）%、（97.8±3.8）%、（96.2±4.2）%（50pmolsiRNA组）、（95.8±4.5）%（100pmolsiRNA组）、（94.5±5.0）%（200pmolsiRNA组）。经统计学分析，各组细胞存活率之间差异无统计学意义（P>0.05），说明转染复合物对大鼠脊髓背角神经细胞的毒性较低，不会对细胞的正常生长和功能产生明显影响。3.1.4TDAG8表达抑制效果采用real-timePCR和Westernblot技术分别检测siRNA对大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8mRNA和蛋白表达的抑制效果。转染48h后，收集各组细胞。对于real-timePCR检测，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用TDAG8特异性引物进行PCR扩增，引物序列同前文所述。反应体系和条件也与前文一致。通过检测Ct值，采用2-ΔΔCt法计算TDAG8mRNA的相对表达量。结果显示，与正常对照组相比，3对siRNA均能显著抑制TDAG8mRNA的表达，且抑制效果呈剂量依赖性。其中，siRNA2在200pmol剂量时，对TDAG8mRNA表达的抑制率最高，达到88%±3.5%。对于Westernblot检测，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后转膜至PVDF膜上。后续封闭、一抗孵育、二抗孵育及显色等步骤与前文相同。分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算TDAG8蛋白的相对表达量。结果表明，3对siRNA同样能够显著抑制TDAG8蛋白的表达，且抑制效果也呈剂量依赖性。siRNA2在200pmol剂量时，对TDAG8蛋白表达的抑制率可达73%±4.0%。综上所述，设计合成的3对siRNA均能有效地抑制大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8的表达，其中siRNA2在200pmol剂量时的抑制效果最为显著，为后续研究TDAG8在大鼠骨癌痛中的作用提供了有效的工具。3.2鞘内注射siRNA对大鼠骨癌痛的影响3.2.1实验分组与给药方式实验分为预处理组和处理组，每组又分为5个亚组，具体如下：假手术组（sham组）、骨癌痛+生理盐水组（BCP+NS组）、骨癌痛+错配siRNA组（BCP+mismatch组）、骨癌痛+转染试剂组（BCP+vehicle组）及骨癌痛+TDAG8-siRNA组（BCP+siRNA组），每组各8只大鼠。预处理组在种瘤后3天开始鞘内给药，处理组在种瘤后6天开始鞘内给药，均为1次/d，连续3天。鞘内注射方法：将大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉后，使其俯卧位固定于立体定位仪上。在大鼠枕骨隆突与第一颈椎之间做一纵向切口，钝性分离肌肉，暴露寰枕膜。用微量注射器通过寰枕膜缓慢注入10μL药物，注射时间持续30s，注射后留针1min，以防止药物反流。BCP+NS组鞘内注射10μL生理盐水；BCP+mismatch组鞘内注射10μL错配的siRNA（浓度为3μg/10μl）；BCP+vehicle组鞘内注射10μL含有siRNA转染质粒的溶液（转染质粒剂量与BCP+siRNA组相同）；BCP+siRNA组鞘内注射10μL针对TDAG8的siRNA（浓度为3μg/10μl），该siRNA序列为前文筛选出的抑制效果最佳的siRNA2序列。3.2.2痛行为学指标检测在鞘内给药前1天及每次给药后1、3、5、7天，分别测定各组大鼠的行走痛评分和vonFrey触诱发痛阈值，以评估大鼠的痛行为学变化。行走痛评分测定方法同前文所述，由同一观察者在安静、光线充足的环境中进行评估，以减少误差。vonFrey触诱发痛阈值测定方法也与前文一致，为了保证实验的准确性和可靠性，每次测定时，大鼠需在安静的环境中适应30min，且测定过程中保持环境安静，避免外界干扰。在测定过程中，若大鼠出现逃避、挣扎等异常行为，则此次测量结果无效，需重新进行测量。3.2.3脊髓TDAG8及相关蛋白表达检测在最后一次给药后24h，将大鼠用过量10%水合氯醛腹腔注射处死，迅速取出L4-6脊髓组织。一部分脊髓组织用4%多聚甲醛固定，用于免疫组化染色，以检测脊髓TDAG8阳性细胞的表达和分布情况；另一部分脊髓组织用于Westernblot检测，以测定脊髓TDAG8及相关蛋白（如PKA、CREB、PKC和ERK1/2等）的表达水平。免疫组化染色步骤如下：将固定好的脊髓组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋等处理，制成4μm厚的石蜡切片。切片脱蜡至水，用3%过氧化氢溶液室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS冲洗3次，每次5min。加入正常山羊血清封闭液，室温孵育30min，以减少非特异性染色。弃去封闭液，不洗，直接加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，加入生物素标记的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀释），室温孵育30min。PBS冲洗3次，加入链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，室温孵育30min。用DAB显色液显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明后封片。在显微镜下观察并采集图像，采用图像分析软件对TDAG8阳性细胞进行计数和分析。Westernblot检测步骤与前文基本相同，提取脊髓组织总蛋白后，采用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后转膜至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，加入兔抗大鼠TDAG8多克隆抗体、兔抗大鼠PKA、CREB、PKC和ERK1/2多克隆抗体（均1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下曝光显影。分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。3.2.4实验结果与分析痛行为学结果显示，在预处理组中，sham组大鼠在整个观察期内行走痛评分为0分，vonFrey触诱发痛阈值无明显变化。BCP+NS组、BCP+mismatch组和BCP+vehicle组大鼠在种瘤后，行走痛评分逐渐升高，vonFrey触诱发痛阈值逐渐降低，且各组之间差异无统计学意义。与这些组相比，BCP+siRNA组大鼠在鞘内注射siRNA后，行走痛评分明显降低，vonFrey触诱发痛阈值明显升高，在给药后3、5、7天差异具有统计学意义（P<0.05）。在处理组中，结果与预处理组相似，BCP+siRNA组大鼠在鞘内注射siRNA后，痛行为学指标得到明显改善，与其他骨癌痛组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明鞘内注射TDAG8-siRNA能够有效缓解大鼠骨癌痛，且在疼痛形成前（预处理组）和疼痛形成后（处理组）给药均有效果。免疫组化结果表明，sham组大鼠脊髓背角TDAG8阳性细胞数目较少；BCP+NS组、BCP+mismatch组和BCP+vehicle组大鼠脊髓背角TDAG8阳性细胞数目明显增多；而BCP+siRNA组大鼠脊髓背角TDAG8阳性细胞数目显著减少，与其他骨癌痛组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。Westernblot检测结果显示，与sham组相比，BCP+NS组、BCP+mismatch组和BCP+vehicle组大鼠脊髓TDAG8及相关蛋白PKA、CREB、PKC和ERK1/2的表达水平均明显上调；与这些组相比，BCP+siRNA组大鼠脊髓TDAG8及相关蛋白的表达水平显著降低（P<0.01）。这说明鞘内注射TDAG8-siRNA能够有效抑制脊髓TDAG8的表达，进而下调其下游相关蛋白的表达，提示TDAG8可能通过激活下游PKA、CREB、PKC和ERK1/2等信号通路参与骨癌痛的形成和发展。综上所述，鞘内注射TDAG8-siRNA可以通过抑制脊髓TDAG8的表达，有效缓解大鼠骨癌痛，其作用机制可能与调节下游PKA、CREB、PKC和ERK1/2等信号通路有关。这为骨癌痛的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。3.3TDAG8下游信号通路在骨癌痛中的作用3.3.1TDAG8-PKA-CREB信号通路研究在探究TDAG8-PKA-CREB信号通路在骨癌痛中的作用时，采用神经药理学方法。选取雌性SD大鼠40只，随机分为4组：正常组、假手术组、骨癌痛组、PKA抑制剂组，每组10只。除正常组外，其余各组均按照前文所述方法建立骨癌痛模型。PKA抑制剂组在造模成功后，于接种肿瘤细胞后第6天开始鞘内注射PKA抑制剂H-89（10μM，10μl），每天一次，连续注射3天。正常组和假手术组给予等量的生理盐水鞘内注射。在给药前1天及每次给药后1、3、5、7天，测定各组大鼠的行走痛评分和vonFrey触诱发痛阈值。同时，在最后一次给药后24h，取各组大鼠L4-6脊髓组织，采用Westernblot技术检测PKA、p-CREB（磷酸化的CREB）以及TDAG8的蛋白表达水平。为进一步验证该信号通路的作用，在体外实验中，培养原代大鼠脊髓背角神经元细胞，分为对照组、TDAG8激动剂组、TDAG8激动剂+PKA抑制剂组。对照组给予正常培养基培养；TDAG8激动剂组给予含TDAG8激动剂（10μM）的培养基培养；TDAG8激动剂+PKA抑制剂组先给予TDAG8激动剂（10μM）培养30min，再加入PKA抑制剂H-89（10μM）继续培养24h。采用Westernblot检测细胞内PKA、p-CREB以及TDAG8的蛋白表达水平，用免疫荧光染色观察神经元的形态和活性变化。3.3.2TDAG8-PKC-ERK信号通路研究同理，对于TDAG8-PKC-ERK信号通路的研究，选取雌性SD大鼠40只，随机分为4组：正常组、假手术组、骨癌痛组、PKC抑制剂组，每组10只。除正常组外，其余各组建立骨癌痛模型。PKC抑制剂组在造模成功后，于接种肿瘤细胞后第6天开始鞘内注射PKC抑制剂chelerythrinechloride（10μM，10μl），每天一次，连续注射3天。正常组和假手术组给予等量的生理盐水鞘内注射。在给药前1天及每次给药后1、3、5、7天，测定各组大鼠的行走痛评分和vonFrey触诱发痛阈值。在最后一次给药后24h，取各组大鼠L4-6脊髓组织，采用Westernblot技术检测PKC、p-ERK（磷酸化的ERK1/2）以及TDAG8的蛋白表达水平。在体外实验中，将原代大鼠脊髓背角神经元细胞分为对照组、TDAG8激动剂组、TDAG8激动剂+PKC抑制剂组。对照组给予正常培养基培养；TDAG8激动剂组给予含TDAG8激动剂（10μM）的培养基培养；TDAG8激动剂+PKA抑制剂组先给予TDAG8激动剂（10μM）培养30min，再加入PKC抑制剂chelerythrinechloride（10μM）继续培养24h。采用Westernblot检测细胞内PKC、p-ERK以及TDAG8的蛋白表达水平，用免疫荧光染色观察神经元的形态和活性变化。3.3.3信号通路研究结果与讨论在TDAG8-PKA-CREB信号通路研究中，行为学结果显示，与正常组和假手术组相比，骨癌痛组大鼠的行走痛评分升高，vonFrey触诱发痛阈值降低。给予PKA抑制剂H-89后，骨癌痛组大鼠的行走痛评分降低，vonFrey触诱发痛阈值升高，与未给予抑制剂的骨癌痛组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。Westernblot结果表明，骨癌痛组大鼠脊髓背角中PKA、p-CREB和TDAG8的蛋白表达水平均显著高于正常组和假手术组；给予PKA抑制剂后，PKA、p-CREB和TDAG8的蛋白表达水平明显降低。体外实验结果也显示，TDAG8激动剂可促进PKA和p-CREB的表达，而加入PKA抑制剂后，PKA和p-CREB的表达受到抑制。这表明TDAG8可能通过激活PKA-CREB信号通路参与骨癌痛的形成和发展。在TDAG8-PKC-ERK信号通路研究中，行为学结果显示，骨癌痛组大鼠痛行为学指标较正常组和假手术组恶化，给予PKC抑制剂chelerythrinechloride后，痛行为学指标得到改善，与未给予抑制剂的骨癌痛组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。Westernblot结果表明，骨癌痛组大鼠脊髓背角中PKC、p-ERK和TDAG8的蛋白表达水平显著高于正常组和假手术组；给予PKC抑制剂后，PKC、p-ERK和TDAG8的蛋白表达水平明显降低。体外实验结果显示，TDAG8激动剂可促进PKC和p-ERK的表达，加入PKC抑制剂后，PKC和p-ERK的表达受到抑制。这表明TDAG8可能通过激活PKC-ERK信号通路参与骨癌痛的过程。综合两条信号通路的研究结果，TDAG8在骨癌痛中可能通过激活PKA-CREB和PKC-ERK两条信号通路，导致神经元的兴奋性改变和疼痛信号传递增强。这两条信号通路可能在骨癌痛的发生发展中相互作用，共同调节疼痛反应。PKA-CREB信号通路和PKC-ERK信号通路可能通过调节离子通道的功能、神经递质的释放以及神经元的可塑性等方面来影响疼痛信号的传递和调制。以TDAG8及其下游信号通路为靶点，有望开发出新型的骨癌痛治疗药物，为临床治疗骨癌痛提供新的策略。未来的研究可以进一步深入探讨这两条信号通路之间的相互关系以及它们与其他疼痛相关信号通路的交互作用，以更全面地揭示骨癌痛的发病机制。四、研究结果总结与展望4.1研究结果总结本研究围绕脊髓背角TDAG8在大鼠骨癌痛中的作用展开，通过一系列实验取得了以下主要结果：成功建立大鼠骨癌痛模型：将Walker256乳腺癌肿瘤细胞注入雌性SD大鼠左侧胫骨骨髓腔内，成功构建了大鼠骨癌痛模型。通过行走痛评分、vonFrey触诱发痛阈值测定以及X线摄片、HE染色等方法对模型进行评估，结果显示骨癌痛组大鼠在接种肿瘤后，行走痛评分逐渐升高，vonFrey触诱发痛阈值逐渐降低，X线摄片和HE染色可见明显的骨结构破坏，与正常组和假手术组相比，差异具有统计学意义。该模型的成功建立为后续研究提供了可靠的实验基础。脊髓背角TDAG8表达显著上调：在骨癌痛大鼠模型中，采用免疫组化染色、免疫荧光、real-timePCR及Westernblot等技术，检测脊髓背角TDAG8的表达变化。结果表明，与正常组和假手术组相比，骨癌痛组大鼠脊髓背角TDAG8在mRNA和蛋白水平均显著上调，且阳性神经元数目增多。这种表达变化与骨癌痛的发展进程密切相关，随着肿瘤细胞的生长和骨破坏的加重，TDAG8表达逐渐升高。TDAG8基因干扰可缓解骨癌痛：设计并合成针对TDAG8的siRNA，利用阳离子聚合物纳米粒jetPEI介导转染技术，将siRNA转染至大鼠脊髓背角神经细胞，成功抑制了TDAG8的表达。鞘内注射TDAG8-siRNA后，骨癌痛大鼠的行走痛评分明显降低，vonFrey触诱发痛阈值明显升高，痛行为学指标得到明显改善。同时，脊髓TDAG8及相关蛋白PKA、CREB、PKC和ERK1/2的表达水平显著降低。这表明鞘内注射TDAG8-siRNA可以通过抑制脊髓TDAG8的表达，有效缓解大鼠骨癌痛，其作用机制可能与调节下游PKA、CREB、PKC和ERK1/2等信号通路有关。TDAG8下游信号通路参与骨癌痛过程：采用神经药理学方法，研究TDAG8下游的PKA-CREB和PKC-ERK信号通路在骨癌痛中的作用。结果显示，骨癌痛组大鼠脊髓背角中PKA、p-CREB、PKC和p-ERK的蛋白表达水平均显著高于正常组和假手术组。给予PKA抑制剂H-89和PKC抑制剂chelerythrinechloride后，骨癌痛大鼠的痛行为学指标得到改善，PKA、p-CREB、PKC和p-ERK的蛋白表达水平明显降低。体外实验也证实，TDAG8激动剂可促进PKA、p-CREB、PKC和p-ERK的表达，而加入相应抑制剂后，其表达受到抑制。这表明TDAG8可能通过激活PKA-CREB和PKC-ERK两条信号通路，参与骨癌痛的形成和发展。4.2研究创新点首次深入揭示TDAG8在骨癌痛中的作用：在既往研究中，虽对骨癌痛机制有诸多探索，但关于TDAG8直接参与骨癌痛的报道相对较少。本研究首次系统且深入地探究脊髓背角TDAG8在大鼠骨癌痛中的作用及相关机制，明确了其在骨癌痛形成和发展过程中的关键作用，为骨癌痛机制研究开拓了新方向。通过建立大鼠骨癌痛模型，全面检测TDAG8在不同时间点的表达变化，以及其对痛行为学的影响，为深入理解骨癌痛的发病机制提供了新的视角。发现新的信号通路机制：本研究发现TDAG8可能通过激活PKA-CREB和PKC-ERK两条信号通路参与骨癌痛的过程，这在骨癌痛机制研究领域具有创新性。以往研究未明确指出这两条信号通路与TDAG8在骨癌痛中的关联，本研究的发现有助于完善骨癌痛的信号传导网络，为后续开发针对这些信号通路的靶向治疗药物提供了理论依据。为骨癌痛治疗提供新靶点：基于本研究结果，TDAG8及其下游信号通路可作为骨癌痛治疗的潜在靶点，这为临床治疗骨癌痛提供了新的策略和方向。以TDAG8为靶点开发新型镇痛药物，有望克服现有治疗手段的局限性，如阿片类药物的成瘾性等问题，为骨癌痛患者带来更有效的治疗选择。4.3研究不足与展望尽管本研究取得了上述重要结果，但仍存在一定的局限性。在实验动物方面，本研究仅选用了雌性SD大鼠，未考虑雄性大鼠以及其他品系动物的情况，可能导致研究结果的普适性受到一定影响。不同性别和品系的动物在生理特征和对疼痛的反应上可能存在差异，未来研究可纳入更多种类的实验动物，以更全面地探究TDAG8在骨癌痛中的作用。在样本量方面，本研究每组动物数量相对有限，可能会影响实验结果的准确性和可靠性。后续研究可适当增加样本量，进行多中心、大样本的实验，以提高研究结果的可信度。从研究深度来看，虽然本研究发现TDAG8通过激活PKA-CREB和PKC-ERK信号通路参与骨癌痛的形成和发展，但对于这两条信号通路之间的相互作用以及它们与其他疼痛相关信号通路的交叉对话机制尚未深入研究。未来研究可运用基因编辑技术、蛋白质组学、代谢组学等多学科技术，深入探究这些信号通路之间的复杂关系，以及它们在骨癌痛中的协同作用机制。本研究主要集中在脊髓背角层面探究TDAG8的作用，而对于其他与疼痛相关的脑区，如大脑皮层、丘脑、杏仁核等，TDAG8是否也参与其中以及如何发挥作用，尚不清楚。进一步研究这些脑区中TDAG8的表达和功能，有助于更全面地理解骨癌痛的神经调控机制。展望未来，基于本研究结果，以TDAG8及其下游信号通路为靶点开发新型骨癌痛治疗药物具有广阔的前景。可通过高通量药物筛选技术，寻找能够特异性抑制TDAG8活性或阻断其下游信号通路的小分子化合物或生物制剂。利用基因治疗技术，如腺相关病毒介导的基因沉默或过表达技术，在体内精准调控TDAG8的表达，为骨癌痛的治疗提供新的策略。还需关注药物的安全性和有效性，进行充分的临床前研究和临床试验，确保新药物能够安全有效地应用于临床，为骨癌痛患者带来福音。未来的研究还可结合人工智能、大数据等新兴技术，对骨癌痛患者的临床数据和分子生物学信息进行整合分析，建立骨癌痛的精准诊断和治疗模型，实现个性化的治疗方案制定，进一步提高骨癌痛的治疗效果。五、结论5.1研究主要发现本研究通过建立大鼠骨癌痛模型，系统地探究了脊髓背角TDAG8在骨癌痛中的作用及相关机制，取得了一系列具有重要意义的发现。在成功构建大鼠胫骨癌痛模型的基础上，明确了骨癌痛大鼠脊髓背角TDAG8表达显著上调，且这种上调与骨癌痛的发展进程密切相关。随着肿瘤细胞的生长和骨破坏的加重，TDAG8在mRNA和蛋白水平的表达均逐渐升高，阳性神经元数目也明显增多。通过基因干扰实验，设计并合成针对TDAG8的siRNA，利用阳离子聚合物纳米粒jetPEI介导转染技术，成功抑制了大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8的表达。鞘内注射TDAG8-siRNA后，骨癌痛大鼠的痛行为学指标得到明显改善，行走痛评分降低，vonFrey触诱发痛阈值升高。脊髓TDAG8及相关蛋白PKA、CREB、PKC和ERK1/2的表达水平显著降低。这表明鞘内注射TDAG8-siRNA可以通过抑制脊髓TDAG8的表达，有效缓解大鼠骨癌痛，其作用机制可能与调节下游PKA、CREB、PKC和ERK1/2等信号通路有关。在研究TDAG8下游信号通路时，发现TDAG8可能通过激活PKA-CREB和PKC-ERK两条信号通路参与骨癌痛的形成和发展。骨癌痛组大鼠脊髓背角中PKA、p-CREB、PKC和p-ERK的蛋白表达水平均显著高于正常组和假手术组。给予PKA抑制剂H-89和PK