桔柚皮中黄酮和果胶提取工艺条件研究

桔柚皮中黄酮和果胶提取工艺条件研究1引言1.1桔柚简介桔柚生产高、耐寒、易栽培、易管理，具抗旱、耐瘠和抗病虫害等特性,适合在山坡的地方种植[1]。桔柚皮中含大量的果胶（SDF）以及具有抗氧化活性的黄酮类生物活性物质,是制备果胶和优质膳食纤维不可缺少的原材料[2]。1.2黄酮类化合物黄酮主要存在植物的根、叶、皮等组织中，具有抗凝血、抗肿瘤、降血脂、保肝护肝、抑菌消炎[3~4]等多种功能，有较高的保健作用和药用价值。再着，随着食品工业的发展逐渐转变，天然活性成分的膳食补充剂已成为现代人追求的目标，其中纯天然、高活性、快速见效的黄酮类化合物已引起人们的关注[5]。1.3果胶果胶是一种杂多糖，1824年，首次被提取出来，从胡萝卜中，是一位法国的化学家bracennot[6]。果胶的本质是一种天然的、线性的高分子多聚聚合物[7]。果胶一般有中药的功效，可用作解毒剂、泻药、止血剂和治疗便秘等[8]。之外，还可以用作化妆品、纺织、冶金和化学工业的辅料[9]。果胶也是食品添加剂，在未来的一段时间里，果胶的需求量将不断增加[10]。最近几年，对果胶研究的不断深入，果胶的大量应用得到开发，其开发潜力巨大，市场前景广阔[11]。1.4本课题的立题背景本课题是在已有的研究试验方向和试验设备基础上进行，主要是探讨从桔柚皮中提取黄酮类化合物和果胶的最优工艺条件，并对桔柚皮果胶褐变指数的初步研究，为桔柚皮黄酮类化合物和果胶生产工艺的综合开发提供了科学依据和方法。1.5本课题研究的主要内容

本课题采用浸提回流法提取桔柚皮黄酮，且通过酸提取法提取桔柚皮果胶。首先提取黄酮，标准品为槲皮素，用乙醇作提取液，加热回流。通过实验研究了固液比、温度和时间3个单因素对桔柚皮中黄酮类化合物提取的最佳条件，结合正交试验和验证试验确定最终的工艺条件。然后提取果胶，以半乳糖醛酸为标准品，用分光光度法，采用酸提取法，通过实验初步探寻pH、固液比、温度及时间4种单因素提取桔柚皮中果胶的最佳条件，以果胶提取率和褐变指数为衡量指标，以黄酮同样的方式进行确定最终的条件。1.6本课题研究意义虽然黄酮类化合物的药理作用已经得到国内外的广泛认可，在医药和功能性食品方面有着广阔的应用前景，但目前从桔柚皮中提取的黄酮类化合物仍然很少，有必要开发和分离新的黄酮类化合物。桔柚皮一般都选择抛弃，充分利用这些废弃物不仅可以提高桔柚加工的附加值，获得经济效益，同时还减少废弃物对环境的影响，又节约又环保，是社会发展的必然趋势。2实验部分2.1实验试剂与器材2.1.1实验材料桔柚，经处理得桔柚皮。2.1.2实验试剂表2-1实验试剂列表药品纯度生产厂家槲皮素BC天津大茂试剂厂无水乙醇AR宁波市化学有限公司无水乙醚AR宁波市化学有限公司半乳糖醛酸AR天津大茂试剂厂咔唑CP天津大茂试剂厂浓硫酸AR宁波市化学有限公司盐酸AR宁波市化学有限公司2.1.3实验仪器表2-2实验仪器列表仪器名称型号/规格生产厂家电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A上海精宏实验设备有限公司电子分析天平BSA224S奥豪斯仪器有限公司制造粉碎机XA-1江苏江堰市分析仪器厂电热恒温箱水浴锅DK-500上海精宏实验设备有限公司水循环真空泵抽滤机上海亚荣生化仪器厂pH计PB-10赛多利斯科学仪器有限公司紫外可见分光光度计UV-2550岛津仪器有限公司2.2实验方法2.2.1桔柚皮的处理将购买的桔柚清洗干净，取其果皮，在电热恒温鼓风干燥箱中50℃烘干，剪成小块状，用粉碎机粉碎成桔柚果皮粉，装置锥形瓶中密封保存备用。2.2.2黄酮的提取将桔柚皮洗净、干燥、粉碎后，准确称取15g桔柚粉，无水乙醚250ml浸泡4d，过滤后室温干燥。取一定量的桔柚粉，按一定的固液比加入70%的乙醇，放入圆底烧瓶中，在一定温度下，回流加热一段时间，过滤后的滤渣，保存，滤液分析[12]。2.2.3黄酮的测定（1）含量的测定用槲皮素作标准品，采用直接显色法：准确吸取黄酮提取液0.2ml，移至10ml的比色管中，加入70%的乙醇，定容至刻度，摇匀，静置5min，测定吸光度[13]。在256nm处测吸光度值，将测得的吸光度值代入标准曲线，得到槲皮素浓度，黄酮提取率根据公式（2-1）进行计算。（2-1）式中：C--槲皮素浓度，mg/mla--测定时提取液的稀释倍数V--浸提液的总体积，mlm--样品重量，1g（2）标准曲线的绘制①配制槲皮素标准溶液用电子分析天平准确称取槲皮素0.1g，配制70%的乙醇，加入溶解，转至100ml的容量瓶，70%的乙醇定容。C=1mg/ml。②波长的选择取上述标准溶液0.2ml，到10ml的试管，70%的乙醇稀释，混匀，静置5min。空白试剂为参比，从200-700nm区间扫描溶液，在256nm处有最大吸收峰。故波长为256nm。③槲皮素标准曲线的绘制图2-1槲皮素标准曲线分别准确吸取标准溶液，0、0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01ml，于10ml的比色管，滴加70%乙醇，定容，摇匀，静置5min。空白试剂为参比，在256nm处测吸光度值。如图2-1，回归方程Y=59.63x+0.0236，R2=0.9923，线性良好。2.2.4果胶的提取称取一定量上述提取完黄酮的干燥桔柚粉，于50ml的圆柱形玻璃瓶中，按照一定的固液比加入一定pH值的蒸馏水，在一定的温度下密封浸提一段时间，然后抽滤，滤渣干燥保留，滤液分析[14]。2.2.5果胶的测定（1）果胶含量的测定标准样品半乳糖醛酸，果胶溶液量取2.0ml到试管，用冷水降温分批次加浓硫酸12.0ml，90℃恒温水浴中，水解10min，取出，冷却，加入0.15%咔唑溶液1ml，摇匀后，测定在530nm处的吸光度值，用标准曲线代替半乳糖醛酸浓度[15]。根据公式（2-2）计算果胶的提取率。（2-2）式中：C--半乳糖醛酸浓度，mg/mlV--浸提液的总体积，mlK--测定时果胶液的稀释倍数M--样品重量，0.5g（2）褐变指数的测定配制成0.01g/ml的果胶液，在420nm处测定吸光度值[14]。（3）标准曲线的绘制①半乳糖醛酸标准溶液准确称取半乳糖醛酸0.1g，于100ml的容量瓶，先用部分蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容。C=1mg/ml。②0.15%的咔唑溶液准确称取咔唑试剂0.15g，于100ml容量瓶中，加入少量无水乙醇溶解，用无水乙醇定容至刻度。③标准曲线的绘制图2-2半乳糖醛酸标准曲线准确吸取标准溶液，0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，于100ml的容量瓶，蒸馏水定容，得稀释液。取稀释液2.0ml于10ml试管中，缓慢加入12ml浓硫酸，摇匀，加热10min在90℃的恒温水浴中，冷却，加入0.15%的咔唑溶液1ml，摇匀，室温静置120min。空白试剂为参考，在530nm测吸光度值。如图2-2所示，回归方程Y=2.5314x-0.0019，R2=0.9978，线性良好。2.3黄酮试验2.3.1单因素试验（1）不同固液比进行提取准确称取桔柚皮粉5份，每份1g，于圆底烧瓶中，分别按固液比（g/ml）1:10、1:20、1:30、1:40、1:50加入70%的乙醇，置于70℃恒温水浴中回流提取120min，趁热过滤，将滤渣干燥保存，滤液测定吸光度。（2）不同温度进行提取准确称取桔柚皮粉5份，每份1g，于圆底烧瓶中，按固液比（g/ml）1:20加入70%的乙醇，分别置于50、60、70、80、90℃恒温水浴中回流提取120min，趁热过滤，将滤渣干燥保存，滤液测定吸光度。（3）不同时间进行提取准确称取桔柚皮粉5份，每份1g，于圆底烧瓶中，按固液比（g/ml）1:20加入70%的乙醇，置于70℃恒温水浴中，分别回流提取60、90、120、150、180min，趁热过滤，将滤渣干燥保存，滤液测定吸光度。2.3.2正交试验以固液比、温度和时间作为正交试验的三个因素，由单因素实验确定三个水平，以黄酮提取率率为指标，用L9（33）正交表，设计表见表2-3。表2-3黄酮正交试验因素水平表因素水平固液比（g/ml）温度/℃时间/min11:156510021:207012031:25751402.3.3验证试验按照正交实验的最佳组合进行验证实验，提取后的溶液按2.2.3方法进行测定，以检验所得结论的准确性。2.4果胶试验2.4.1单因素试验（1）不同pH值进行浸提准确称取6份提取完黄酮的干燥桔柚粉，每份0.5g，置于50ml圆柱形玻璃瓶中，用盐酸调节pH值，按1:60的固液比（g/ml），分别加入pH值0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0蒸馏水，在70℃恒温水浴中，密封浸提120min，过滤，滤液分析。（2）不同固液比进行浸提准确称取6份提取完黄酮的干燥桔柚粉，每份0.5g，于50ml圆柱形玻璃瓶中，分别按1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80的固液比（g/ml）加入pH值为1.0的蒸馏水，在70℃恒温水浴中，密封浸提120min，过滤，滤液分析。（3）不同温度进行浸提准确称取6份提取完黄酮的干燥桔柚粉，每份0.5g，于50ml圆柱形玻璃瓶中，按固液比（g/ml）1:70，加入pH值为1.0的蒸馏水，分别在40、50、60、70、80、90℃恒温水浴中密封浸提120min，过滤，滤液分析。（4）不同时间进行浸提准确称取6份提取完黄酮的干燥桔柚粉，每份0.5g，于50ml圆柱形玻璃瓶中，按1:70固液比（g/ml），加入pH值为1.0的蒸馏水，80℃恒温水浴，分别密封浸提，30、60、90、120、150、180min，过滤，滤液分析。2.4.2正交试验pH、固液比、温度和时间4个因素，由单因素实验确定3个水平，以果胶提取率和褐变指数作为衡量指标，用L9（34）正交表，设计表见表2-4。表2-4正交试验因素水平表因素水平pH固液比（g/ml）温度/℃时间/min10.71:657510021.01:708012031.31:75851402.4.3验证试验按照正交实验的最佳组合进行验证实验，提取后的溶液按2.2.5方法进行测定，以检验所得结论的准确性。3结果与分析3.1黄酮单因素试验结果3.1.1固液比对黄酮的影响图3-1固液比的影响由图3-1可得，在固液比1:10~1:20（g/ml）是增大的，可能是溶剂量少，黄酮不能完全溶解析出，造成提取率较低；在1:20~1:50（g/ml）的固液比范围内是逐渐减少的，有可能是溶剂量增大后大部分已经溶解析出的黄酮又溶解在溶液里，造成黄酮提取率下降[16]。所以提取率会有上升再下降的趋势。如图可见，1:20（g/ml）的固液比最佳。3.1.2温度对黄酮的影响图3-2温度的影响由图3-2可知，在50~70℃范围内是逐渐增大的，可能是温度升高增大了黄酮的溶解析出速率，提取率会有所上升；在70~90℃范围内是逐渐减少的，可能是因为当温度继续升高破坏了某些黄铜类化合物，提取率就有所下降[17~18]。所以初步确定桔柚皮黄酮的提取温度为70℃。3.1.3时间对黄酮的影响图3-3时间的影响由图3-3可知，在60~90min的提取率偏低，可能时间较短黄酮类化合物没有溶解完全；在120~180min范围内是减少的，可能是时间过长导致早溶解析出的黄酮类化合物相互发生作用，从而使它们的某些结构导致破坏，所以导致提取率降低[19]。所以初步选择桔柚皮黄酮的提取时间为120min。3.2黄酮正交试验结果由3.1中单因素试验可以得出每个单因素的最佳点，但是不知道单因素之间是否相互影响，所以不能单一的从单因素中确定桔柚皮黄酮的最佳提取工艺条件，要结合正交试验来确定。准确称取9份桔柚皮粉末，每份1.0g。由表3-1极差分析可知，桔柚皮黄酮提取中3个因素对黄酮提取率影响的主次顺序为：A（固液比）>C（时间）>B（温度）。综合分析，桔柚皮黄酮最佳提取工艺条件为：A2B2C2，即固液比为1:20（g/ml）、温度70℃、时间120min。表3-1黄酮正交试验结果与分析项目A(g/ml)B/℃C/min提取率/%实验11110.808实验21221.12实验31330.938实验42121.41实验52231.39实验62311.34实验73131.17实验83211.28实验93321.24均值110.9551.291.143--均值121.3801.2631.257--均值131.2301.1730.875--极差0.4250.1340.382--主次序ACB优水平A2B2C2--3.3黄酮验证试验结果依据3.2中得出的桔柚皮黄酮的工艺要求，固液比为1:20（g/ml）、温度70℃、时间120min。3次平行试验，保障其可靠性，结果如表3-2。表3-2最佳工艺条件验证结果项目提取率/%平均提取率/%实验11.431.43实验21.42实验31.43由表3-2可知，黄酮提取率的3次测定结果相近，误差不大，说明该提取工艺稳定，因此A2B2C2是提取黄酮的最佳条件。3.4果胶单因素试验结果3.4.1pH对果胶的影响图3-4pH的影响由图3-4可得，当pH值等于1.0时，提取率最高，而褐变指数最低。当pH值低于1.0时，果胶可能会引起降解，部分纤维素和半纤维素水解，果胶率降低，pH值过高时，果胶不能完全分离，水解不完全，提取率降低[20]。褐变指数越低说明果胶色泽越好，综合提取率和褐变指数考虑，pH值选择1.0最合适。所以初步确定pH=1.0。3.4.2固液比对果胶的影响图3-5固液比的影响由图3-5可知，当固液比为1:70（g/ml）时，果胶提取率最高，褐变指数最低。固液比例选择比较大是因为原材料固体粒度小，容易造成分散困难，所以通过提高整体固液比来改善。果胶提取率在1:30~1:70（g/ml）的固液比范围内是逐渐增大的，可能是因为溶液量增加有助于果胶溶解析出，再着有利于果胶液的过滤，从而提高果胶的提取率，在1:70~1:80（g/ml）的固液比范围内是减少的，可能是因为继续增加固液比，果胶虽然容易溶解析出，但是果胶液浓度较低，导致果胶提取率减少[21]。如图3-5所示，果胶提取率升高褐变指数降低，故初定固液比为1:70（g/ml）。3.4.3温度对果胶的影响图3-6温度的影响由图3-6可知，温度80℃时，果胶提取率最高，在70~80℃褐变指数都比较低。在40~80℃范围内果胶的提取率增加，可能是因为温度过低时，果胶水解不够充分，使果胶提取率率偏低，但果胶耐热性较差，温度过高容易引起结构破坏，导致果胶率下降[22~23]。果胶提取率升高褐变指数降低，所以初步认为最适提取温度为80℃。3.4.4时间对果胶的影响由图3-7可知，时间为120min时，提取率最高，相对褐变指数最低。在30~120min范围内，开始提取率低可能是提取时间短，果胶不能充分水解；在120~180min范围内，提取率呈下降趋势，可能是时间过长，果胶水解成果胶酸，导致提取率降低[24]。所以初步时间定为120min。图3-7时间的影响3.5果胶正交试验结果由3.4中单因素试验结果分析可以得出每个单因素的最佳点，但是不知道单因素之间是否相互影响，所以不能单一的从单因素中确定桔柚皮果胶的最佳提取工艺条件，要结合正交试验来确定。准确称取提取完黄酮的干燥桔柚粉9份，每份0.5g。由表3-3可得，以提取率为衡量指标，经过极差分析，4个因素影响的程度为：A>C>B>D，pH值的影响最大，其次是温度和固液比，最小的是时间，最佳工艺条件为：A2B2C2D2。以果胶褐变指数为指标，经极差分析，4个因素影响的主次顺序与提取率的顺序相同，最佳提取工艺条件为：A3B2C2D2。固液比、温度和时间相同，pH值出现差异，从单因素试验可知，pH值大于1.0，果胶提取率下降褐变指数升高，且对褐变指数影响较小，所以最佳提取pH值选择1.0。因此提取果胶的最优方案为A2B2C2D2。表3-3果胶正交试验结果与分析项目AB(g/ml)C/℃D/min提取率/%褐变指数实验111119.991.31实验2122229.250.938实验3133316.231.65实验4212332.50.536实验5223130.140.561实验6231236.510.448实验7313222.970.662实验8321331.750.385实验9332133.620.335均值1118.49021.82026.08324.583均值1233.05030.38031.79029.577均值1329.44728.78723.11326.827极差14.5608.5608.6774.994主次序ACBD优水平A2B2C2D2均值211.2990.8360.7140.735均值220.5150.6280.6030.683均值230.4610.8110.9580.857极差0.8380.2080.3550.174主次序ACBD优水平A3B2C2D23.6果胶验证试验结果依据3.5中得出的桔柚皮最佳工艺要求，pH值1.0、1:70（g/ml）固液比、温度80℃、时间120min。3次平行实验，以考察工艺条件的可靠性，结果如表3-4所示。表3-4最佳工艺条件验证结果项目提取率/%平均提取率/%褐变指数平均褐变指数实验140.4040.410.2750.275实验240.380.274实验340.450.277由表3-4可知，果胶提取率和褐变指数的3次测定结果相近，误差不大，说明该提取工艺较稳定，适合提取桔柚皮果胶，因此A2B2C2D2是提取果胶的最佳工艺条件。4结论与展望4.1结论黄酮实验以桔柚皮为原料，槲皮素作为标准品，紫外分光法测黄酮的含量。结合单因素和正交试验，并进行验证，选出最佳条件，在最佳工艺条件下的平均提取率为1.43%。此工艺以废弃桔柚皮为原料提取黄酮，简单易行，成本低廉。果胶部分的试验是以提取完黄酮的桔柚粉为原材料，标准样品选择半乳糖醛酸，咔唑比色法测含量，紫外分光法测褐变指数。结合单因素和正交试验，并进行验证，选出最佳条件，在最佳工艺条件下的平均提取率40.41%，平均褐变指数0.275。此工艺以提取完黄酮的桔柚粉为原料提取果胶，节约资源，成本低廉。4.2展望（1）研究了固液比、温度、时间三种因素对桔柚皮黄酮提取率的影响。但乙醇浓度以及原料颗粒度对黄酮的影响尚未研究，是今后进行进一步桔柚皮黄酮研究的方向。（2)本论文对于桔柚皮果胶的研究主要是从pH值、固液比、温度及时间四个方面，而对于经一系列处理过的桔柚粉及颗粒度对果胶的影响尚未考虑，且本实验提取果胶的溶剂量消耗较大，今后可以进一步研究改善。谢辞自选题以来，李卫林老师给予我很多宝贵的意见。衷心感谢李老师在我学习、研究等方面的悉心指导和关怀，使我独立发现问题、分析问题、解决问题的能力得到进一步的提高。本试验的完成是在生态与资源工程实验室完成的，在实验完成的过程中，得到了实验室老师的帮助和指导。在实验设备、仪器、试剂等方面的认知和操作，李老师耐心的指导一遍又一遍，同时在实验过程中帮助过我的同学们，在此一并表示感谢。最后，对武夷学院的所有老师献上我最真诚的祝福，感谢你们在大学四年来对我的关怀和指导。参考文献黄静,钟进良,杜小珍等.桔柚优质高产关键技术研究[J].中国园艺文摘,2018,(2):201-202.[2]高慧颖,赖呈纯,王琦.不同制备方法对桔柚皮膳食纤维品质的影响[J].福建农业科技,2019,(3):54-57.[3]CHENXM,TAITAR,KITTSDD.Flavonoidcompositionoforangepeelanditsassociationwithantioxidantandanti-inflammatoryactivities[J].FoodChemistry,2017,218:15-21.段宙位,何艾,窦志浩,等.菠萝蜜果皮黄铜提取工艺优化及比较[J].食品工业科技,2017,(10):242-246.[5]王长远,吴洪奎,于长青,等.黄酮类化合物研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报,2007,(2):75-78.[6]BraconnotH.Recherchessurunnouvelacideuniversellementrepandudanstouslesvegetaux[J].Ann.ChimpHys,1824,28:173.[7]纪颖,曾泽珍,黄珍燕.建阳桔柚皮中果胶提取工艺优化研究[J].龙岩学院学报,2017,35(5):89.[8]韦鑫,班淼,黄锁义,等.从橙子皮中提取果胶的工艺研究[J].精细化工中间体,2005,35(3):55-5