实时荧光定量PCR仪校准规范

实时荧光定量PCR仪校准规范1范围本规范适用于实时荧光定量聚合酶链式反应分析仪（以下简称qPCR仪）的校准。其他基于聚合酶链式反应原理，通过实时荧光信号采集实现靶核酸片段定量或定性分析的装置，可参照本规范执行。2引用文件下列文件对于本规范的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。JJF1071-2010国家计量校准规范编写规则JJF1001-2011通用计量术语及定义JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示JJF1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T1173-2010聚合酶链反应分析仪GB/T42753-2022实时荧光定量PCR仪性能评价通则3术语和定义JJF1001-2011、JJF1527-2015、YY/T1173-2010及GB/T42753-2022界定的术语和定义适用于本规范。此外，补充下列术语和定义：3.1温度示值误差：温度控制模块（如均热块）的设定值与所有采样孔实际温度平均值之差。3.2温度均匀度：仪器恒温阶段中，各孔位之间的温度一致性。3.3温度波动度：仪器恒温阶段中，孔位的温度变化幅度。3.4荧光强度精密度：对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度检测，其检测值的一致性。3.5阈值循环数精密度：均热块不同测量孔在同一荧光条件下，阈值循环数重复测量的一致性。3.6熔解温度漂移：根据熔解曲线计算的熔解温度值与光学标准器熔解温度设定值之差。4计量特性4.1温度相关特性4.1.1温度示值误差：在30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃等典型温度点，允许误差为±0.5℃。4.1.2温度均匀度：≤1.0℃。4.1.3温度波动度：≤±0.2℃。4.1.4温度最大过冲量：≤3.0℃。4.1.5平均升温速率：50℃→90℃区间，≥1.5℃/s。4.2荧光检测相关特性4.2.1荧光强度精密度：变异系数（CV）≤5%。4.2.2阈值循环数精密度：CV≤2%。4.2.3熔解温度漂移：±0.5℃。4.2.4线性灵敏系数（LSF）：0.80~1.20。4.2.5熔解温度比（RTm）：0.80~1.20。4.3定量分析特性样本示值误差：测得的DNA标准物质浓度对数值与标称浓度对数值的误差≤±0.3。5校准条件5.1环境条件5.1.1环境温度：15℃~30℃，且温度变化≤2℃/h。5.1.2相对湿度：45%~75%。5.1.3供电电源：电压220V±10%，频率50Hz±1Hz，接地电阻≤4Ω。5.1.4环境要求：无强磁场、强电磁干扰、剧烈振动及腐蚀性气体；远离热源、水源及阳光直射。5.2标准器及辅助设备5.2.1高精度温度传感器：精度±0.01℃，测量范围0℃~100℃，经计量校准合格。5.2.2热成像仪：温度分辨率≤0.1℃，测量误差±0.3℃。5.2.3标准荧光染料：包括FAM、SYBRGreen等常用染料，浓度不确定度≤2%。5.2.4DNA标准物质：浓度范围10¹~10⁶copies/μL，定值不确定度≤5%，经有证认可。5.2.5光谱仪：波长范围400nm~700nm，波长精度±1nm。5.2.6空白反应板：与仪器适配的无荧光污染PCR反应板。6校准项目和校准方法6.1温度相关项目校准6.1.1温度示值误差、均匀度及波动度校准6.1.1.1将高精度温度传感器插入空白反应板的代表性孔位（包括中央孔、边缘孔，共不少于9个孔），传感器探头与孔底紧密接触。6.1.1.2仪器分别设置30℃、60℃、95℃三个典型温度点，每个温度点升温至设定值后，进入恒温阶段（恒温时间≥10min）。6.1.1.3恒温阶段内，每10s记录一次各孔温度值，共记录30组数据。6.1.1.4计算各温度点的示值误差（设定值与各孔平均温度之差）、均匀度（各孔最高温度与最低温度之差）、波动度（单孔温度最大值与最小值之差）。6.1.2温度最大过冲量校准按6.1.1.1方法布置传感器，仪器设置95℃温度点，记录升温过程中各孔温度的最大值，计算最大值与设定值的差值，即为过冲量，取各孔最大值作为校准结果。6.1.3平均升温速率校准仪器设置从50℃升温至90℃的程序，记录各孔温度从55℃上升至85℃的时间，计算平均升温速率（速率=温度变化量/时间），取各孔平均值作为校准结果。6.2荧光检测相关项目校准6.2.1荧光强度精密度校准6.2.1.1向空白反应板各孔加入等浓度（100nM）的标准荧光染料溶液（如FAM），每孔加样量符合仪器要求。6.2.1.2仪器设置荧光检测程序，激发光和发射光波长匹配所选染料（如FAM：激发488nm，发射520nm）。6.2.1.3重复检测5次，记录各孔每次的荧光强度值。6.2.1.4计算各孔荧光强度的变异系数，取最大值作为校准结果。6.2.2阈值循环数精密度校准6.2.2.1配制梯度浓度（10¹~10⁶copies/μL）的DNA标准物质PCR反应体系，加入空白反应板，每个浓度设置3个重复孔。6.2.2.2设置标准PCR扩增程序（变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，共40个循环），同时开启实时荧光采集。6.2.2.3扩增结束后，仪器自动计算各孔Ct值，计算同浓度组Ct值的变异系数。6.2.3熔解温度漂移校准6.2.3.1向反应板加入荧光染料-标准DNA复合物溶液，设置熔解曲线程序（95℃10s，然后从60℃升温至95℃，升温速率0.5℃/s，全程采集荧光信号）。6.2.3.2仪器自动计算熔解温度（Tm值），与标准器设定的Tm值比较，计算漂移量。6.3定量分析特性校准6.3.1采用6.2.2.1中的梯度浓度DNA标准物质反应体系，完成PCR扩增并记录各孔Ct值。6.3.2以标准物质浓度对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线，计算回归方程。6.3.3选取3个验证浓度的DNA标准物质，按相同方法进行扩增，根据回归方程计算测得浓度对数值，与标称浓度对数值比较，得到样本示值误差。7校准结果表达校准完成后，应出具校准证书，证书内容应符合JJF1071-2010的要求，至少包括以下信息：7.1仪器基本信息：仪器名称、型号规格、出厂编号、生产厂家、使用单位。7.2校准依据：本规范编号及名称。7.3校准条件：环境温度、相对湿度、标准器信息。7.4校准结果：各校准项目的实测值、允许误差及合格判定。7.5测量不确定度：给出主要校准项目的测量不确定度。7.6校准日期、复校时间间隔及校准人员、核验人员签字。8复校时间间隔复校时间间隔一般为1年。若仪器出现维修（如更换温控元件、光源、滤光片等）、移动或检测结果异常时，应提前进行校准。日常使用中，建议每3~6个月对温度示值误差、荧光强度精密度进行期间核查。9校准注意事项9.1校准前，仪器应开机预热30min以上，确保运行状态稳定。9.2标准器及辅助设备应经计量校准合格，且在有效期内。9.3校准过程中，应避免触碰