原核表达技术操作步骤详述

原核表达技术操作步骤详述原核表达技术依托大肠杆菌等原核宿主的生长优势与成熟表达系统，成为重组蛋白制备、功能研究及产业化生产的核心手段。其核心流程涵盖表达载体构建、重组质粒转化、蛋白诱导表达及分离纯化四大环节，各步骤的精准操作直接决定蛋白表达效率与质量。本文系统详述原核表达技术的关键操作步骤，为科研与产业应用提供实用参考。一、材料准备（一）试剂与耗材载体与菌株：表达载体（如pET-28a、pET-32a等，含T7启动子及His等标签）；宿主菌（BL21(DE3)用于常规表达，Rosetta(DE3)适配稀有密码子基因，Origami(DE3)优化二硫键形成）；克隆菌（DH5α）用于载体构建。酶与试剂：限制性内切酶（如BamHI、HindIII，依载体多克隆位点选择）、T4DNA连接酶、高保真PCR酶、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素（卡那霉素、氨苄青霉素等，依载体抗性）、Ni-NTA琼脂糖树脂、SDS试剂（丙烯酰胺、Tris缓冲液等）。培养基：LB培养基（菌液培养）、SOC培养基（转化复苏）、含抗生素的LB平板（阳性克隆筛选）。（二）仪器设备PCR仪、恒温摇床、高速离心机、超净工作台、超声破碎仪、蛋白纯化系统（或重力柱）、凝胶成像系统、分光光度计（测OD₆₀₀）。二、操作步骤详解（一）表达载体的构建1.目的基因获取通过PCR扩增目的基因（或酶切质粒/基因组）。引物设计需在5’端引入限制性内切酶位点（如BamHI和HindIII），并添加≥2个保护碱基（保证酶切效率）。PCR体系含模板、高保真酶、dNTPs、引物及缓冲液，扩增条件依基因长度优化（如95℃预变性，95℃/55-65℃/72℃循环25-35次，72℃延伸）。2.载体与目的基因酶切选择2种不同内切酶对载体（如pET-28a）和目的基因PCR产物进行双酶切（避免载体自连）。酶切体系含载体/PCR产物、内切酶、缓冲液，37℃孵育2-4h。酶切后经琼脂糖电泳分离，胶回收试剂盒纯化线性化载体与目的基因。3.连接与转化将目的基因与载体按摩尔比3:1~5:1混合，加T4连接酶和缓冲液，16℃过夜连接（或22℃连接2-4h）。取5-10μL连接产物转化DH5α感受态：冰浴30min→42℃热激90s→冰浴2min→加SOC复苏1h→涂含抗生素的LB平板，37℃培养12-16h。4.阳性克隆鉴定挑取单菌落培养后，通过菌落PCR（载体通用引物或目的基因特异性引物）初筛；提取质粒后酶切验证（双酶切后电泳观察目的片段）；最终测序确认序列及读码框正确性。（二）重组质粒转化表达宿主菌1.感受态细胞处理表达宿主菌（如BL21(DE3)）感受态可自行制备（氯化钙法）或使用商品化产品。自行制备时，对数期菌液冰浴离心，预冷0.1MCaCl₂重悬，冰浴后离心，含甘油的CaCl₂重悬，-80℃冻存；商品化感受态直接冰浴融化。2.转化操作取5μL重组质粒（或100μL连接产物）加至100μL感受态细胞，冰浴30min→42℃热激90s→冰浴2min→加SOC复苏1h→涂含抗生素的LB平板，37℃培养12-16h。3.种子液培养与验证挑取阳性单菌落至5mL含抗生素的LB培养基，37℃振荡培养8-12h（OD₆₀₀=0.8-1.0）。取1mL菌液保存（种子液），剩余菌液离心收集菌体，SDS或Westernblot验证质粒稳定性与表达框架正确性。（三）重组蛋白的诱导表达1.扩大培养与诱导前处理取1mL种子液转接至100mL含抗生素的LB（或TB）培养基，37℃振荡培养至OD₆₀₀=0.6-0.8（约2-3h）。若追求可溶性蛋白，可降温至16-25℃预培养30min；若允许包涵体，保持37℃。2.IPTG诱导表达加入IPTG至终浓度0.1-1mM（低浓度如0.1mM可减少包涵体），于设定温度振荡培养4-16h（膜蛋白4h，可溶性蛋白16h）。诱导后期可加1%葡萄糖（抑制本底表达）或0.5mMZnSO₄（稳定金属结合蛋白）。3.表达形式分析取1mL诱导菌液，8000rpm离心2min收集菌体，PBS重悬后超声破碎（功率30%，工作3s/间隔5s，共10-20次），____rpm离心10min，取上清（可溶性）和沉淀（包涵体），经SDS电泳（考马斯亮蓝染色）观察表达位置与可溶性比例。（四）重组蛋白的分离纯化（以His标签为例）1.菌体破碎与上清制备诱导菌液4℃、8000rpm离心10min收集菌体，用BindingBuffer（含20mM咪唑，pH8.0）重悬（体积为原菌液的1/10），超声破碎后____rpm离心30min（4℃），上清经0.45μm滤膜过滤。2.镍柱平衡与上样Ni-NTA树脂装填于柱中，5倍柱体积BindingBuffer平衡，流速1mL/min。上清上柱（流速0.5mL/min），收集流穿液（留样检测结合效率）。3.洗杂与洗脱10倍柱体积WashBuffer（含50mM咪唑，pH8.0）洗杂，至流出液OD₂₈₀基线。ElutionBuffer（含250mM咪唑，pH8.0）洗脱，分管收集，SDS检测纯度。4.蛋白浓缩与透析纯度合格的蛋白用超滤管浓缩（截留分子量依蛋白大小），装入透析袋，于PBS或目标缓冲液中透析过夜（4℃），BCA法测浓度，-80℃冻存或直接使用。三、关键注意事项载体构建：酶切位点需避开目的基因内部，引物读码框需通过在线工具验证（如ExPASy）。转化效率：感受态需新鲜（-80℃保存≤6个月），转化全程冰浴，热激时间严格控制（90s）。诱导优化：通过预实验设置IPTG浓度（0.1/0.5/1mM）、温度（16/25/37℃）、时间（4/8/16h）梯度，绘制“表达量-可溶性”曲线，选择最优条件。纯化条件：BindingBufferpH稳定在8.0（His标签与镍结合最适pH），洗杂咪唑浓度可逐步优化（20→50mM），避免目的蛋白提前洗脱。四、常见问题及解决策略表达量极低：检查启动子-宿主匹配性（T7启动子需DE3溶原菌），确认抗生素浓度（过高抑制生长），更换宿主菌（如Rosetta解决密码子偏好）。蛋白不溶（包涵体）：降低诱导温度（16℃）、减少IPTG浓度（0.1mM）、延长诱导时间，或添加分子伴侣（GroEL/GroES），诱导后梯度透析复性。纯化杂带多：增加洗杂咪唑浓度（7