医学生物化学与分子生物学实验指南

医学生物化学与分子生物学实验指南医学生物化学与分子生物学实验是连接基础理论与临床应用的重要桥梁，其核心在于通过规范操作与严谨设计，揭示生物大分子的结构、功能及相互作用规律。实验过程需兼顾科学性与可重复性，以下从实验前准备、基本操作技术、常见实验项目及数据处理等方面展开详细说明。一、实验前准备实验前的充分准备是确保结果可靠的关键，需从理论认知、试剂器材及环境控制三方面入手。首先，明确实验目的与原理是基础。例如进行DNA提取实验前，需理解不同生物样本（如动物组织、血液、细菌）的裂解机制——动物细胞主要通过表面活性剂（如SDS）破坏细胞膜，释放核内DNA；细菌则需溶菌酶破坏细胞壁后联合蛋白酶K消化蛋白质。同时，需掌握关键试剂的作用：酚氯仿混合液利用蛋白质变性特性实现核酸与蛋白分离，无水乙醇通过降低溶液介电常数促使DNA沉淀。理论不足时，应查阅经典教材（如《分子克隆实验指南》）或权威文献，避免因原理模糊导致操作偏差。其次，试剂配制与器材检查需严格规范。试剂配制需使用去离子水（电阻率≥18.2MΩ·cm），称量时优先选择万分之一天平，固体试剂需完全溶解（必要时加热助溶）。例如配制1×TAE电泳缓冲液（50×母液稀释），需确认EDTA完全溶解（pH调至8.0），避免因缓冲能力不足导致电泳条带弥散。器材方面，移液器需定期校准（每3-6个月），校准方法为称量不同量程下纯水重量（20℃时1μL水≈1mg），误差超过±1%需返厂维修。离心机需检查转子是否清洁、离心管是否对称放置（重量差≤0.1g），超速离心机需提前预冷至4℃，避免因温度波动影响大分子构象。环境控制方面，分子生物学实验需分区操作：试剂准备区、样本处理区、扩增区及产物分析区需物理隔离，避免交叉污染。PCR实验尤其需注意：引物、dNTP等试剂应分装保存（-20℃），避免反复冻融；样本处理需在生物安全柜中进行（BSL-2级实验室），操作前用75%乙醇擦拭台面，紫外线照射30分钟。二、基本操作技术（一）移液操作移液是最基础但最易出错的环节，需根据量程选择合适移液器（0.1-10μL、10-100μL、100-1000μL）。操作时保持移液器垂直，吸液时缓慢按下至第一档，尖端浸入液面2-3mm（避免过深导致挂液），停留1秒后缓慢释放；放液时贴壁按下至第二档，确保液体完全排出，最后用吸水纸轻拭尖端（避免触碰吸头内壁）。需特别注意：高粘度液体（如甘油）或易挥发液体（如氯仿）需采用“反向移液法”——按下至第二档吸液，放液时仅按至第一档，减少残留误差。（二）离心操作离心的核心是根据目标分子特性选择转速与时间。例如分离细胞碎片（低速离心）通常800-1500×g，5-10分钟；沉淀质粒DNA（高速离心）需12000×g，10分钟；分离细胞器（超速离心）则需100000×g以上，1-2小时。离心管需对称放置，若样本量不足，可用等体积平衡液（如PBS）补足。离心后需缓慢打开离心机盖，避免液体震荡（如RNA提取时，剧烈震荡可能导致RNA酶污染）。（三）电泳技术电泳是分离核酸/蛋白质的核心技术，需根据目标分子大小选择凝胶类型。核酸分离常用琼脂糖凝胶（浓度0.5%-2%，分子越大浓度越低），制胶时需注意：琼脂糖完全融化后冷却至50-60℃再加EB（溴化乙锭）或GoldView（减少毒性），避免高温导致染料降解；胶板需水平放置，梳子与底板距离1-2mm（防止加样孔底部破裂）。上样时每孔加样量不超过凝胶孔体积的80%（避免溢出污染相邻孔），电泳缓冲液需淹没凝胶1-2mm，电压设置为5-10V/cm（凝胶长度），时间30-60分钟（至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶2/3处）。蛋白质分离常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），分离胶浓度根据蛋白分子量选择（10%-15%分离10-100kDa蛋白）。灌胶时需确保分离胶与浓缩胶界面平整（可用无水乙醇压平），聚合时间需严格控制（分离胶聚合约40分钟，浓缩胶约20分钟）。电泳时恒压80V（浓缩胶阶段）至120V（分离胶阶段），结束后用考马斯亮蓝R250染色（37℃摇床1小时），脱色液（10%乙酸+50%甲醇）脱色至背景清晰。三、常见实验项目详解（一）基因组DNA提取（以动物组织为例）1.样本处理：取50-100mg组织（如肝脏），PBS冲洗去除血液，剪碎后加入1mL裂解液（100mMTris-HClpH8.0，50mMEDTA，0.5%SDS，200μg/mL蛋白酶K），55℃水浴消化3小时（期间轻柔颠倒混匀），至溶液澄清。2.蛋白去除：加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），温和颠倒10次（避免剧烈震荡导致DNA断裂），12000×g离心10分钟，取上层水相（含DNA）至新管。3.核酸沉淀：加入2倍体积无水乙醇（-20℃预冷）及1/10体积3MNaAc（pH5.2），轻柔混匀可见白色絮状沉淀，12000×g离心15分钟，弃上清。4.洗涤与溶解：70%乙醇洗涤沉淀2次（去除盐离子），室温晾干5分钟（避免过度干燥导致难溶解），加入50μLTE缓冲液（10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA），55℃水浴10分钟促进溶解。5.质量检测：取2μLDNA用核酸蛋白检测仪测定A260/A280（纯DNA比值1.8-2.0），同时进行1%琼脂糖凝胶电泳（可见单一高浓度条带，无RNA污染或降解弥散）。（二）PCR扩增目的基因1.体系配制（25μL）：ddH₂O16.3μL，10×PCRBuffer2.5μL，2.5mMdNTPs2μL，上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA3μL。配制时需冰上操作，最后加酶避免提前激活。2.循环参数：预变性95℃5分钟（充分解链模板）；变性95℃30秒，退火（根据引物Tm值，通常Tm-5℃）30秒，延伸72℃（1kb/min）30秒，共35个循环；终延伸72℃10分钟（补平末端）。3.常见问题处理：若出现非特异性扩增，可降低引物浓度（至0.2μM）或提高退火温度；若无扩增条带，需检查模板浓度（过低）或酶活性（失效）；若条带模糊，可能是dNTP浓度过高（>200μM）或Mg²+浓度不当（通常1.5-2.5mM）。（三）蛋白质印迹（WesternBlot）1.样品制备：细胞或组织加入RIPA裂解液（含1mMPMSF，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒），冰上裂解30分钟，12000×g离心15分钟（4℃），取上清用BCA法测定蛋白浓度，调整至2-5μg/μL。2.SDS电泳：上样20-30μg蛋白，恒压80V至浓缩胶，120V至分离胶结束（约1.5小时）。3.转膜：采用湿转法（300mA恒流，2小时），PVDF膜需提前甲醇活化30秒，转膜缓冲液预冷至4℃（避免产热导致蛋白变性）。4.封闭与杂交：5%脱脂奶粉（TBST配制）室温封闭1小时，一抗（按说明书稀释，如1:1000）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次（5分钟/次）；二抗（HRP标记，1:5000）室温孵育1小时，洗膜3次。5.显色与分析：ECL发光液孵育2分钟，暗室曝光或化学发光成像仪采集图像，用ImageJ软件分析目标条带与内参（如β-actin）的灰度比值，进行相对定量。四、数据处理与质量控制实验数据需实时记录于专用实验记录本（不可擦除笔），内容包括：试剂批次（如Taq酶批号）、仪器编号（如离心机型号）、操作时间（精确到分钟）、温度/湿度（如PCR仪温度校准值）。原始数据（如电泳凝胶照片、qPCR扩增曲线）需以TIFF格式保存（避免JPEG压缩失真），并标注样本名称、上样量、实验日期。定量分析时，qPCR需绘制标准曲线（10倍梯度稀释的已知浓度DNA），要求R²>0.99，扩增效率90%-110%；CT值需在15-30之间（CT<15可能模板污染，CT>30可能扩增效率低）。WesternBlot灰度分析需扣除背景值，同一实验内参条带灰度差异应<10%（否则需重复实验）。质量控制的关键是设置对照：PCR需设阳性对照（已知含目的基因的DNA）、阴性对照（无模板）、空白对照（无引物）；DNA提取需设无样本对照（检测试剂污染）；WesternBlot需设全细胞裂解液阳性对照（验证抗体特异性）。若对照结果异常（如阴性对照出现条带），实验数据需废弃并排查原因（如引物二聚体、移液器交叉污染）。五、实验室安全与规范生物化学与分子生物学实验涉及多种危险试剂（如苯酚、丙烯酰胺、EB），需严格遵守实验室安全规范。个人防护方面，操作有毒试剂时需佩戴双层手套（丁腈手套+乳胶手套）、护目镜及防溅白大褂；使用离心机、电泳仪等设备前需检查电源线是否破损，超净工作台使用后需用75%乙醇擦拭并紫外线消毒30分钟。生物废弃物分类处理：感染性废弃物（如细胞培养皿）需高压灭菌（121℃，20分钟）后丢弃；化学废弃物（如