湖南省羊犬新孢子虫血清流行病学调查

湖南省羊犬新孢子虫血清流行病学调查SeroepidemiologicalInvestigationofNeosporidiuminGoatNeosporacaninuminHunanProvince目录摘要……………1关键词…………11前言………………21.1概述…………………21.2犬新孢子虫的病原学特点…………21.3犬新孢子虫的流行病学进展……31.3.1犬新孢子虫的生活史……………31.3.2犬新孢子虫的传播………………31.3.3新孢子虫病流行情况……………31.4国内外研究现状…………………41.5研究内容与目的……………………52实验材料与方法………………52.1实验对象……………52.2主要实验设备和试剂………………52.3山羊犬新孢子虫的血清学检查……52.3.1临床症状观察……………………52.3.2准备样品血清…………………62.3.3实验室鉴定……………………62.4计算和判定标准……………………63结果与分析…………………73.1结果……………………73.2分析……………………84结论………………8参考文献………………………9致谢……………………14湖南省羊犬新孢子虫血清流行病学调查摘要：伴随着我国羊养殖业的快速发展和羊作为商品进行交易的需求日益增多,我国的新孢子虫病流行区域正在慢慢地扩大,现在已经成为了威胁我国羊养殖业健康发展的繁殖障碍性疾病之一。目前,国内外尚无有效的药物和疫苗能对新孢子虫病进行有效防治。只能通过加强检验频率,因感染而流产的胎儿需要被全面彻底地清除、清除因感染而流产的胎盘和死胎等多方面的控制方法,但这也只能够在一定地程度上去减少新孢子虫的感染几率,从根本上并不能够解决问题。有研究发现在捐献血液地人中有部分的人犬新抱子虫血清学呈阳性,所以,人也有可能存在被犬新孢子虫感染的风险。由于在羊养殖业等方面犬新抱子虫病具有重大的危害,因此对羊新抱子虫病流行病学调查和预防就显得极为重要,对发展养殖业和保护人类公共健康均具有重大意义。关键词：湖南省；羊；犬新孢子虫；ELISA；流行病学调查SeroepidemiologicalInvestigationofNeosporidiuminGoatNeosporacaninuminHunanProvinceAbstract:WiththerapiddevelopmentofChina'ssheepbreedingindustryandtheincreasingdemandforsheeptobetradedascommodities,theepidemicareaofneosporidiosisinChinaisslowlyexpandingandhasnowbecomeoneofthereproductivedisordersthreateningthehealthydevelopmentofChina'ssheepbreedingindustry.Atpresent,therearenoeffectivedrugsandvaccinesathomeandabroadthatcaneffectivelypreventandtreatneosporidiosis.Onlybystrengtheningtheexaminationfrequency,thefetusabortedduetoinfectionneedstobecompletelyremoved,andtheplacentaandstillbirthabortedduetoinfectionneedtoberemoved.However,thiscanonlyreducetheinfectionrateofneosporidiumtoacertainextentandcannotfundamentallysolvetheproblem.Somestudieshavefoundthatsomeofthepeoplewhodonatedbloodareserologicallypositiveforneosporidiumcanis,sopeoplemayalsobeatriskofinfectionbyneosporidiumcanis.Becauseofitsgreatharmtosheepbreedingindustryandotheraspects,theepidemiologicalinvestigationandpreventionofsheepneoleptospirosisareextremelyimportant,whichisofgreatsignificancetothedevelopmentofbreedingindustryandtheprotectionofhumanpublichealth.Keywords:Hunanprovince;Goat;Neosporacaninum;ELISA;Epidemiologicalinvestigation1前言1.1概述犬新孢子虫是二十世纪才发现的一种可以寄生在很多种动物体内的寄生性原虫，它可以感染几乎所有的哺乳动物和鸟类。感染犬新孢子虫的怀孕动物大多会出现流产、产死胎、木乃伊胎等症状，新生胎儿感染后会导致运动神经障碍，从而造成动物的淘汰率升高，给畜牧业带来了很大的经济损失[1-4]。有研究发现在血液捐献者中有人的犬新抱子虫血清学阳性,所以,犬新孢子虫也可能存在感染人的风险。由于新抱子虫病在养殖业等方面的重大危害,而羊现在已经成为了人类重要的肉类食物，因此对羊新抱子虫病流行病学调查和控制就显得极为重要,对发展养殖业和保护人类公共健康均具有重大意义。1.2犬新孢子虫的病原学特点犬新孢子虫发育过程中具有五种常见地形态，第一是速殖子，第二是组织包囊，第三是卵囊，第四是裂殖体第五是裂殖子。在新孢子虫发育和传播过程中最主要的三种是速殖子、组织包囊和卵囊[5]。速殖子：在中间宿主中，大多数呈圆形卵和新月形，有些呈球形。你可以在普通的多倍显微镜下看到轮廓，你可以看到有3层薄膜的表面，薄膜下有22根微管，微管延伸到虫的背部，微管中的微丝数量因宿主而异。其在神经细胞、血管内皮细胞、管膜细胞和其他体细胞中经常存在。通常上速殖子寄生于一个宿主细胞内形成纳虫空泡，纳虫空泡在数次分裂后形成囊，最终宿主细胞因假囊挤压而破裂、死亡[6]。组织包囊：主要存在于脑、脊髓、神经，视网膜，骨骼肌等组织中[7]。呈规则地圆形或者椭圆形，有不规则的轮廓和光滑的壁。新孢子虫的组织包囊在合适的温度下有较长地寿命，并且具有传染性。卵囊:呈卵圆形,可随着终末宿主的粪便排出体外，其大小约为11.7×11.3µm[8]，刚被排出的卵囊不具备感染性，只有在适宜的环境下，才能够发育形成具有感染性的孢子化卵囊，孢子化卵囊内含有2个孢子囊，每个孢子囊内含有4个子孢子，子孢子的形态与速殖子类似。1.3犬新孢子虫的流行病学进展简述1.3.1犬新孢子虫生活史简述由于其生活周期地复杂性，以至于到目前为止对于新孢子虫的理解还不够完整和全面。目前已知的新孢子虫发育阶段中主要的三种形态是速殖子、组织包囊和卵囊[5]。有性生殖和无性生殖这两种方式包含了新孢子虫的发育史。有性生殖方式在终末宿主体内进行，无性生殖在中间宿主和终末宿主体内均可进行，刚排出体外的卵囊不具有感染性，在适宜的环境下经过孢子化才形成具有感染性的孢子化卵囊[9]，孢子化卵囊污染的食物和水等被中间宿主如羊摄入后，到达消化道发育为速殖子并侵袭宿主细胞，同时入侵宿主细胞的速殖子可经胎盘垂直传播到达幼畜体内，从而完成新孢子虫的整个生活史。1.3.2犬新孢子虫传播途径简述现在普遍认为犬新孢子虫的主要传播方式是垂直传播，到目前为止，唯一被证实的垂直传播途径是通过胎盘感染，通过胎盘受感染的动物直接传染给胎儿[10]，已知可进行垂直传播的动物主要有：牛、山羊、绵羊等。近几年来，随着犬新孢子虫的研究不断深入，越来越多研究认为引起犬新孢子虫病广泛流行的主要原因之一是水平传播。水平传播主要通过食肉动物摄取被污染的动物组织、食物和水而传播[11],也可通过母乳喂养传播[12]。目前认为新孢子虫的水平传播尚不存在于中间宿主与中间宿主之间，大部分的研究认为水平传播主要存在于终末宿主和中间宿主之间[13]，即肉食性的终末宿主吞食了感染犬新孢子虫的中间宿主后，感染的中间宿主随即会向外界环境中排出犬新孢子虫的卵囊，卵囊在适宜环境下完成孢子化过程变成有感染力的孢子化的卵囊并污染了食物、垫草或水源，当其他动物食用了被污染的食物或水源后，就造成了犬新孢子虫的新一轮传播和流行。因此，对于新孢子虫病的研究也应该关注其在野生动物、鸟类、海洋哺乳类及啮齿类的流行情况调查[14]，以利于更加快速有效地防治新孢子虫病。1.3.3新孢子虫病流行情况简述近几年来，世界范围内广泛报道了新孢子虫病的流行情况，并在不同的国家和地区得到了不同程度的报道。迄今为止，在几个国家和地区，包括欧洲、美洲、中国、日本、韩国、蒙古、澳大利亚、新西兰和非洲，都发现了新孢子虫感染动物，感染率从百分之几到百分之几十不等，这对牲畜造成了严重危害，并造成了相当大的经济损失。随着新孢子虫感染范围的扩大以及流行区域的扩大，寄生虫界已经对新孢子的研究产生了广泛的注意。但是我国对新孢子虫的研究较晚，2003年刘群等[15]对北京和山西的5个奶牛场的40头奶牛进行血清学检测，结果显示新孢子虫血清抗体阳性率为26.67%，从而首次报道了中国存在新孢子虫病。目前，对新孢子虫感染牛的研究报道最多。近几年来，陆续有关于羊犬新孢子虫感染羊的报道在我国各省市地区开始出现,但是湖南尚未出现关于羊犬新孢子虫感染的报道。但是由于新抱子虫病在羊养殖业等方面的重大危害，而羊已经日益成了人们不可或缺的肉食，所以我们有必要对湖南省犬新孢子虫的感染率、感染后的症状、治疗预防措施等方面进行更深入的研究，以保证人们的食品安全和人身健康。1.4国内外研究现状犬新孢子虫为专性细胞内寄生原虫,隶属于原生动物门、复顶亚门、孢子虫纲、新孢子虫亚纲、新孢子虫属[16]。1984年由挪威兽医学家Bjerkas在患脑膜炎和心肌炎的犬体内首先发现了新孢子虫[17]。由于其外观同弓形虫的外观非常相近,曾经被误认为是弓形虫,直到1988年,美国寄生虫学Dubey将其与弓形虫区别,命名为犬新孢子虫[18]。巴西的一项研究报道称通过免疫荧光抗体反应可在20%～30%HIV患者中检测到抗新孢子虫抗体,提示新孢子虫可能感染免疫缺陷病人，这说明新孢子虫可能是一种潜在的人兽共患寄生虫,,但这一发现需要更充分的证据证实[19]。目前用于治疗或预防新孢子虫病的有效药物或商品化疫苗较为匮乏,疫苗被认为是控制新孢子虫病最有效的方法[20]。新孢子虫病疫苗已报道的包括灭活疫苗、弱毒疫苗、重组蛋白疫苗和核酸疫苗等[21]。新孢子虫可以感染多种的哺乳动物,呈全球性分布,给养殖业带来了巨大的经济损失[22-24]。有研究表明犬既是新孢子虫的终末宿主，也是中间宿主[25]。除了犬，美国土狼，英国红狐狸和澳大利亚野生犬也被证实是新孢子虫的终末宿主[26-27]，但该寄生虫仍可感染多种家畜和野生动物,且感染率较高,中间宿主包括犬、牛、马、山羊、绵羊、鹿等[28]。犬新孢子虫发育过程中具有五种常见地形态：速殖子、组织包囊、缓殖子、卵囊和子孢子。其中在新孢子虫发育和传播过程中最主要的有三种：速殖子、组织包囊和卵囊[29]。新孢子虫既可以通过垂直传播也可以通过水平传播[30],水平传播是：通过摄入终末宿主代谢的含有子孢子的卵囊进行的，垂直传播是：妊娠母畜经过胎盘将体内的新孢子虫速殖子传染给新生儿。水平传播看起来比垂直传播发生的频率低，但有报告强调它们在某些方面具有相关性[31-32]。目前认为新孢子虫的水平传播尚不存在于中间宿主与中间宿主之间，大部分的研究认为水平传播主要存在于终末宿主和中间宿主之间[33]。临床症状：对羊，新出生的羊羔体弱，部分共济失调，并且在出生后一个星期内死亡[34]。在已经成年的羊中，新孢子虫感染严重者会出现非化脓性脑膜脑炎、脊髓炎，脉管炎和神经胶质增生并发产生。并且偶有肝脏微脓肿和心肌炎的发生[35]。当母羊感染新孢子虫后，可导致反复流产[36]。1.5研究内容与目的本次的调查是通过对湖南省12个市级地区部分养殖场的羊进行的羊犬新孢子虫病的血清流行病学调查，计算出湖南省不同地市级地区的羊犬新孢子虫的感染比例、不同地区羊的易感性，为临床预防和诊断提供一定的参考，并根据血清流行病学调查的结果，建立系统的羊犬新孢子虫病预防诊断流程，并通过临床实践，不断的摸索与完善所建立的预防诊断流程。本次调查的目的是为了对湖南省不同地区羊犬新孢子虫的感染率有更好的了解，同时对羊犬新孢子虫病的检查和鉴定方法有更多的了解与研究，我们对湖南省12个地区部分养殖场的羊进行了犬新孢子虫血清学调查与统计。通过测定羊犬新孢子虫的发病率，观察发病的临床症状，为湖南省羊犬新孢子虫的预防和诊断提供科学依据。2实验材料与方法2.1实验对象在2019年1月至2020年1月期间，对湖南省12个不同地区的1000只羊开展了为期一年的调查，并通过采集这1000只羊的血清样本进行了血清学实验，得到了12个不同地区1000只羊的感染犬新孢子虫的数据。2.2主要实验设备和试剂移液枪及枪头、37℃恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、96孔板、小型离心机、冰箱、高速离心机、混合器、摇床、吸水纸、酶标仪、新孢子虫ELISA检测试剂盒2.3山羊犬新孢子虫的血清学检查2.3.1临床症状观察患病动物生前检查首先依赖于临床症状进行初步判断，新孢子虫病主要引起母畜繁殖障碍和仔畜的运动神经症状等[37]。大多数的新孢子虫病是分散或地方性的，传播很少受外部环境如温度或湿度的影响，因此新孢子虫病的流行不是季节性的，可以全年发生，但在夏季发病率较高，因为夏季的温度适合犬新孢子虫的生长和繁殖。由于新孢子虫病是一种普遍分布的传染病，如果动物集体表现出母畜的生殖障碍和幼龄动物的神经症状，新孢子虫的感染在被检查确诊之前应该被认为是可疑的对象。2.3.2准备样品血清羊血清的采集，血清采自湖南省12个不同市级地区羊养殖场饲养的羊群，共采集了1000份血清样品，采血时均采用颈静脉采集、均是空腹采集，采集后摆成斜面，在常温下静止6h，然后分离血清，进行编号、登记，在－20℃下冷冻保存备用。2.3.3实验室检查（1）首先向孔中加入样品血清:用样品稀释剂将标准阳性和阴性血清按1:20的稀释度稀释，在每个孔中加入100uL，并为阴性和阳性标准样品各做两孔；然后使用样品稀释剂按1:20的稀释度剂稀释待测血清，每个血清样品只能加入一个孔，并且在两个孔中设置空的对照孔，没有任何血清样品。密封并在37℃下反应30分钟。（2）进行洗板：倒出每个孔中的液体，1×工作液的制备是将洗涤液稀释，为了洗板往每个孔中添加250uL的工作液，重复2-5次，最后一次将孔中液体弃尽后，再用吸水纸将孔吸干。（3）往孔中加入酶标二抗：用血清样品稀释液对浓缩酶标记抗体做1:100稀释度的稀释，再每孔加入100uL，进行密封处理，在37°C下反应30min。（4）将步骤（2）重复进行一次。（5）往孔中加入底物：以1:1的体积比将底物a和b混合，然后向每个孔中加入100uL，稍微震荡使充分混合，再进行密封处理，并在37℃下反应10分钟。保持与步骤(3)一样的注射顺序，并且时间从第二个酶抗性添加进入第一个孔中后开始计算。（6）终止反应：100uL的终止液加入到每个孔中，然后轻摇混匀，使用酶标仪测定吸光度。2.4计算和判定标准在450nm波长处，使用酶标仪测定酶标板上的每个孔的光吸收值，以计算每份检测的血清的2个孔的平均光吸收值（S），然后除以同板标准的阴性血清的2个孔的平均光吸收值（N），就可以得出每一份被检测血清的S/N值，若2.4≤标准阳性值/标准阴性值，那么实验就可以成立。判定标准：每一份血清都是以1:20的稀释度进行的稀释，当S/N值≥2.40则可以判定为阳性，S/N值≤1.90则可以判定为阴性，如果S/N值介于2.40和1.90之间者则可判定为可疑，应该重新测定，重新测定后，如果S/N值≥2.40则可以判定为阳性，如果S/N值＜2.40则可以判定为阴性。3结果与分析3.1结果本实验检测了来自湖南省12个市级地区部分养殖场的1000头山羊血清，采用了常用于犬新孢子虫检测的血清学方法：酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。结果显示，被检测的血清样品中共有22份血清样品被检测为犬新孢子虫血清阳性样品，总阳性率为2.2%，其中长沙共检测358只，有1只为阳性，阳性率为0.3%（1/358）,郴州共检测44只，有0只为阳性,衡阳共检测77只，有0只为阳性，阳性率为0%（0/77），怀化共检测77只，有3只为阳性，阳性率为3.9%（3/77）,吉首共检测83只，有0只为阳性,阳性率为0%（0/83），娄底共检测30只，有0只为阳性，阳性率为0%（0/30），邵阳共检测33只，有0只为阳性，阳性率为0%（0/33），湘潭共检测75只，有0只为阳性，阳性率为0%（0/75），益阳共检测30只，有6只为阳性，阳性率为20%（6/30）,永州共检测34只，有0只为阳性，阳性率为0%（0/34），岳阳共检测90只，有12只为阳性，阳性率为13.3%（13/90）,张家界共检测69只，有0只为阳性。湖南省内长沙、怀化、益阳、岳阳均为犬新孢子虫病的流行地区，其中益阳和岳阳流行较为严重。犬新孢子虫血清检测结果表明在不同来源地区阳性率不同，具体数据如表1。表1湖南省山羊新孢子虫血清学阳性率Table1SerologicalPositiveRateofNeosporainGoatsinHunanProvince地区检测数阳性数阳性率(%)(95%CI)长沙35810.3(0-0.8)郴州440—衡阳770—怀化7733.9(0-8.2)吉首830—娄底 300—邵阳330—湘潭750—益阳30620(5.7-34.3)永州340—岳阳901213.3(6.3-20.4)张家界690—总共1000222.2(1.3-3.1)3.2山羊犬新孢子虫感染的血清学数据（图2）分析为了进一步了解湖南省12个市级地区羊养殖场的羊感染犬新孢子虫的基本情况，以便能够更有效地开展对新孢子虫病的防治工作，本次实验采用了用于检测犬新孢子虫的常用的ELISA方法，首次对湖南省12个市级地区部分羊养殖场进行了犬新孢子虫病的血清流行病学调查，本次调查的结果表明，来自湖南省12个市级地区部分羊养殖场的1000份样本血清中有22份学清呈群新孢子虫抗体阳性，阳性率为2.2%，怀化市、岳阳市、益阳市、长沙市部分地区有羊场感染犬孢子虫病，其中益阳和岳阳流行较为严重。这可能与地理环境、饲养管理方式有关。因为羊肉越来越成为人们必不可少的食物，所以应引起相关机构的重视，更加注重平时的预防。4结论鉴于羊作为重要的中间宿主在犬新孢子虫的流行传播过程中起着非常重要的作用，目前有越来越多的证据显示了犬新孢子虫感染羊的情况在世界各地广泛存在，它对羊的繁殖生产构成严重威胁，给羊养殖业带来极大的危害，所以对湖南省不同羊养殖场进行犬新孢子虫的血清流行病学调查就显得十分地重要。这是首次对湖南省12个市级地区部分羊养殖场的山羊感染犬新孢子虫的流行情况调查，在这项调查研究中，山羊犬新孢子虫的总血清阳性率为2.2％（22/1000,95％CI1.3-3.1），不同地区之间的血清阳性率变化较大，从益阳的20%(6/30，95％CI5.7-34.3)、岳阳的13.3%（13/90，95％CI6.3-20.4），到怀化的3.9%(3/77，95％CI0-8.2)、长沙的0.3(1/358，95％CI0-0.8)，这四个地区存在羊犬新孢子虫感染，其他8个市区未检测到存在羊感染犬新孢子虫。目前在世界各地均有关于羊的犬新孢子虫的流行情况的报道，这次对湖南省不同市区的羊血清阳性率结果为2.2％，低于伊拉克的5.6％[38]、哥斯达黎加6.1％[39]、阿根廷的6.6％[40]以及巴西的6.4%[41],说明我省羊感染犬新孢子虫的情况比这些国家要好，但是个别市区已经高出太多！虽然由于调查的地点、检测的方法、羊品种和各种样本容量的不同，很难将这些研究之间的犬新孢子虫血清阳性率做比较，但是这些研究都证实了不同品种的羊都很容易被犬新孢子虫感染。为获得湖南省不同地区山羊感染新孢子虫的流性病学情况，本此试验应用ELISA的方法检测了湖南省12个市部分地区山羊养殖场新孢子虫的感染情况。本试验中使用的样本试验共采集了湖南省12个市部分地区山羊养殖场1000份山羊血清样品。本次对于湖南省山羊血清流行病学调查的结果表明，在湖南省的山羊新孢子虫总感染率为2.2%，而最严重的高达20%。本论文初步证实湖南省部分地区山羊新孢子虫的感染率较高，因为目前羊肉已经越来越成为了必不可少的肉食，所以为保护养殖业的发展和人类的健康，相关部门应该引起足够的重视，提早发现，提早预防，提早进行治疗，避免感染了犬新孢子虫的羊肉流入市场，保护人们的身体安全。参考文献VarcasiaA.PrevalenceofNeosporacaninuminfectioninSardiniandairyfarms(Italy)detectedbyiscomELISAontankbulkmilk[J].ParasitolRes,2006,98:264-267.SedlákK,BártováE.SeroprevalencesofantibodiestoNeosporacaninumandToxoplasmagondiiinzooanimals[J].VetParasitol,2006,136(3-4):223-231.DubeyJP,ScharesG.Neosporosisinanimals--theastfiveyears[J].VetParasitol,2011,180(1-2):90-108.WoodbineKA,MedleyGF,MooreSJ,etal.Afouryearlongitudinalsero-epidemiologystudyofNeosporacaninuminadultcattlefrom114cattleherdsinsouthwestEngland:associationswithage,herdanddam-offspringpairs[J].BMCVetRes,2008,15,4:35.郭俊林.犬新孢子虫病[J].北京农业,2012(25):33.和学秀.BALB/c小鼠感染新孢子虫后腹腔巨噬细胞极化的初步研究[D].吉林大学,2017.PetersM,LütkefelsE,HeckerothAR,etal.ImmunohistochemicalandultrastructuralevidenceforNeosporacaninumtissuecystsinskeletalmusclesofnaturallyinfecteddogsandcattle[J].InternationalJournalforParasitology,2001,31(10):1144.DubeyJP.ReviewofNeosporacaninumandneosporosisinanimals[J].KoreanJournalofParasitology,2003,41(1):1-16.朱兴全.全国高等院校教材小动物医学系列教材小动物寄生虫病学[M].中国农业科学技术出版社,2006.TreesAJ,WilliamsDJ.EndogenousandexogenoustransplacentalinfectioninNeosporacaninumandToxoplasmagondii[J].TrendsParasitol,2005,21(12):558-61.GondimLFP,GaoL,McAllisterMM.ImprovedproductionofNeosporacaninumoocysts,cyclicaloraltransmissionbetweendogsandcattle,andinvitroisolationfromoocysts[J].JParasitol2002,88(6):1159-1163.DubeyJP,ScharesG,Ortega-MoraLM.EpidemiologyandcontrolofneosporosisandNeosporacaninum[J].ClinMicrobiol,2007,20(2):323–367.DubeyJP,BuxtonD,WoudaW.Pathogenesisofbovineneosporosis[J].JournalofComparativePathology,2006,134(4):267.DeBarrosLD,MiuraAC,Minutti,AnaFlávia,etal.Neosporacaninum,inbirds:Areview[J].ParasitolInt,2018,67(4):397-402.刘群,李博,齐长明，朱引洁.奶牛新孢子虫病血清学检测初报[J].中国兽医杂志,2003(02):8-9.郭衍冰,曹利利,姚新华,苑淑贤,程荣华,王英贺.新孢子虫与宿主关系研究进展[J].动物医学进展,2015,36(09):105-108.Bjerkås,S.F.Mohn,J.Presthus.Unidentifiedcyst-formingsporozooncausingencephalomyelitisandmyositisindogs[J].ZParasitenkd.1984,70(2):271-274.DubeyJP,CarpenterJL,SpeerCA,etal.Newlyrecognizedfatalprotozoandiseaseofdogs[J].JAmVetMedAssoc.1988,192(9):1269-1285.OshiroLM,Motta-CastroAR,FreitasSZ,etal.NeosporacaninumandToxoplasmagondiiserodiagnosisinhumanimmunodeficiencyviruscarriers[J].RevSocBrasMedTrop.2015Sep-Oct;48(5):568-72.doi:10.1590/0037-8682-0151-2015.请参考模板，校对参考文献的格式是否正确，特别是作者名字的写法请参考模板，校对参考文献的格式是否正确，特别是作者名字的写法王晓岑,刘群，张西臣.新孢子虫病免疫预防研究进展[J].中国兽医学报,2019,39(10):2096-2100.王雪,孟庆峰，刘新欣,等.新孢子虫抗原及疫苗研究进展[J].动物医学进展,2015(12):129-133.OcalN,AtmacaHT,AlbayMK,etal.AnewapproachtoNeosporacaninuminfectionepidemiology:neosporosisinintegratedandruraldairyfarmsinTurkey[J].TurkishJournalofVeterinary&AnimalSciences,2014,38(2):161-168.SinnottFA,MonteLG,CollaresTF,etal.BlockingELISAusingrecombinantNcSRS2proteinfordiagnosingbovineneosporosis[J].CurrMicrobiol,2015,70(3):429-432.Caetano-da-SilvaA,FerreI,Collantes-FernandezE,etal.OccasionaldetectionofNeosporacaninumDNAinfrozenextendedsemenfromnaturallyinfectedbulls[J].Theriogenology,2004,62(7):1329-1336.谢素珠,李航,张宁宁,陈健,杜秋明,贾立军.犬新孢子虫NC-GFP株在4种细胞中培养的比较[J].中国兽医学报,2018,38(09):1716-1719.WapenaarW,JenkinsMC,O'HandleyRM,etal.NEOSPORACANINUM–LIKEOOCYSTSOBSERVEDINFECESOFFREE-RANGINGREDFOXES(VULPESVULPES)ANDCOYOTES(CANISLATRANS)[J].JournalofParasitology,2015,92(6):1270-1274.KingJS,SlapetaJ,JenkinsDJ,etal.AustraliandingoesaredefinitivehostsofNeosporacaninum[J].InternationalJournalforParasitology,2010,40(8):945-950.DonahoeSL,LindsaySA,KrockenbergerM,PhalenD,SlapetaJ.AreviewofNeosporosisandpathologicfindingsofNeosporacaninuminfectioninwildlife.IntJParasitolParasitesWildl.2015;4(2):216-38.王雅楠.一例山羊新孢子虫病的临床观察及病原分离和鉴定[D].吉林大学,2018.吉尔格力,许正茂,刘梦丽,乔格拉森,巴音查汗.巴州部分地区牦牛黄牛新孢子虫病循环抗体检测[J].中国兽医杂志,2017,53(08):40-41.BartelsCJ,HuininkI,BeiboerML,etal.Quantificationofve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