生物化学实验电泳技术操作指南

生物化学实验电泳技术操作指南电泳技术作为生物化学研究中分离、分析核酸与蛋白质的核心手段，凭借其对分子电荷、分子量及空间构象的差异化响应，在基因克隆、蛋白纯化、疾病标志物检测等领域发挥着不可替代的作用。本指南围绕琼脂糖凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）两种经典技术，从原理阐释、操作流程到结果解析，提供兼具专业性与实用性的操作规范，助力实验人员高效完成电泳实验并保障结果可靠性。一、实验原理阐释（一）琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖是从海藻中提取的线性多糖，其形成的凝胶网络兼具分子筛效应与电荷分离效应：分子在电场中迁移时，凝胶孔隙对不同大小的核酸分子（DNA/RNA）形成筛分阻力，分子量小的分子迁移更快；同时，核酸分子因磷酸基团携带负电荷，在碱性缓冲液（如TAE、TBE）中向正极泳动，迁移速率与分子大小、构象（如超螺旋、线性、开环DNA）密切相关。（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）原理聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）与甲叉双丙烯酰胺（Bis）在引发剂（过硫酸铵，AP）和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作用下聚合而成，形成三维网状结构。实验中，十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性并结合为“蛋白-SDS”复合物，消除蛋白原有电荷差异，仅保留分子量依赖性迁移：复合物在凝胶中受分子筛效应影响，分子量越小，迁移速率越快，最终实现蛋白质的分子量分级分离。若需分析蛋白亚基（如寡聚蛋白），需加入巯基乙醇等还原剂破坏二硫键。二、仪器与试剂准备（一）核心仪器1.电泳系统：包含电泳仪（需稳定输出恒压/恒流/恒功率模式）、水平电泳槽（琼脂糖电泳用）或垂直电泳槽（SDS用）；2.制胶装置：琼脂糖制胶板、梳子（不同齿宽适配不同上样量）；垂直电泳的玻璃板、隔片、梳子；3.辅助设备：移液器（多规格）、涡旋振荡器、微量离心机（样品瞬时离心）、微波炉（溶解琼脂糖）、紫外透射仪（观察核酸条带）、脱色摇床（蛋白染色后脱色）。（二）试剂配置1.琼脂糖凝胶电泳试剂缓冲液：50×TAE（Tris-乙酸，EDTA）或50×TBE（Tris-硼酸，EDTA），使用时稀释为1×工作液；琼脂糖：根据分离片段大小选择浓度（如分离____bp片段用1%琼脂糖，<200bp用2%）；核酸染料：如GoldView、SYBRGreen（制胶时按1:____比例加入熔化的琼脂糖中）；上样缓冲液：含溴酚蓝（指示剂）、甘油（增加样品密度），使用前与样品按1:5-1:10体积比混合。2.SDS电泳试剂凝胶储备液：30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（Acr:Bis=29:1，避光4℃保存）；分离胶/浓缩胶缓冲液：含Tris-HCl（pH8.8/pH6.8）与0.1%SDS；电泳缓冲液：Tris-甘氨酸缓冲液（pH8.3），含0.1%SDS；上样缓冲液：含SDS、β-巯基乙醇（还原剂）、溴酚蓝、甘油，样品与上样缓冲液按1:1混合后，95℃加热5-10min；染色液：考马斯亮蓝R-250染色液（0.1%考马斯亮蓝，45%甲醇，10%乙酸）；脱色液：10%乙酸+45%甲醇（或水，根据染料类型调整）。三、操作流程详解（一）琼脂糖凝胶电泳操作1.凝胶制备称取适量琼脂糖（如1g琼脂糖用于100mL1×TAE缓冲液），放入锥形瓶，加入1×TAE缓冲液，微波炉加热至完全溶解（期间取出振荡1-2次，避免暴沸）；冷却至50-60℃（手感温热不烫），加入核酸染料（如5μLGoldView到50mL凝胶液中），轻轻混匀（避免气泡）；将制胶板置于水平台，插好梳子（确保梳子与胶板底部间距2-3mm），缓慢倒入凝胶液，室温静置30-60min至完全凝固。2.样品处理与上样取5-10μL核酸样品，加入1-2μL上样缓冲液，涡旋混匀后瞬时离心（避免样品挂壁）；小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，加入1×TAE缓冲液至没过凝胶（液面高于胶面2-3mm）；用移液器吸取样品，将枪头斜贴胶孔壁，缓慢释放样品（避免戳破胶孔或样品溢出），同时记录样品顺序与Marker位置。3.电泳与结果观察连接电泳仪，设置电压（通常5-10V/cm胶长），时间30-60min（根据片段大小调整）；电泳结束后，关闭电源，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察（或用凝胶成像系统拍照），根据条带位置与Marker对比，分析核酸分子量、纯度及完整性。（二）SDS电泳操作1.凝胶制备（垂直板胶）分离胶配制：按体积比混合30%Acr-Bis（如5mL）、分离胶缓冲液（2.5mL）、水（2.5mL）、10%AP（50μL）、TEMED（5μL），轻轻混匀（避免气泡），立即倒入玻璃板间隙（高度距加样梳齿底约2cm），在胶面加一层水（或异丙醇）隔绝空气，加速凝固（约30-60min）。浓缩胶配制：倒去上层水，用滤纸吸干残留液体；混合30%Acr-Bis（1mL）、浓缩胶缓冲液（1.25mL）、水（2.75mL）、10%AP（30μL）、TEMED（5μL），混匀后倒入玻璃板，插入加样梳，室温凝固30min。2.样品处理与上样蛋白样品与上样缓冲液按1:1混合，95℃加热5min（还原型电泳），瞬时离心；小心拔出梳子，将电泳槽加入电泳缓冲液（上下槽均加满），用注射器吸取缓冲液冲洗胶孔（去除未聚合的丙烯酰胺）；用移液器吸取10-20μL样品（或Marker），缓慢加入胶孔，记录样品顺序。3.电泳与染色连接电泳仪，设置电压：浓缩胶阶段用低电压（50-80V），待溴酚蓝进入分离胶后，切换为高电压（____V），总时间约90min（或至溴酚蓝到达胶底）；电泳结束后，卸下玻璃板，用刀片撬开，将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，室温振荡染色1-2h；倒去染色液，加入脱色液，振荡脱色3-6h（期间更换2-3次脱色液），直至背景清晰，条带显现。四、结果分析与注意事项（一）结果分析要点核酸电泳：通过条带位置与Marker对比，计算核酸分子量；条带亮度反映核酸浓度，拖尾或smear可能提示样品降解或污染；蛋白电泳：根据条带位置与蛋白Marker对比，计算蛋白亚基分子量；条带数量与清晰度反映蛋白纯度，若出现多条带，可能为蛋白降解或存在异构体。（二）关键注意事项1.试剂稳定性：过硫酸铵需现配现用（4℃保存不超过1周），TEMED密封避光保存；丙烯酰胺溶液避免长时间暴露，操作时通风并佩戴防护装备；2.制胶精度：琼脂糖凝胶需水平放置，确保胶厚均匀；聚丙烯酰胺凝胶配制时，AP与TEMED的加入量需准确，否则影响胶的凝固速度与孔径；3.上样规范：样品与上样缓冲液充分混匀，上样时避免气泡进入胶孔，枪头不可戳破胶底；4.电泳安全：电泳仪工作时避免触摸电极，高压电泳需确保电泳槽盖密闭；核酸染料、丙烯酰胺均具毒性，操作后彻底洗手，废液单独收集处理；5.缓冲液管理：电泳缓冲液使用2-3次后需更换，避免离子强度降低导致迁移速率异常。五、常见问题及解决策略问题现象可能原因解决方法条带模糊、smear样品降解（核酸酶/蛋白酶污染）操作时使用无酶枪头、离心管，样品加酶抑制剂胶不均匀（琼脂糖未完全溶解/制胶倾斜）确保琼脂糖完全溶解，制胶板水平放置电压不稳或过高检查电泳仪输出，调整电压至推荐范围条带拖尾上样量过多减少样品体积或稀释样品样品盐浓度过高（如PCR产物含残留缓冲液）上样前对样品进行乙醇沉淀或柱纯化胶孔变形（梳子拔出过急）凝固后缓慢垂直拔出梳子无条带或条带极弱电泳方向错误（正负极接反）确认核酸/蛋白带负电，向正极泳动样品未加入胶孔（枪头未插入或样品挂壁）上样时确保枪头深入胶孔，加样后停留1s再拔枪头染料失效或未加入凝胶更换染料，制胶时严格按比