酵母双杂交实验步骤详解

酵母双杂交实验步骤详解一、实验原理概述酵母双杂交技术（YeastTwo-HybridSystem）依托转录因子的模块化结构实现蛋白互作检测。以经典的GAL4系统为例，转录因子GAL4包含DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）：BD负责结合报告基因的启动子区域，AD则招募转录机器以启动基因表达。当诱饵蛋白（与BD融合）和靶蛋白（与AD融合）发生相互作用时，BD与AD会因蛋白互作在空间上靠近，形成有功能的转录因子，进而激活下游报告基因（如*HIS3*、*ADE2*、*LacZ*）的表达。通过营养缺陷筛选（如在缺失His、Ade的培养基中筛选）或显色反应（如用X-gal检测LacZ），即可判断蛋白是否存在互作。二、实验材料准备1.菌株与载体酵母菌株：常用AH109（含*HIS3*、*ADE2*、*LacZ*报告基因，营养缺陷型为*trp1-901*、*leu2-3,112*）、Y187（可用于单杂交或文库筛选）；质粒载体：诱饵载体（如pGBKT7，含*TRP1*标记、GAL4-BD）、靶载体（如pGADT7，含*LEU2*标记、GAL4-AD）；大肠杆菌菌株：*DH5α*或*Top10*（用于质粒扩增）。2.培养基与试剂酵母培养基：YPD（全营养培养基，用于菌株活化）、SD系列缺陷培养基（如SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade，可按需添加3-AT以抑制*HIS3*本底）；转化试剂：50%PEG3350、1MLiAc（醋酸锂）、TE缓冲液（pH7.5）、变性鲑鱼精DNA（ssDNA，新鲜制备或-20℃保存）；分子克隆试剂：限制性内切酶（如*Eco*RⅠ、*Bam*HⅠ）、T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒、PCR试剂；验证试剂：X-gal（LacZ显色）、ONPG（β-半乳糖苷酶活性定量）、蛋白上样缓冲液、抗体（如HA、Myc标签抗体，用于Westernblot验证蛋白表达）。3.仪器设备恒温培养箱（30℃，用于酵母培养）、摇床（30℃，用于液体培养）、高速离心机、PCR仪、超净工作台、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪（用于定量β-半乳糖苷酶活性）。三、实验步骤详解1.诱饵与靶蛋白的载体构建（1）目的基因扩增与克隆从cDNA文库或基因组DNA中扩增目的基因（诱饵或靶蛋白的编码序列），设计引物时需确保阅读框正确（即目的基因与载体的BD/AD编码框完全匹配，避免移码突变）。例如，pGBKT7的多克隆位点阅读框为：`...ATG(BD)-[MCS]-...`，需保证目的基因的起始密码子与BD的终止密码子（或酶切位点后的序列）阅读框连续。（2）载体酶切与连接用相同的限制性内切酶（如*Eco*RⅠ+*Bam*HⅠ）酶切载体（pGBKT7/pGADT7）和目的基因PCR产物，胶回收纯化；按载体:插入片段=1:3~1:10的摩尔比，加入T4DNA连接酶，16℃连接过夜；连接产物转化*DH5α*感受态细胞，涂布含相应抗生素（如卡那霉素、氨苄青霉素）的LB平板，37℃培养12~16h。（3）阳性克隆验证挑取单菌落，用菌落PCR或质粒双酶切验证插入片段；对阳性克隆进行测序，确认阅读框、序列完整性无误后，提取质粒备用。2.酵母菌株的准备（1）菌株活化从-80℃冻存管中取少量AH109菌株，接种至YPD液体培养基（或平板），30℃摇床培养16~20h（液体培养转速200rpm），使菌株复苏并达到对数生长期（OD₆₀₀≈1.0~1.5）。（2）感受态细胞制备（LiAc/PEG法）取1~5mL活化的酵母菌液，5000rpm离心5min收集菌体；用10mL无菌水重悬，离心洗涤2次；用1mLTE/LiAc（10mMTris-HClpH7.5，1mMEDTA，0.1MLiAc）重悬菌体，调整OD₆₀₀至1.0左右，即为感受态细胞（现用现制或4℃保存不超过24h）。3.质粒共转化与初筛（1）转化体系配制在无菌EP管中依次加入：感受态细胞100μL；诱饵质粒（pGBKT7-诱饵）1~5μg；靶质粒（pGADT7-靶）1~5μg；变性ssDNA（新鲜煮沸后冰浴）50μL；50%PEG3350600μL；轻轻混匀，30℃静置30min（或摇床缓慢振荡）。（2）热激与复苏42℃水浴热激15~20min（注意时间与温度准确性，影响转化效率）；5000rpm离心5min，弃上清；用100μL无菌水重悬菌体，涂布于SD/-Trp-Leu双缺培养基（筛选同时含*TRP1*、*LEU2*标记的转化子），30℃倒置培养3~5天，至单菌落出现。4.互作验证与筛选（1）营养缺陷筛选（初筛）用灭菌牙签挑取双缺平板上的单菌落，点种至SD/-Trp-Leu-His三缺培养基（或SD/-Trp-Leu-His-Ade四缺培养基），同时可在培养基中添加3-AT（如10~50mM）抑制*HIS3*基因的本底表达（减少假阳性）；30℃培养3~7天，观察菌落生长：能在三缺/四缺培养基生长的菌落，提示诱饵与靶蛋白可能存在互作（因*HIS3*/*ADE2*报告基因被激活）。（2）报告基因验证（复筛）LacZ显色验证：将初筛阳性菌落接种至SD/-Trp-Leu液体培养基，30℃摇床培养至OD₆₀₀≈1.0；取1mL菌液，离心收集菌体，用Z缓冲液重悬，加X-gal（终浓度0.8mg/mL），30℃避光孵育，观察蓝色出现（蓝色越深，互作越强）。β-半乳糖苷酶活性定量（ONPG法）：按上述方法收集菌体，用液氮冻融或玻璃珠破碎法裂解细胞；加入ONPG底物，30℃反应至出现黄色，加Na₂CO₃终止反应；酶标仪测定OD₄₂₀，计算酶活性（公式：酶活性=1000×OD₄₂₀/(t×V×OD₆₀₀)，t为反应时间，V为菌液体积）。Westernblot验证：提取酵母总蛋白，用HA、Myc等标签抗体检测诱饵（如pGBKT7带Myc标签）和靶蛋白（如pGADT7带HA标签）的表达，排除“无互作但报告基因激活”的假阳性（如诱饵蛋白自激活）。5.自激活检测（关键质控步骤）将诱饵质粒（pGBKT7-诱饵）单独转化AH109感受态细胞，涂布于：SD/-Trp培养基（验证转化成功）；SD/-Trp-His（或SD/-Trp-His-Ade）培养基（加3-AT）；若转化子在SD/-Trp-His培养基上生长，说明诱饵蛋白自身可激活报告基因（自激活），需通过截短蛋白、点突变或更换弱启动子载体（如pGBKT7-Δ）优化，或降低筛选压力（如减少3-AT浓度）。四、实验关键注意事项1.阅读框准确性：克隆时务必通过测序验证目的基因与载体的阅读框，移码突变会导致融合蛋白错误，彻底丧失互作检测功能。2.菌株活力与转化效率：酵母菌株需新鲜活化（对数生长期），转化时ssDNA需新鲜变性（煮沸后冰浴），PEG/LiAc的浓度与质量直接影响转化效率。3.假阳性控制：严格进行自激活检测，筛选时增加3-AT浓度、使用四缺培养基（同时筛选*HIS3*+*ADE2*），或结合LacZ显色与Westernblot验证，减少“非特异性互作”或“自激活”导致的假阳性。4.培养基选择：不同酵母菌株的报告基因组合不同（如AH109含*HIS3*/*ADE2*/*LacZ*，Y187含*LacZ*/*HIS3*），需根据菌株说明书选择对应的缺陷培养基。五、常见问题与解决策略问题现象可能原因解决方法------------------------------双缺平板无菌落生长转化失败（质粒浓度低、菌株失活）重新制备感受态，确保质粒浓度>1μg/μL，热激时间严格控制在15~20min三缺/四缺平板大量菌落生长（假阳性）诱饵自激活、靶库污染重做自激活检测，优化3-AT浓度（如提高至50mM），重新构建靶载体或更换文库无阳性克隆但蛋白表达正常互作强度弱、筛选条件过严降低3-AT浓度，延长培养时间（至7天），或换用更敏感的报告菌株（如Y2HGold）蛋白无表达（Westernblot阴性）密码子偏好、启动子沉默优化酵母偏好密码子（如替换稀有密码子），检查质粒是否整合到酵