鸡滑液囊支原体病的诊断与防控

PAGE鸡滑液囊支原体病的诊断与防控摘要鸡滑液囊支原体（MycoplasmaSynoviae,MS）感染是一种以亚临床上呼吸道感染为最常见特征的支原体感染。滑液囊支原体感染引起的滑膜炎可引起鸡关节肿大，同时累及气囊、腱鞘和胸骨。肿胀的足垫和关节可作为滑液囊支原体感染进展的指标，会导致鸡进行性消瘦。一旦感染滑液囊支原体，会给养鸡场带来严重的经济损失。因此，鸡滑液囊支原体病的有效防控具有非常重要的意义。本文从病原学、流行病学、临床诊断、实验室诊断、防控等方面入手，较细致介绍滑液囊支原体病，并提出了详细的防控措施；同时本研究对发生的与滑液囊支原体引起的关节炎相似的疾病做出临床鉴别指导，以防诊断错误。滑液囊支原体的确诊，须通过实验室诊断；实验室诊断方法有血清学检测、病原分离培养、分子生物学诊断。由于国内尚无鸡滑液囊支原体病疫苗上市，药物是目前防控鸡滑液囊支原体病的最佳方案。在用药物防控鸡滑液囊支原体病的同时，务必重视耐药性和药物残留问题。关键词:鸡滑液囊支原体诊断防控目录TOC\o"1-2"\h\z\u298111前言 1231361.1研究背景 1279291.2研究现状 1164181.3研究意义 1233862病原学和流行病学 2273713临床诊断 4322483.1临床症状 439063.2临床病理变化 533333.3临床鉴别诊断 630784实脸室诊断 7160184.1血清学检测 738304.2病原分离培养 7168074.3分子生物学诊断 7271785防控 9272095.1种鸡的净化 927265.2加强生物安全管理 9241475.3饲养管理 9164305.4防疫接种 9210995.5合理使用药物 10186846小结与讨论 118033后记 1126647参考文献 12PAGE51前言1.1研究背景随着人均生活水平的提高，市场对鸡肉、鸡蛋需求量也相应加大，这就大大刺激了养禽业的蓬勃发展，但是随之而来的各种传染性疾病也给养禽业造成了潜在的或直接的威胁。近年来，鸡滑液囊支原体病在我国的发病率呈增多趋势，给养鸡产业带来很大的经济损失。1.2研究现状禽类支原体主要感染家禽，广泛寄生于家禽的呼吸道、泄殖腔、消化道、输卵管黏膜及关节囊中。目前鉴定命名的禽类支原体共有29种，其中属于支原体属的有25种、无胆甾原体3种、脲原体1种[1]。在这些支原体中，能同时感染鸡、火鸡、且致病的支原体主要有鸡毒支原体（Mycoplasmagallisepticum,MG）和滑液囊支原体（Mycoplasmasynoviae,MS）。但同致病力强的MG相比，养殖户对MS的认识、检测及防控远远不足，导致MS感染正在从非典型的上呼吸道亚临床症状转向严重的呼吸系统疾病，如气囊炎。当MS合并其他致病因子，如新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、低致病性禽流感病毒或大肠杆菌感染时，会使病情恶化；此外，MS引起的传染性滑膜囊炎、蛋壳形状畸形及自身免疫性疾病同样威胁着全球家禽养殖业的健康发展[2-5]。在18界世界禽病大会上就有专家提出“现在以及不远的将来MS的危害会超过MG”的观点[6]。最新的流行病学调查显示，在东欧地区以及荷兰、墨西哥、阿根廷等国家MS感染可引起严重的呼吸系统疾病和关节滑膜炎[7-8]；在我国MS的发病率亦呈明显上升趋势，加上环境及鸡群状态不良等不利因素，导致MS感染在鸡群中爆发的现象日趋严重[9-11]。鸡滑液囊支原体够感染鸡和火鸡，不同菌株的致病力有所不同，可引起亚临床型的上呼吸道感染，以及关节炎和传染性滑膜炎的发生，导致生长发育迟缓及酮体降级，甚至会激发免疫系统的抑制，鸡滑液囊支原体感染能够使产蛋鸡群的产蛋量和蛋品质下降。本病一年四季均可发生，但以冬春季节易发，各种日龄鸡只均易感，多见于1～4月龄鸡，发病率一般为5%～15%，死亡率约为1%～10%。雏鸡易感性比成年鸡要高，抵抗力随年龄的增长而加强，鸡滑液囊支原体除了水平传播外，还可以发生垂直传播，鸡滑液囊支原体可以通过感染鸡或火鸡经蛋传播给子代，感染初期，经卵传播率较高，经蛋传播感染鸡滑液囊支原体鸡的潜伏期相对较短，曾见于6日龄雏鸡[10]。1.3研究意义本文从MS病原学和流行病学、临床诊断、实验室诊断、防控等方面进行综述，对养殖场生物安全防护体系、养殖场MS的检测和净化具有一定意义。希望通过本文，能够让养殖朋友尽量避免或者降低鸡滑液囊支原体病的发生，创造更多的经济效益。2病原学和流行病学MS的鉴定主要根据典型的菌落和菌体形态、生化特性、特殊的生长要求及血清学反应。原体菌落的免疫荧光试验是鉴别田间分离株的最快速、最可靠的方法。16SrRNA基因的DNA序列分析被证实可用于支原体的鉴别和遗传进化研究。MS在姬姆萨染色片中表现为多形态的球状体，直径约0.2μm。对禽滑膜的超微结果研究证实，MS存在于内吞小泡中。支原体细胞呈圆形或梨形，内含颗粒性核糖体。MS直径为300～500nm，无细胞壁，并被3层膜所包裹。在电镜下，经钌红和负染证实了细胞外表面膜的存在。生长需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，但可以用烟酰胺代替较昂贵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸来生产抗原。血清也是生长所必需的，猪血清较好。用琼脂培养，可通过将琼脂平板置于密封的容器中，以避免琼脂干燥。最适生长温度为37℃。观察固体培养基上的菌落，最好是用30倍的解剖显微镜，使用间接光源，可见隆起、圆形、略似花格状、有中心或无中心的菌落。根据菌落多少、培养基是否合适及培养时间不同，菌落直径从不足1mm至3mm不等。固定培养基培养到3~5天后可见生长。在适当地添加了营养成分的培养基中，MS能发酵葡萄糖及麦芽糖，产酸不产气，不发酵乳糖、卫茅醇、水杨苷或蕈糖。MS呈磷酸酶阴性并产生薄膜和斑点。大多数MS分离株可凝集鸡或火鸡的红细胞。MS还原四唑盐的能力有限。未曾报道过MS对消毒剂的抵抗力，但可能和其他支原体相似。污染鸡舍经清洁和消毒后，再空置1周，然后将1日龄的雏鸡放进去，没有引起感染。MS在PH6.8或更低时不稳定，对高于39℃的温度敏感，能耐受冰冻，但滴度降低。以下测量均未达到终点，但可知在卵黄材料中MS于-63℃条件下至少存活7年，-20℃条件下2年之后仍存活。在-70℃条件下冻存的肉汤培养物以及在4℃条件下保存的冻干培养物，均可存活数年。在室温条件下，羽毛上的支原体至多可存活数年。在室温条件下，羽毛上的支原体至多可存活3天，而在鼻腔内至多可存活12h，但在多数其他材料上存活不会超过1天。用人工培养或PCR方法可检出包括羽毛、灰尘、食物、饮水和粪便在内的环境样品中的MS。用反转录PCR法检测16srDNA，可检测到感染鸡环境样品中存活的MS。将MS感染鸡群清除后3～5天仍可在该隔离器的环境中检出RT-PCR结果阳性或培养出MS.对血清平板凝集试验（SPA）、试管凝集试验（TA）、血凝试验（HA）、琼脂凝胶沉淀试验（AGP）和酶联免疫吸附试验（ELISA）的抗原都曾有过研究。利用Westernblot对MS的主要免疫原性膜抗原的特性已进行了研究。在斑点ELISA试验中，主要免疫性蛋白p4l为主要抗原，而p53和p22作用不明显。主要膜蛋白的大小因MS菌株的不同而异。感染MS的鸡的血清偶尔能凝集MG的平板抗原。Roberts和Olesuik认为这种交叉反应与类风湿因子的存在有观，组织反应刺激可以引起这种反应。而血凝抑制（HI）或TA试验的交叉反应则很低。MS和MG也有共同的抗原决定簇。针对MS的种特异性单克隆抗体已经开始生产。IgGFc受体也已鉴定出来。在WVU-1853株中，45~56kDa的表面蛋白为主要免疫原性蛋白，因分子量大小和表达量的不同，分为2个群：MSPA和MSPB，它们都与红细胞吸附有关，且差异表达。MSPA是一种血凝素，由单基因vlhA编码，该基因编码产物断裂形成MSPA和MSPB。该基因与MG的Pm-GAl.7基因同源性很高，与基因组其他部位的假基因的同源重组导致了vlhA的差异表达。血凝素阴性表型的培养物所表达的PMSB为缺损型，并且比血凝素阳性培养物的致病力弱。现有的资料表明MS只有一个血清型，经DNA-DNA杂交技术证实，MS不同菌株间的差异很小。可采用DNA核酸内切酶分析技术鉴别MS菌株。一种更简单更快捷的方法是利用RAPD技术，但是结果可能不一致。脉冲场凝胶电泳和扩增多态性DNA分析也是鉴别MS菌株的有用工具。对培养物或组织样品的部分vlhA基因进行测序，对分析各种MS菌株的性质也是很有用的。MS主要感染鸡、火鸡、珍珠鸡[12]，其他家禽均可感染，但多以幼雏为主，哺乳动物不感染，伊朗曾有学者在牡蛎中分离但MS[13]。MS感染不具有明显的季节性，但由于冬春季节发病率更高；MS病的发生不具有品种、日龄的差异，但28-120日龄鸡群较其他日龄易感[14]，由于成年鸡群对MS抵抗力较强，这就使得成年鸡感染后多呈隐形经过；有研究表明[15]，引进品种或品系的鸡发病率要高于本土品种，商品代蛋鸡群MS感染阳性率高于父母代，父母代比祖代要高。病鸡及隐形感染鸡群为该病的主要传染源[16]，MS不但可通过种蛋进行垂直传播，同时也可通过被带菌鸡分泌物污染的饲料、羽毛、空气、饮水等接触性传播，环境中吸血昆虫、鸡群的自然交配等进行水平传播。MS发病率高[17]，但死亡率通常不超过10%，产蛋鸡产蛋率下降20%。MS与其他致病因子如新城疫、鸡传染性支气管炎、大肠杆菌等病原混合感染时，会加剧呼吸道症状，尤其以气囊炎的发病程度更为严重。3临床诊断3.1临床症状在感染滑液囊支原体的鸡群中能够观察到的最初症状是冠苍白、跛行、及生长迟缓[18]。随着病情的发展，出现羽毛粗乱，鸡冠萎缩(见图1)。有些病例的鸡冠呈偏蓝的红色。关节周围常有肿胀（见图2），常有胸部的水疱（见图3）。跗关节及爪垫是主要感染部位，但有些鸡的大部分关节都会被感染，不过，也有些鸡偶见全身性感染而无明显的关节肿胀。病鸡表现不安、脱水和消瘦。虽然鸡已严重地感染发病看，但若置于食物及饮水附件，它们仍思饮食。常见含有大量尿酸或尿酸盐的偏绿的异色排泄物。出现上述急性炎症之后继以换慢的恢复，但滑膜炎可能在鸡群的整个生命周期中始终存在。有些情况下，则不见或不易发现急性期，群中仅见一些慢性感染的鸡。经呼吸道感染的鸡可能在4～6天时出现轻微啰音，也可能根本无症状。气囊感染可能发生于任何年龄，是肉鸡淘汰的一个常见原因。临床上，大多数由MS感染所引起的气囊病变发生在冬季。MS感染种鸡的后代气囊病变淘汰率增加、增重减缓、饲料报酬降低。3.2临床病理变化在滑液囊支原体病的早期，病禽腱鞘的滑液囊膜、关节、龙骨滑液囊可见有黏稠的、乳酪色至灰白色渗出物（见图4-图5），并伴有肝、脾肿大。肾肿大、苍白，呈斑驳状。随着病情的发展，在腱鞘、关节、甚至肌肉和气囊中有干酪样渗出物。在此期间，关节表面，尤其是跗关节和肩关节的表面不同程度地变薄至形成凹陷。在上呼吸道通常无肉眼可见病变。该病的呼吸型病变可能出现气囊炎。3.3临床鉴别诊断诊断时必须将滑液囊支原体和葡萄球菌、鸡伤寒、鸡白痢、病毒性关节炎引起的关节炎相区别。葡萄球菌引起的关节炎虽然也有肿胀、跛行，但葡萄球菌引起的关节炎多有趾瘤且在部分鸡的体表有紫色溃烂。鸡白痢和鸡伤寒有的可引起关节炎，但鸡有拉白色稀粪的现象，解剖有较特征性的内脏病变。病毒性关节炎主要感染鸡，尤其是肉鸡，多从4周龄开始发病，以后陆续不断。病鸡可发生腓肌腱断裂而跛行甚至瘫痪，但无死亡，而且精神、食欲等全身症状不明显。4实脸室诊断4.1血清学检测血清学检测由于操作简单、诊断快速，常作为MS感染的初步诊断方法。常用的血清学检测方法有血清平板凝集试验（SPA）、血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）3种，其中国内外检测MS感染的商品化ELISA试剂盒在生产中应用较多。但是，世界卫生组织仅将血清学检测方法推荐为在群体中进行鸡支原体筛选、监测的方法，而不是个体进行诊断的方法。由此看来，在进行血清学检测时，样本量一定要足够多。另外，血清学方法都存在一定比例的假阳性或假阴性反应，且在有的血清学检测方法中，MS感染易与鸡毒支原体（MG）感染发生交叉反应。因此，血清学检测发现的阳性样本应该用传统的微生物学病原分离培养及鉴定方法或分子生物学方法进一步鉴定。4.2病原分离培养采集疑似病鸡的咽喉试子，将病鸡关节和爪垫等肿胀部位剪开取渗出液或增生物，采集种鸡场中产蛋孵化后的雏鸡和啄壳死亡毛蛋的气囊棉试子，接种到支原体的培养基中。MS培养基可为添加了马血清的改良的KM2培养基，具体操作可参考侯宏艳文章中[19]绵羊肺炎支原体的分离培养方法进行。病原分离培养虽然是最准确、可靠的方法，但MS属于原核微生物，大小介于细菌和病毒之间，分离难度大，培养耗时长（1~3周），因此，病原分离培养在实际养鸡生产应用中受到一定的限制，不适合生产上的快速诊断和检测，特别是多个病原混合感染的情况下。4.3分子生物学诊断随着分子生物学的发展，研究人员相继建立了一些用于检测MS的分子生物学方法，如利用特异性的重组DNA探针来检测MS、根据MS的某段序列设计引物对MS进行PCR检测，其特异性、灵敏度高，能快速检测，检测的阳性率比病原分离培养的阳性率高，因此，在生产实际中，PCR方法已成为快速、有效检测MS感染的方法。对临床疑似MS感染病鸡肿胀关节和爪垫等部位内容物提取DNA后直接进行PCR检测，检测过程中可用自己合成的引物进行PCR扩增，再进行序列比对，也可使用国内商品化的滑液囊支原体PCR检测试剂盒进行检测。还有，黎敏[20]认为套式PCR较普通PCR灵敏度高、特异性更好，建立了MS的套式PCR检测方法。另外，MS在临床上常常与其他病原微生物混合感染，采用多重PCR一次反应可以检测2种或2种以上的病原，与常规PCR相比，简化了检测程序，节约检测成本和时间。如张磊[21]建立的三重PCR方法可用于MG（鸡毒支原体）、MS和MM（火鸡支原体）的同时检测和鉴别诊断；刘婷[22]建立了能同时检测MS、MG（鸡毒支原体）、EC（大肠杆菌）和SA（沙门氏菌）的多重PCR检测方法。近些年，实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）等新的分子生物学诊断方法加大了对MS诊断的准确性和实效性。5防控鸡滑液囊支原体病能够通过种蛋进行垂直传播，也能在鸡群中进行直接或间接水平传播[23]，且环境中该病时刻存在，在气候变化或饲养管理不当时，发病率会上升，因此，在做好种源净化的同时，加强饲养管理也很重要。5.1种鸡的净化要确实做好引种的检疫工作，从原种开始持续做好疾病净化工作。并采取有效措施（如药物浸泡法、温差法和熏蒸法）对种蛋进行处理，从而控制支原体的垂直传播。有条件的大型企业利用抗体检测结合PCR法做好鸡群检测工作，对于中小型种禽企业，可利用快速检测试剂盒检测，根据检测结果采取淘汰、免疫、药物处理等方法，培育出优质的种鸡群。5.2加强生物安全管理加强场区的生物安全建设，拥有合理场区布局及良好的隔离与防疫条件；制定合理的冲洗、消毒流程，严禁引进支原体阳性鸡群；实行严格的“全进全出”制管理，避免不同批次之间的交叉感染；加强疫情监控监测，注重场区的大小环境消毒，消灭病原，如在空舍期使用固体甲醛、戊二醛等的消毒，有鸟时可使用百毒杀或碘伏进行消毒；控制人员、车辆的出入，来访人员登记、衣服更换；控制老鼠、苍蝇、鸟等传播疾病；死鸡的无害化处理措施。5.3饲养管理加强饲养管理，重点搞好卫生消毒工作，运输车辆进入场内必须进行消毒，运动场和道路每周消毒1~2次，每周进行1~2次带鸡消毒。鸡滑液囊支原体发病程度通常与垫料管理不到位成正比，发病后垫料管理差的鸡场死淘会大幅增加。饲养过程中要加强垫料管理，防止垫料潮湿造成鸡舍内氨气浓度高诱发支原体病的发生。加强孵化环节的种蛋消毒、蛋箱清洗消毒、孵化机清洗消毒、岀雏机的清洗消毒，且每天要对发苗间进行清洗消毒，减少孵化环节的水平传播。5.4防疫接种国内对MS的研究起步较晚，对MS病只能通过药物预防，发病鸡群进行投药治疗，长期用药使得MS出现明显的耐药性，禽产品中有药物残留，因此探索新的MS防控措施势在必行[24］。MG灭活疫苗的使用为MS防控提供了参考，但目前仅在澳大利亚等少数国家使用商品化的MS疫苗，国内没有商品化的MS疫苗，为了有效防控MS，种禽场应做好MS的防疫工作，加强防疫，提高雏鸡的母源抗体水平，防控MS发生。5.5合理使用药物该病具有较差的治疗效果，但对于MS阳性鸡群，合理使用药物能够有效降低MS感染。当鸡群中发现软脚病鸡后要立即进行淘汰，并在饲料中添加敏感的药物用于预防该病的蔓延，常用的药物有四环素类、大环内酯类、泰妙菌素、林可大观霉素或相关中草药物等，连续使用3~5天（最好先做药敏试验，再根据试验结果合理使用药物）。对于开产后蛋鸡发生MS感染的，要使用符合国家相关规定的药物，在严格遵守国家休药期的基础上进行有效治疗。6小结与讨论鸡滑液囊支原体感染已经遍及全球，尤其近几年常呈爆发趋势，给养鸡生产带来严峻的考验。为了从源头控制MS的传播，就需要不断提升MS的诊断水平，加强种蛋种鸡引进时的监测，加强生物安全和饲养管理，促进我国养鸡业的健康发展。药物预防与治疗是防控MS感染的一个重要手段，但由于缺乏科学规范的使用方法，过分依赖和滥用药物，增加了MS耐药性的发生概率，加大了药物残留，同时严重危害人类公共卫生安全。从全球对MS的防控措施来看，无论从免疫途径、免疫保护力，还是从疫苗毒力、疫苗成本等方面考虑，研发更安全有效的MS疫苗迫在眉睫。后记：首先，要感谢我是论文指导老师赵良仓老师，赵老师知识渊博、认真负责，感谢赵老师在百忙中给予我论文的指导，谢谢！其次，感谢徐州生物工程学校段素从老师、颜成养鸡场、成宝养鸡场、德行养鸡场、堂立养鸡场、维传养鸡场全体人员给予我的帮助与支持。最后，感谢中国农大网络教育校外学习中心徐州生物工程学校网点171批次的同学们，感谢你们一直以来对我的帮助，友情无价，感谢两年的陪伴。特别感谢家人对我的支持和理解，你们是我坚强的后盾，你们是我拼搏的动力。参考文献[1]WHITHEARKG.Controlofavianmycoplasmosesbyvaccination[J].RevSciTech,1996,15(4):1527～1553.[2]HINZKH,BLOMEC,RYLLM.VirulenceofMycoplasmasynoviaestrainsinexperimentallyinfectedbroilerchickens[J].BerlMunchTierarztlWochenschr,2003,116(1/2):59～66.[3]DUSANICD,BERCICRL,CIZEIJI,etal.Mycoplasmasynoviaeinvadesnon-phagocyticchickencellsinvitro[J].VetMicrobiol,2009,138(1/2):114～119.[4]WALKERER,FRIEDMANMH,OLSONNO,etal.Anultra-structuralstudyofaviansynoviuminfectedwithanarthrotropicMy-coplasma,Mycoplasmasynoviae[J].VetPathol,1978,15(3):407～416.[5]LOCKABYSB,HOERRFJ,LAUERMANLH,etal.Factorsas-sociatedwithvirulenceofMycoplasmasynoviae[J].AvianDis,1999,43(2):251～261.[6]于圣青.滑液囊支原体的危害或将加大[J]，中国家禽,2013.35(17)：37.[7]DUFOUR-GESBERTF,DHEILLYA,MAROISC,etal.Epidemi-ologicalstudyonMycoplasmasynoviaeinfectioninlayers[J].VetMicrobiol,2006,114(1/2):148～154.[8]XAVIERJ,PASCALD,CRESPOE,etal.SeroprevalenceofSal-monellaandMycoplasmainfectioninbackyardchickensinthestateofEntreRiosinArgentina[J].PoultSci,2011,90(4):746～751.[9]李桂喜，闫爱萍，王珍珍.鸡滑液囊霉形体的流行病学调查及防治[J]，中国动物传染病学报,2013.21(5)：45～50.[10]宋战书.鸡滑液囊支原体发病情况调查及诊治[J].中国家禽.2009,31（12）：51～52.[11]潘树德，李学俭，曹冬伸，等.肉种鸡支原体感染流行病学调查及双黄连防治效果的研究[J].饲料工业，2014,35（21）：46～49.[12]易科振.鸡滑液囊支原体病的诊疗[J].畜牧兽医科技信息，2016（5）：113～114.[13]TEBYANIANH,MIRHOSSEINYSH,KHEIRKHAHB,etal.IsolationandIdentificationofMycoplasmasynoviaefromsuspectedostrichesbyPolymeraseChainRea