分子生物学前沿技术

激光捕获显微切割Lasercapturemicrodissection(LCM)

technology是在不破坏组织构造，保存要捕获的细胞和其四周组织

形态完整的前提下，干脆从冰冻或石蜡包埋组织切片中获得目标细

胞，通常用于从组织中精确地别离一个单一的细胞。

背景：机体组织包含有上白种不同的细胞，这些细胞各自与四周的细

胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发

育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用

于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生困难的分子变

更。在病理状态下，假如同一类型的细胞发生了一样的分子变更，那

么这种分子变更对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生

一样分子变更的细胞可能只占组织总体积的很小一局部；同时，探讨

的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组

织损害进展分子水平分析，别离出纯净的目标细胞就显得特别必要。

1996年，美国国立卫生院(NIH)国家肿瘤探讨所的［2］开发出激光

捕获显微切割技术(Lasercapturemicrodissection,LCM),次

年，美国ArcturusEngineering公司胜利研制激光捕获显微切割系

统，并实现商品化铛售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、精确

获得所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而胜利解决了组织中细

胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖方案〃的一

项支撑技术⑴。

原理：LCM的根本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜------

乙烯乙酸乙烯酯(ethylenevinylacetate,EVA)膜(其最大汲取峰

接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到

该膜上⑵。LCM系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光限

制装置、限制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及

彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm,覆在透亮

的塑料帽上，后者恰与后继试验所用的标准0.5ml离心管相匹配。

机械臂悬挂限制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目

标部位。显微镜直视下选择目标细胞，放肘激光脉冲，瞬间升温使

EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，

并在几毫秒内快速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘

合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5%.0

毫秒，并且可在整个塑料帽外表进展屡次重复，从而可以快速别离大

量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细

胞转移至离心管中，从而可以别离出感爱好的分子进展试验⑶。

EVA膜约100~200uni厚，能够汲取激光产生的绝大局部能量，在

瞬间将激光束照耀区域的温度提高到9003保持数毫秒后又快速冷

却，保证了生物大分子不受损害。采纳低能量红外激光的同时也可防

止损伤性光化学反响的发生。

优缺点：LCM最显著的优点在于其快速、精确和多用途的特性。结合

组织构造特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，

可以快速获得大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为根底的显微切

割技术相比⑷，具有以下优点：（1）别离细胞速度快，无需精致的操

作技能；（2）捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较

好地限制捕获细胞的特异性；（3）捕获细胞与塑料帽结合严密，削减

了组织损失的风险。相比而言，除了激光切割弹射微别离系统⑸以经

染色的用于存档的切片也可被胜利进展显微切割。

尽管LCM应用广泛，但对于常规染色、固定且不加盖玻片的组织

切片，其视觉辨别率受到很大限制。而对于那些本身缺乏肯定构造特

点的困难组织（如淋巴组织，广泛浸润的腺癌等），要精确别离出某

一类细胞几乎是不行能的。Fend等⑹通过采纳特别染色，尤其是免疫

组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了

上述难题。

应用LCM,间或会出现无法将选择的细胞从切片上移走的状况，

出现这种结果有两种缘由：（1）细胞与热塑膜之间的粘合力缺乏，通

常是由于组织未完全脱水或激光的能量设置过低造成的；（2）组织切

片与载玻片间的粘合力过强，通常发生在显微切割枯燥时间过长的冰

冻切片。针对不同样本组织（包括免疫组化染色的组织切片），一些

探讨小组分别详尽报道了采纳适合的处理方法，以到达最正确的显微

切割条件⑺。

应用：LCM较以往的显微切割技术有了突破性的进展，现已广泛应用

于肿瘤探讨，包括前列腺癌⑻、肾癌、肺癌、甲状腺癌⑼、食管癌、

胃癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、恶性胸膜间皮瘤、

淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM还胜利应用于其它一些疾病的探讨中，

如Crohn病口”肌萎缩性侧索硬化症⑪、子宫内膜异位症、获得性

免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。而应用LCM所别离的组织也

多种多样，包括单个细胞、单一细胞群（主要是癌巢）、血管等类型。

展望：LCM胜利解决了组织异质性问题，且具有快速、精确等诸多优

点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的探讨中，并显示出了良好

的应用前景⑴。但今后可能还须要以下几个主要方面的开展和完善：

理论上，除上述组织及细胞以外，LCD还可应用于其他全部组织细胞

（如脾脏巨噬细胞、肝脏Kuffer细胞等）的别离，但其各自的切片

制备、染色等技术方法尚须要进展探究；开发相应的应用程序，仅需

输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动限制LCD1⑵，

从而大大缩减所需的人力和时间；提高捕获单个细胞的精确度，以削

减非目标组织的沾染；进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改良

DNA和RNA抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核

酸。

变性高效液相色谱分析（denaturinghighperformanceliquid

chromatography,DHPLC）

原理：在局部变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保存时间

的差异，发觉DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不

同，在局部变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在

色谱柱中的保存时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表

现为双峰或多峰的洗脱曲线。

用离子对反向高效液相色谱法：⑴在不变性的温度条件下，检测并

别离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段，类似

RFLP分析，也可进展定量RT—PCR及微卫星不稳定性测定(MSI)；

⑵在充分变性温度条件下，可以区分单链DNA或RNA分子，适用于

寡核甘酸探针合成纯度分析和质量限制；⑶在局部变性的温度条件

下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同

源双链，同时也错配形成异源双链，依据柱子保存时间的不同将同源

双链和异源双链别离，从而识别变异型。依据这一原理，可进展基因

突变检测、单核甘酸多态性分析SNPs等方面的探讨。

优点：近年来建立并快速开展的DHPLC是一种新型基因突变筛查技

术，既能够自动化、高通量进展，且除PCR之外，勿需进展PCR引物

修饰、购置特别试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。而目前已

有的很多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性(single-strand

conformationpolymorphism,SSCP)、变性梯度凝胶电泳法

(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)等均不能满意

此要求。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较

高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的

SSCP、DGGE等方法相比,DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样

质量、提取方法等因素的影响，并且须要跑胶、电泳；DGGE那么须

要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比拟费时费劲。而DHPLC

那么高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只须要8分钟左右。

DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片

断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的缺乏之处，但是这可以利用

混合的方法(即将纯合突变样品和野生型样品混合)来解决。

多重连接探针扩增技术(multiplex1igation-dependentprobe

amplification,MLPA)于2002年由Schouten等首先报道，是近几

年开展起来的一种针对待检DNA序列进展定性和半定量分析的新技

术。该技术高效、特异，在一次反响中可以检测45个核甘酸序列拷

贝数的变更，目前已经应用于多个领域、多种疾病的探讨。

原理：MLPA的根本原理包括探针和靶序列DNA进展杂交，之后通过

连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳别离及数据收集，分析软件对

收集的数据进展分析最终得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标

记的寡核甘酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备;

每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反响中，

两个寡核甘酸片段都与靶序列进展杂交，之后运用连接酶连接两局部

探针。连接反响高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶

序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条

完整的核酸单链；反之，假如靶序列与探针序列不完全互补，即使只

有一个碱基的差异，就会导致杂交不完全，使连接反响无法进展°连

接反响完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增

产物的长度都是唯一的，范围在130〜480bp。最终，通过毛细管电

泳别离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反

响完成，才能进展随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，假如

检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰

便会缺失、降低或增加，因此，依据扩增峰的变更就可推断靶序列是

否有拷贝数的异样或点突变存在。

应用：

检测染色体亚端粒的基因重排智力低下是普及全世界的严峻危害

儿童身心安康的一类疾患，其中一局部是由可知缘由引起的，包括感

染、中毒、脑疾病等，但是很大一局部患儿的病因不明。近几年的探

讨发觉，包括亚端粒在内的基因重排是引起智力低下的重要缘由

[M,N],因为亚端粒的基因特别丰富，微小的变更就会累及众多的基

因，从而导致疾病的发生。目前，应用较多的检测染色体亚端粒的方

法包括染色体核型分析，荧光原位杂交（FISH）,但是前者不能检出

亚端粒微小的基因重排，而后者费时、费劲、又特别昂贵，不易推广。

MLPA-P036和MLPA-P070试剂盒，针对每一个染色体的末端都设计有

一个特异性探针，它经济、高效、快速，可以用于检测亚端粒的基因

重排[P,Q],提示局部智障患儿的发病缘由。

检测染色体的非整倍性变更[S,T]目前，检测染色体的非整倍性变

更的方法主要为染色体核型分析，但是它在检测羊水细胞、绒毛或是

其他胎儿细胞时，须要进展体外细胞培育，假设培育失败、细胞过少

或染色体形态较差时，经常影响试验结果。应用MLPA检测这类标本

时，不须要体外培育，少量标本即可进展检测，针对易发生非整倍性

变更的染色体（13,18,21,X,Y）上的几个热点基因设计特异性探

针，依据特定基因拷贝数的变更，即可确定染色体数目的异样。

检测单核甘酸的多态性（SNP）和点突变依据MLPA的原理可知，靶

序列DNA只要有一个碱基的变更，便可导致杂交不完全，使其扩增产

物缺失，因此，MLPA高度特异性的检测可用于多种SNP和点突变。

几种常见的儿童遗传性疾病的检测

1)智力低下综合征多种的智力低下综合征与染色体特定区域

的基因变更相关。这些患儿临床表现困难，个体差异大，缺乏特征性

表现，医生很难作出精确诊断。MLPA-P064试剂盒，针对特定的染色

体区域设计了43个探针，可以明确几种疾病的诊断[A],包括：Ip-

缺失综合征，Williams综合征，Sniith-Magenis综合征，

Miller-Dieker综合征,Digeorge综合征[W],Alagille综合征，Setos

综合征。依据同样的原理，MLPA-P096试剂盒可检测的疾病包括：

Wolf-Hirschhorn综合征，CriduChat综合征，WAGR综合征，Dcwns

综合征等。

2)X连锁型智力低下[C]X连锁型智力低下可以分为综合征型

和非综合征型，前者具备特征性的临床表现，而后者没有特异性病症,

智力低下经常为患儿的唯一表现。目前已经发觉19个基因与X连锁

型智力低下相关，MLPA-P106可以检测其中14个相关基因的变更。

3)假肥大型肌养分不良症[D,E,F]假肥大型肌养分不良症包括

Duchenne型肌养分不良(DMD)和Becker型肌养分不良，临床表现

主要为骨盆带肌和下肢近端肌肉无力，腓肠肌假性肥大等，致病基因

位于Xp21.2,包括70多个外显子。疾病的发生与DMD基因的缺失、

重复或点突变相关。MLPA-P034和MLPA-P035试剂盒设计了80多个

探针可以检测每一个外显子的缺失或重复突变，及局部点突变。

4)Prader-Willi综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)[H,I]

PWS和AS都是由染色体15qll-13缺失或同源二倍体所致。假如是父

源性染色体15qll-13缺失或母源性同源二倍体那么引起PWS,假如

是母源性染色体15ql-13缺失或父源性同源二倍体那么引起AS,在

人类，父源15qllT3区域存在非甲基化的SNRPN印迹基因，母源性

15qll-13区域存在完全甲基化的SNRPN印迹基因。甲基化特异性的

MLPA试剂盒ME028采纳半定量式的方式可以检测基因拷贝数的变更,

探针所识别的DNA序列包括甲基化敏感的核酸内切酶HhaI位点，因

此可以分析CpG岛的甲基化状态，从而区分PWS和ASo

5〕其他疾病的检测MLPA还可以用于成神经细胞瘤［J］、a-地中

海贫血［K］等疾病的诊断。成神经细胞瘤是儿童中枢神经系统发生的

肿瘤，明确特征性基因的变更对确认神经肿瘤发生的过渡阶段、治疗

和预后都有重要意义，为临床供应极大的帮助。

优缺点：MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术，具有以下优点1、高

效：一次反响可以校测45个靶序列拷贝数的变更。2、特异：可以检

测点突变。3、快速：一次试验可以在24小时内完成。4、简便：不

同的试剂盒操作根本一样，简单驾驭。

MLPA虽然具有很大优点，但也有其局限性1、须要精确测量3NA

的浓度，样本简单被污染。2、不能用于单个细胞的检测。3、MLPA

用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。4、不

能检测染色体的平衡易位。

单核甘酸多态性SNP

全称SingleNucleotidePolymorphisms,是指在基因组上单个核计

酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量

很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不

同的变异形式，但事实上发生的只有两种，即转换和颠换,二者之比为

2：1[1]oSNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T,

缘由是CG中的胞嚓咤常被甲基化,而后自发地脱氨成为胸腺喀咤。一

般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核甘酸变异。在人类基因组

中也许每1000个碱基就有一个SNP,人类基因组上的SNP总量也许

是3义10%个。因此,SNP成为第三代遗传园已，人体很多表型差异、

对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

作用和成果：SNP探讨是人类基因组方案走向应用的重要步骤。这主

要是因为SNP将供应一个强有力的工具，用于高危群体的发觉、疾病

相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的根底探讨等。SNP

在基因组中分布相当广泛，探讨说明在人类基因组中每300碱基对就

出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有时机发觉与各种疾病，包

括肿瘤相关的基因组突变；从试验操作来看，通过SNP发觉疾病相关

基因突变要比通过家系来得简单；有些SNP并不干脆导致疾病基因的

表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在根

底探讨中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在

人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。

单核昔酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),主要

是指在基因组水平上由单个核甘酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种。与全部多态性的9096以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1

个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单

个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱

基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种状况。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等

位多态性，但事实上，后两者特别少见，几乎可以忽视。因此，通常

所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(CT,在其互

补链上那么为GA),也可能是颠换(CA,GT,CG,AT)。转换的

发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3,

其它几种变异的发生几率相像。Wang等的探讨也证明白这一点。转

换的几率之所以高，可能是因为CpG二核甘酸上的胞喀咤残基是人类

基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱

去氨基而形成胸腺I密咤。

在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可

能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，

位于编码区内的SNP(codingSNP,cSNP)比拟少，因为在外显子内，

其变异率仅及四周序列的l/5o但它在遗传性疾病探讨中却具有重要

意义，因此cSNP的探讨更受关注。

从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是

同义cSNP(synonymouscSNP),即SNP所致的编码序列的变更并不影

响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义一

样；另一种是非同义cSNP(non-synonyniouscSNP),指碱基序列的变

更可使以其为蓝本翻译的蛋白