液相色谱常见故障及解决方案

液相色谱常见故障及解决方案液相色谱（HPLC）是分析检测领域的核心技术，但仪器运行中易因流动相、色谱柱、流路或检测器等环节的异常，导致压力波动、基线漂移、峰形畸变等故障。本文结合一线实操经验，梳理典型故障的诱因与解决方案，助力实验室人员高效排障。一、压力异常类故障（一）系统压力过高表现：泵压远超方法设定值，或触发压力上限报警。诱因：流动相污染：未过滤的缓冲盐、微生物滋生或盐类析出（如有机相比例突变导致盐结晶），堵塞流路。色谱柱堵塞：样品基质复杂（如蛋白、油脂）未预处理，或柱头污染、填料塌陷。流路堵塞：在线过滤器（吸滤头、柱前筛板）、管路弯折或接头密封圈碎屑堆积。泵部件磨损：单向阀密封不严、柱塞杆磨损，导致泵腔压力异常升高。解决方案：流动相：重新过滤（0.22μm滤膜），含缓冲盐的流动相现配现用；盐析出时，用5%~10%甲醇水溶液低流速冲洗流路。色谱柱：尝试反向冲洗（低流速，10%甲醇水，限允许反冲的色谱柱）；柱头污染可卸下筛板超声清洗（可拆卸型号），严重时更换色谱柱。流路维护：超声清洗吸滤头（5%硝酸或甲醇中），更换柱前在线过滤器；检查管路弯折，接头适度拧紧（避免损坏螺纹）。泵部件：拆下单向阀超声清洗（甲醇/水交替），磨损严重时更换柱塞杆、密封圈。（二）系统压力过低/波动表现：压力远低于正常范围，或压力曲线周期性波动。诱因：漏液：泵头、管路接头、进样阀、色谱柱两端等密封处漏液，导致压力无法建立。流动相不足：溶剂瓶液面过低，吸滤头进气形成气泡。泵故障：泵腔密封不良（密封圈老化）、单向阀失效，无法有效输送流动相。解决方案：漏液排查：逐一检查泵头、管路接头、进样阀转子密封、色谱柱接头，更换老化密封圈或PEEK接头。流动相补充：添加流动相至合适液面，超声脱气；若吸入空气，从泵出口单向阀抽液排气，或高流速（如5mL/min）排空气泡。泵维护：更换泵头密封圈，检查单向阀卡滞情况，必要时更换单向阀。二、基线异常类故障（一）基线漂移（单向持续偏移）表现：基线沿单一方向（如持续上升/下降）漂移，影响峰积分。诱因：流动相不稳定：含易挥发组分（如甲酸、氨水），或梯度洗脱时有机相比例波动；流动相被污染（杂质、微生物代谢物）。温度波动：柱温箱/环境温度不稳定，导致色谱柱保留行为及检测器响应波动。检测器问题：氘灯能量下降（超2000h）、检测池污染（样品残留/结晶）、流通池漏液。解决方案：流动相优化：更换新鲜流动相，梯度洗脱时确保有机相/水相混合均匀；含挥发性缓冲盐的流动相现配现用。温度控制：校准柱温箱实际温度，实验室加装空调减少环境波动。检测器维护：更换氘灯，用10%硝酸+水+甲醇混合液冲洗检测池，严重时拆洗；检查流通池密封圈。（二）基线噪声大（高频波动）表现：基线呈不规则高频波动，信噪比降低。诱因：流动相含气泡：脱气不充分，气泡进入检测池产生光散射。检测器污染：检测池内壁残留样品或颗粒物。电源干扰：检测器接地不良，或附近大功率设备（如离心机）产生电磁干扰。泵脉冲：泵流速不稳定（单向阀磨损、泵头有气泡），导致流动相流速波动。解决方案：气泡排除：流动相超声脱气（≥15min），开启在线脱气；泵腔进气时，从泵出口抽液排气或高流速排空。检测池清洗：用10%硝酸水溶液低流速冲洗，必要时拆洗（保护光学窗口）。电源优化：检查检测器接地，远离大功率设备，或加装电源滤波器。泵维护：参考“压力波动”部分，更换单向阀、密封圈。三、峰形异常类故障（一）峰拖尾表现：色谱峰前沿陡峭、后沿拖长，理论塔板数降低。诱因：色谱柱问题：柱头污染、固定相硅羟基未封端（碱性样品易拖尾）、柱效下降。流动相不匹配：pH与样品pKa不匹配（酸性样品用中性流动相易吸附）、缓冲盐浓度不足。进样问题：进样体积过大（超柱容量）、进样溶剂与流动相不互溶（如纯甲醇进样到水相流动相）。解决方案：色谱柱处理：反向冲洗柱头（低流速，10%甲醇水），或用封端柱分析碱性样品；柱效严重下降时更换色谱柱。流动相调整：调节pH（酸性样品用pH=2~3流动相），提高缓冲盐浓度（如5mM增至20mM）。进样优化：减小进样体积（≤柱容量的10%），进样溶剂与流动相比例匹配。（二）峰分叉/双峰表现：单个色谱峰分裂为多个峰，分离度异常升高（非目标峰）。诱因：色谱柱污染/塌陷：柱头填料塌陷形成“死体积”，或柱内强保留杂质随样品洗脱。进样阀问题：转子密封磨损，样品残留于阀腔，下次进样时混合洗脱。样品问题：样品未完全溶解（悬浮颗粒导致二次进样）、含同分异构体（需确认是否为目标峰）。解决方案：色谱柱维护：反向冲洗色谱柱，若柱头塌陷，尝试更换筛板或柱头填料（仅限制备柱）；严重时更换色谱柱。进样阀维护：更换转子密封圈，进样后用强溶剂（纯甲醇）冲洗进样阀。样品处理：确保样品完全溶解（超声、过滤），若为同分异构体，优化分离条件（如调整流动相比例、柱温）。（三）峰展宽表现：色谱峰半高宽增大，分离度降低。诱因：柱效下降：色谱柱使用过久，填料粒径增大、孔隙堵塞，传质阻力增加。流速过低：泵流速低于方法要求，样品在柱内停留时间过长，扩散加剧。死体积过大：管路连接过长（如柱后管路≥50cm）、接头内径不匹配，导致样品扩散。解决方案：色谱柱更换：柱效无法恢复时（理论塔板数降至初始值70%以下），更换新柱。流速调整：按方法要求设置泵流速，确保流速稳定（检查压力曲线）。流路优化：缩短柱后管路（≤30cm），使用内径匹配的PEEK接头。四、保留时间异常类故障（一）保留时间延长表现：目标峰保留时间明显延长，分析效率降低。诱因：流动相比例变化：梯度洗脱时有机相比例偏低（如甲醇瓶溶剂不足）、手动混合流动相比例误差。流速降低：泵流速设置错误、泵部件磨损导致实际流速偏低。色谱柱/柱温问题：柱内污染保留能力增强，或柱温箱故障导致实际温度偏低。解决方案：流动相核查：重新配制流动相，梯度洗脱时标记溶剂液面；手动混合时精确量取。流速校准：用量筒+秒表校准泵流速，必要时更换泵密封圈、单向阀。色谱柱/柱温维护：冲洗色谱柱，校准柱温箱实际温度，必要时更换传感器。（二）保留时间缩短表现：目标峰保留时间提前，峰形可能展宽或拖尾。诱因：流动相比例变化：有机相比例偏高（混合器故障）、流动相溶剂挥发（敞口放置）。色谱柱问题：柱内填料流失（柱头筛板损坏）、固定相被强溶剂洗脱（如纯甲醇冲洗C18柱）。流速升高：泵流速设置错误、泵腔气泡导致流速波动（瞬时升高）。解决方案：流动相调整：更换新鲜流动相，检查混合器；流动相密封保存。色谱柱维护：检查柱头筛板，必要时更换；避免用强溶剂过度冲洗反相柱。流速校准：同“保留时间延长”部分，校准泵流速，排除泵腔气泡。五、漏液类故障（一）泵头漏液表现：泵头处液滴明显，压力无法稳定。诱因：柱塞杆密封圈老化、泵头单向阀漏液。解决方案：更换柱塞杆密封圈：按手册拆卸泵头，更换同型号密封圈（安装前用异丙醇润滑）。检查单向阀：拆下单向阀超声清洗，磨损严重时更换密封垫或单向阀。（二）管路接头漏液表现：管路与接头连接处液滴，压力波动。诱因：接头未拧紧、管路切割不平整、接头老化。解决方案：重新安装接头：用切管器垂直切割管路末端（确保平整），插入接头后适度拧紧（PEEK接头“手紧+1/4圈”，不锈钢接头适度用力）。更换接头：老化接头直接更换，避免反复使用。（三）进样阀漏液表现：进样阀转子与定子间漏液，峰面积重现性差。诱因：转子密封圈老化、定子污染。解决方案：更换转子密封圈：按手册拆卸进样阀，更换密封圈（清洁安装面）。清洗定子：用棉签蘸甲醇/水混合液清洁定子槽，必要时超声清洗（保护陶瓷表面）。六、进样系统故障（一）进样量不准确表现：峰面积RSD＞2%，或与进样量不成正比。诱因：进样针堵塞、进样阀泄漏、自动进样器故障（进样针偏移、活塞磨损）。解决方案：清洗进样针：用细钢丝疏通，或超声清洗（甲醇中）；样品过滤后再进样。进样阀维护：更换转子密封圈，参考“进样阀漏液”部分。自动进样器校准：调整进样针位置，更换注射器活塞；用标准品验证进样准确性。（二）进样后无峰/峰面积过小表现：检测器无信号，或峰面积远低于预期。诱因：进样阀未切换、样品未注入、检测器参数错误（波长设置、池漏液）。解决方案：检查进样阀状态：进样后确认阀切换至“Inject”（观察压力变化）。排查进样环节：疏通进样针、重新设置进样体积、检查进样针位置。验证检测器参数：重新设置检测波长（紫外预扫描样品），检查检测池漏液。七、检测器故障（一）紫外检测器信号异常表现：无信号、信号恒为0/最大值，或峰形倒峰。诱因：氘灯熄灭（超寿命）、检测池污染/漏液、信号极性错误。解决方案：更换氘灯：记录使用时间，到期后更换；灯电源故障联系工程师。清洗/更换检测池：用10%硝酸+水+甲醇混合液冲洗，严重时拆洗或更换。调整信号极性：默认设为“正”，若需检测倒峰（流动相吸收变化）可保留负极性。（二）荧光检测器灵敏度下降表现：峰面积明显减小，低浓度样品无法检出。诱因：氙灯能量下降（超1000h）、流通池污染、激发/发射波长偏移。解决方案：更换氙灯：按手册更换，用标准品（奎宁硫酸盐水溶液）验证灵敏度。清