2-2025版5 · 3B版 新高考版 讲解册

第5部分生物技术与工程专题22基因工程

生物学新高考、新教材适用体系透视重难透析题型透析考点1重组DNA技术的基本工具考点2基因工程的基本操作程序及应用 考点3蛋白质工程题型

核酸序列的阅读及引物、限制酶的选择（热考点）考点1

重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)来源主要是原核生物作用具体作用识别并切割双链DNA分子的特定核苷酸序列作用化学键磷酸二酯键作用结果限制酶切割DNA分子产生的末端通常有两种形式(如图所示):

“分子缝合针”——DNA连接酶作用将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键分类E.coliDNA连接酶来自大肠杆菌,只能连接具有互补黏性末端的DNA片段T4DNA连接酶来自T4噬菌体,连接互补的黏性末端和平末端,但连接平末端的效率相对较低“分子运输车”——基因载体作用将目的基因导入受体细胞种类质粒(最常用)定义裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子结构特点具有复制原点(在细胞中能够自我复制)、标记基因(便于重组DNA分子的筛选)、一个至多个限制酶切割位点(供目的基因插入)其他载体噬菌体、动植物病毒等知识拓展

基因工程中的同尾酶同尾酶是指识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同黏性末端的限制酶,

如图:

由同尾酶产生的黏性末端,能够通过碱基互补配对彼此连接,可用于基因表达载体的

构建。易混易错

DNA连接酶和DNA聚合酶的异同类型DNA连接酶DNA聚合酶作用化学键磷酸二酯键参与过程基因表达载体的构建PCR、DNA复制作用时是否需要模板不需要模板需要模板作用时是否需要引物不需要引物需要引物作用机理连接两个DNA片段将单个脱氧核苷酸加到已有的

核酸片段的3'端考点2基因工程的基本操作程序及应用一、DNA的粗提取、PCR、电泳鉴定1.DNA的粗提取及鉴定实验原理粗提取(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以

初步分离DNA与蛋白质;(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L

的NaCl溶液鉴定DNA+二苯胺试剂

蓝色实验步骤

注意事项(1)过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸,可能会把DNA分子

吸附在滤纸上。(2)低温操作能防止DNA酶降解DNA。(3)粗提取的DNA中可能含有核蛋白、多糖等杂质2.PCR(聚合酶链式反应)原理DNA半保留复制和DNA的热变性PCR的条件模板目的基因(所在)的双链片段原料四种游离的脱氧核苷酸(dNTP)引物一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单

链DNA片段(一般需要选择2种引物分别扩增两条模板链)酶耐高温的DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)缓冲液需含有Mg2+,以激活DNA聚合酶PCR的步骤和结果

小表达

(选必3P77改编)PCR技术操作中为什么需要用2种不同的引物?DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成,PCR扩增时只能从各自模板链

的3'端开始,故需碱基序列不同的2种引物。电泳的定义DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负

电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移

动检测原理在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等

有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检

测出来3.琼脂糖凝胶电泳电泳结果及初步分析电泳结果示意图(常规结果)

电泳结果及初步分析结果初步分析根据条带位置判断DNA分子大小(1)泳道1为Marker,由一些分子大小已知的DNA片段组成,可以作为电泳

结果中的参考系,以反映出待测片段的分子大小。如泳道4中的DNA片段介于3000bp到5000bp之间。(2)当DNA构象相同、电泳条件基本一致时,相对分子质量大的DNA分子迁移速率较小,相对分子质量小的DNA分子迁移速率较大,故泳道3的片段①的相对分子质量>片段②的相对分子质量根据电泳条带判断限制酶酶切位点数量泳道2和泳道3为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果。泳道2只有1条条带,说明质粒只含1个相应限制酶切割位点。泳道3含2条条带,说明质粒含2个相应限制酶切割位点。假设泳道2中DNA分子为4800bp,则泳道3中DNA分子的大小分别为3000bp(片段①)和1800bp(片段②)二、基因工程的基本操作程序及应用1.目的基因的筛选与获取目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因(也可能是基因调控序列等)较为有效的筛选方法从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选目的基因的获取方法PCR、人工合成法、基因文库法等2.基因表达载体的构建(基因工程的核心步骤)构建目的(1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;(2)使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的组成

启动子的分类组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性诱导型启动子受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子特异型启动子具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子构建基因表达载体过程示意图

限制酶的选择

结合两图可知:最宜选用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。注:若用Ti质粒,目的基因必须插入T-DNA序列易混易错

启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

启动子终止子起始密码子终止密码子位置DNADNAmRNAmRNA作用RNA聚合酶识别和

结合的部位,驱动

基因的转录使转录停止翻译的起始信号

(编码氨基酸:甲硫

氨酸)翻译的结束信号

(一般不编码氨基

酸)知识拓展

(1)标记基因的常见类型及相应筛选方法标记基因常见类型筛选方法标记基因为抗生素的抗性基因基因表达载体上携带的抗生素抗性基因进入受体细胞并表达后,可以使受体细胞表现出对相应抗生素的抗性,在受体细胞的培养体系中加入致死浓度

的相应抗生素后,存活的便是转化成功的细胞标记基因为必需营养物质合成基因基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养,存活的便是转化成功的细胞标记基因为报告基因[如绿色荧光蛋白(GFP)基因]基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标记基因的重组质粒导入细胞后,若细胞可发出绿色荧光,则说明目的基因已成功导入(2)对空质粒的筛选——蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及lacZ基因。

lacZ基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该

载体上仅在lacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的基因插入lacZ基因,则lacZ基因

失去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后,未导入质粒的菌

株不能生长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转

入空质粒的大肠杆菌。受体细胞的种类及方法植物细胞花粉管通道法我国科学家独创。可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。也可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法农杆菌细胞内含Ti质粒。当农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中(T-DNA不会因目的基因的插入而

丧失转移功能),通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞动物细胞显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中微生物细胞Ca2+处理法先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中3.将目的基因导入受体细胞知识拓展

农杆菌转化法示意图

(1)两次重组①第一次重组:目的基因(①)与Ti质粒构建重组载体。②第二次重组:重组Ti质粒上的T-DNA插入染色体DNA。(2)两次导入①第一次导入:将重组Ti质粒导入经Ca2+处理的农杆菌细胞。②第二次导入:将T-DNA导入植物细胞染色体DNA上。

4.目的基因的检测与鉴定分子水平的检测检测目的基因是否导入受体细胞PCR操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已

经导入受体细胞DNA分子杂交操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组DNA进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊

的仪器就能够检测出来检测目的基因是否转录逆转录-PCR(RT-PCR)操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计目的基因特异性引物进行PCR核酸分子杂交操作方法:从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子,用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交分子水平的检测检测目的基因是否翻译抗原—抗体杂交操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测个体生物学水平的鉴定检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫

基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度5.基因工程的应用

考点3蛋白质工程简介设计基础以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础目的改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质改造方法由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成基本思路从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质应用速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等小表达

蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造?蛋白质一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;改造后的

基因可以遗传给下一代,而直接改造的蛋白质无法遗传。

题型核酸序列的阅读及引物、限制酶的选择(热考点)1.核酸序列的阅读DNA复制的方向性(1)DNA的一条单链具有两个末端,一端有一个游离的磷酸基团,

称作5‘端,另一端有一个羟基(—OH),称作3'端,DNA的两条单链

方向相反;(2)DNA复制时,引物与DNA单链的3‘端结合,子链延伸方向为5'→3'转录和翻译核酸序列的阅读

模板链的判断

转录的方向为启动子→终止子,转录沿模板链的3‘端到5’端进行,故模板链的3‘端与启动子相连,b链为模板链(2024全国甲,38,15分)(2023山东,25,10分)(2023江苏,22,12分)知识拓展

移码突变构建融合基因表达载体时易发生移码突变,如图P基因与编码FLAG的序列形成一

个融合基因:

编码链与mRNA中碱基排列顺序一致(只是mRNA中不含T只含U),起始密码子是

AUG,那么编码链核酸序列的阅读、分析就从ATG开始,三联体密码子阅读框架的改

变会造成翻译结果的改变。若会发生移码突变,应在两基因间插入一定数量的碱基

对,保持原基因编码的密码子顺序不变。引物的特点(1)是一段短单链核酸,且能与DNA母链的一段碱基互补配对;(2)引物的5‘端可以被修饰,而3’端需与DNA模板链严格互补配对,故不可被修饰。5‘端常见的修饰:加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等;(3)PCR过程中,引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对判断引物的方向(1)判断引物的3‘端、5’端:引物与DNA模板链的3‘端互补,方向相反;(2)DNA复制从引物的3'端继续向前进行;(3)由此可知,甲、乙、丙、丁四个引物的扩增方向如图1所示。2.引物的特点及选择根据扩增目的选择引物(1)若扩增目的基因序列,则应选择图1中的引物乙、丙;(2)若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点,应设计一个引物与目的基因外部序列(即质粒序列)碱基互补配对,另一个引物与目的基因内部序列碱基互补配对,如图2所示的引物1、2。

(2023浙江6月选考,19,2分)(2023山东,25,10分)(2022天津,15,10分)3.限制酶的选择(1)限制酶选择的原则:①限制酶不能破坏目的基因的完整结构,也不能破坏载体上的启动子、终止子、复制

原点等必要元件;②应使目的基因按照正确的转录方向插入载体的启动子和终止子之间;③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,尽量选用不同的限制酶切割目的基

因和质粒,即双酶切。(2)实例分析:图1质粒为载体,图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为转录模板链(MfeⅠ和EcoRⅠ为同尾酶,可切出相同的黏性末端)。

限制酶选择分析:图1质粒中含2个EcoRⅠ识别位点,选用EcoRⅠ会切去终止子,选用

BamHⅠ会破坏启动子,故可选用的限制酶有MfeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ;W基因以乙链为

转录模板链,RNA聚合酶从模板链的3'端开始转录,故W基因乙链的3'端与启动子相连,

5'端与终止子相连,为保证W基因与质粒正确连接,质粒的终止子一侧应选用与W基因

右侧相同的HindⅢ,故切割质粒可选的限制酶为MfeⅠ、HindⅢ。图2中选用MfeⅠ会

破坏W基因,故只能选择同尾酶EcoRⅠ,因此选用EcoRⅠ、HindⅢ切割图2中的

DNA。(2021辽宁,24,10分)典例

(2022天津,15,10分)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶

基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。

(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因,为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物

1和

4(以上两空可调换),并在引物的5‘(5’/3‘)端引入XhoⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含

XhoⅠ

(EcoRⅠ/HindⅢ/XhoⅠ)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效

筛选载体4。(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变

造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有卡那霉素