CN105925538B 杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用 （杭州奥泰生物技术股份有限公司）

(10)授权公告号CN105925538BGO1NGO1N33/577(2006.01)济技术开发区白杨街道银海街550号(72)发明人苏娟陈东高飞andCharacterizationofMonocAntibodiesSpecificfo.2016,第35卷(第1期),48-51页.(特殊普通合伙)33240杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用本发明涉及杂交瘤细胞株及其产生的抗合名为杂交瘤细胞株3G8.1,保藏编号为C20163抗合成大麻单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株或合成大麻单克隆抗体在制备检测合成大麻的胶加样区金刚烷胺鼠单抗21.一种抗合成大麻单克隆抗体在制备用于检测JWH-018和JWH-073试剂盒中的应用，上述抗合成大麻单克隆抗体由杂交瘤细胞株3G8.1或其传代细胞株分泌产生，该杂交瘤细胞株3G8.1保藏编号为CCTCCNo.C201635;在制备杂交瘤细胞株过程中采用的抗原是合成大2.一种抗合成大麻单克隆抗体在制备用于检测JWH-018和JWH-073胶体金免疫诊断试纸条中的应用，上述抗合成大麻单克隆抗体由杂交瘤细胞株3G8.1或其传代细胞株分泌产生，该杂交瘤细胞株3G8.1保藏编号为CCTCCNo.C201635;在制备杂交瘤细胞株过程中采用的抗原是合成大麻抗原JWH-018-BGG。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于检测阈值均能达到50ng/ml以下。3技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及抗合成大麻的杂交瘤细胞株及其制备方法和背景技术(Zohai),在吸食后会产生与大麻相若的兴奋反应。[0003]目前市面上主要有4种合成大麻成分：JWH-018、JWH-073、HU-210、CP47,497等共4[0004]JWH-018中文名称1-戊基-3-(1-萘甲酰基)吲哚，英文名称1-Pentyl--3-(1-naphthoyl)indole,分子式C24H23NO,分子量341.4455,CASRN209414-07-3的分子结构式如式(I)所示，大麻的结构如式(II)所示。[0006]JWH-018最初是由ClemsonUniversity的JohnW.Huffman合成的大麻同型物。JWH-018(类似于THC),可以使人兴奋，开心以及全身放松等效果。比起传统四氢大麻酚(THC),JWH-018在作用于CB1的同時,更能刺激CB2,因此不但能比四氢麻酚(THC)快速4倍起他草药混合作为焚香销往全球。[0007]JWH-073中文名称：1-丁基-3-(1-萘甲酰基)吲哚，英文名称：1-Butyl-3-(1-naphthoyl)indoleor(1-Butyl-1H-indol-3-yl)-1-naphthalenylmethanone分子式：C23H21NO,分子量：327.42,CASRN208987-48-8.所述JWH-073的分子结构式如式(III)所4是CB1的5倍)起到致幻作用。[0010]通过杂交瘤技术可以制备抗合成大麻抗原杂交瘤细胞株。通过此杂交瘤细胞株制备出的抗体可以用于制备胶体金免疫诊断试纸条，实现了在现场对吸毒人员快速检测的要发明内容[0011]本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种抗合成大麻的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗合成大麻的抗体，能够特异结合JHW-018和JWH-[0012]一种分泌抗合成大麻的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株3G8.1,已于2016年3月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,简称CCTCC),保藏编号为CCTCCNo.C201635;中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。[0013]本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法，用合成大麻抗原JWH-018-BGG注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，用JWH-018筛选从而获得所述杂交瘤细胞株。[0014]JWH-018本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对JWH-018进行化学修白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原。[0016]采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价[0017]本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测合成大麻的试纸条中的应用。[0018]本发明的第二个目的是提供了一种抗合成大麻单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株[0019]本发明的第三个目的是提供了所述抗合成大麻单克隆抗体在制备合成大麻检测试剂盒中的应用；或上述抗合成大麻单克隆抗体在制备检测合成大麻的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。[0020]进一步地，所述的用于检测合成大麻的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗合成大麻的单克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有合成大麻-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线5(C线)处包被有二抗。[0021]本发明的试纸条也是以竞争抑制原理制备的，合成大麻-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗合成大麻单克隆抗体对合成大麻的检测限为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有JWH-018或JWH-073且检测合成大麻的含量高于检测限；若C线和T和JWH-073;若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。[0023]本发明利用JWH-018-BGG免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗合成大麻的单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对JWH-018和JWH-073进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。[0025]图1为本发明一种合成大麻胶体金检测试纸条的结构示意图。具体实施方式[0026]下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。[0027]实施例1杂交瘤细胞株的制备[0029]选择8周龄的BALB/c雌鼠用JWH-018-BGG10μg与quickantibody-5w佐剂等体积混合成100μ1,注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后[0031]取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；淋巴细胞悬液离[0033](3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75%酒精中消毒10min,撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹得到饲养细胞悬液。[0034](3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10%的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。[0035](3-3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2:1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL37℃预温的1mLPEG1450,边加边轻微摇动；加入25ml37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min,取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃,5%CO₂培养箱中培养。[0036](4).杂交瘤细胞的融合筛选6[0038]步骤(3-3)中融合细胞在5%CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。[0039]间接ELISA方法的操作步骤是：[0040]①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲每孔中分别加入100μ1稀释后的抗原，4℃包被过夜，用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板3[0041]②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μ1稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板1次；[0042]③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μ1稀释后的羊抗鼠IgG-HRP,37℃反应30分钟后，用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板3次；[0043]④每孔加入50μ1底物TMB,37℃下反应8分钟；清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。[0046]竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：[0047]①将50μ1浓度为50ng/ml的JWH-018标准品加入酶标孔中，再加入阳性克隆培养上清液同时设计空白对照，即先加入50μlPBS缓冲液再加入50μ1阳性克隆培养上清液到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板1次；[0048]②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μ1稀释后的羊抗鼠IgG-HRP,37℃下孵育30分钟，用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板3次；[0049]③每孔加入50μ1底物TMB,3结果如表1所示。[0052]表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果细胞株竞争抑制OD值竞争抑制率7培养。[0055](4-3)杂交瘤细胞株3G8的克隆化[0056]杂交瘤细胞株3G8的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15%的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μ1接种到养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100%;然后挑取单克隆细胞，命名为3G8.1,扩大培养后进行抗合成大麻单克隆抗体纯化。[0057](5)抗合成大麻单克隆抗体纯化[0058]取扩大培养后的杂交瘤细胞株3G8.1,接种1×106细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取12ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，[0059]实施例2抗合成大麻单克隆抗体的反应活性测试[0060]采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗合成大麻单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释JWH-018-BGG抗原至50n在96孔酶标板中分别加入100μ1/每孔稀释后的抗原，4℃包被过夜；[0061]②用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μ1浓合成大麻单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05%tween20的PBS缓冲液洗板1次；[0062]③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μ1/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP,37℃反应30分钟，用含0.05%tween20的PBS缓450nm测定其OD值，以抗合成大麻的单克隆抗体溶液0D450值/阴性对照OD450值>2