CN107075523B 来自大麻的大麻环萜酚酸合酶 （加拿大国家研究委员会）

(10)授权公告号CN107075523B(65)同一申请的已公布的文献号(30)优先权数据62/018,1282014.06.27US(85)PCT国际申请进入国家阶段日(86)PCT国际申请的申请数据(87)PCT国际申请的公布数据WO2015/196275EN2(73)专利权人加拿大国家研究委员会(74)专利代理机构北京瑞恒信达知识产权代理事务所(普通合伙)11382代理人张伟丁磊A01H6/00(2018.01)(56)对比文件US2013267429A1,2013.1US2014057251A1,2014.02审查员王溯铭来自大麻的大麻环萜酚酸合酶本发明公开了来自大麻的核酸分子，其已经被分离和表征并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽。核酸的表达或过表达会改变大麻素化2i)所述分离的核酸分子的核苷酸序列编码如SEQIDNO:2或6所示的多肽并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽；ii)所述分离的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:1或5所示并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽；iii)所述分离的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:8或9所示并编码具有大麻环iv)所述分离的核酸分子的核苷酸序列是i)、ii)或iii)的补体。2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1或5中所示或为其密码子简并核苷酸序列，或前述中任何的补体。3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中，所述密码子简并核苷酸序列如SEQIDNO:8或9所示，或前述中任何的补体。4.一种具有大麻环萜酚酸合酶活性的分离的多肽，其中所述分离的多肽如SEQIDNO:2或6所示。5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸分子或者根据权利要求4所述的分离的多肽，其中，所述分离的核酸分子或所述分离的多肽与一个或多个异源部分耦合。6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述一个或多个异源部分为连接子、信号序列、可检测标记或如纯化标签的标签中的一种或多种。7.一种包含权利要求1-3中任一项定义的核酸分子的构建体或体外表达系统。8.一种重组微生物，其包含权利要求1-3、5或6中任一项所述的分离的核酸分子或者权利要求7所述的构建体，和/或表达权利要求4或5中任一项所述的分离的多肽。9.一种调节生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括：i)引入并表达权利要求1-3、5或6中任一项定义的核酸分子以使生物体、细胞或组织中的大麻环萜酚酸合酶基因沉默从而降低大麻素化合物的水平；或ii)在生物体、细胞或组织中引入并表达或过表达权利要求1-3、5或6中任一项定义的核酸分子或权利要求7的构建体以增加大麻素化合物的水平。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸分子包含在构建体中。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述微生物是酵母菌或大肠杆菌。13.根据权利要求8所述的微生物，其中所述微生物为酵母菌或大肠杆菌。14.根据权利要求9所述的方法，其中，在与编码大麻素生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种其它核酸的表达或过表达相组合的情况下，表达或过表达所述核酸分子。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述大麻素生物合成途径中的一种或多种酶是PT1中的一种或多种。16.根据权利要求9-12、14或15中任一项所述的方法，其中，被调节的大麻素中的一种或多种是具有甲基或丙基侧链的。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述大麻素是大麻萜酚酸、大麻萜酚、△⁹-四氢大3物的具有甲基或丙基侧链的变体。18.一种组合物，所述组合物包含(a)根据权利要求1-3、5或6中任一项所述的分离的核酸；和/或(b)根据权利要求4或5中任一项所述的分离的多肽，根据权利要求7所述的构建体；根据权利要求8或13所述的微生物。4来自大麻的大麻环萜酚酸合酶[0001]相关申请[0002]这是一项专利合作条约申请，其在于2014年6月27日提交的美国临时专利申请No.62/018,128的基础上要求35U.S.C.§119的权益，该申请以引用的方式全文并入本文。发明领域[0003]本发明涉及来自大麻的大麻环萜酚酸合酶(CBCAS),编码基于酶CBCAS的试剂的核苷酸序列，和用于生产大麻素和/或改变大麻素生产的方法。[0004]发明背景[0005]大麻(CannabissativaL.;cannabis,hemp,marijuana)是一种最古老且用途最广的种植植物，现今发现它可用作药品、食品、化妆品和工业产品的来源。大麻还因含有作用于精神的大麻素(如△⁹-四氢大麻酚，THC)而用作非法毒品而闻名。目前正在探索作用于哺乳动物大麻素受体的源自植物的大麻素和其它药物作为药品和/或用于不同病症的治[0006]已知来自大麻的超过80种大麻素(Elsohly和Slade,2005)。主要的酸性大麻素是△⁹-四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻环萜酚酸(CBCA)。加热或长期储存会导致酸性大麻素的脱羧(如THCA形成THC、CBDA形成大麻二酚(CBD)和CBCA形成大麻环萜酚[0007]在分子和酶水平上越来越多地了解大麻素生物合成途径。第一酶是己酰辅酶A合成酶(Stout等，2013)。将己酰辅酶A(CoA)用作涉及两种酶(丁烯酮(tetraketide)合酶和戊基二羟基苯酸(olivetolicacid)环化酶)的反应的底物，这两种酶一起起作用以合成戊基二羟基苯酸(Gagne等，2012)。通过芳香族异戊烯基转移酶将戊基二羟基苯酸香叶基化(geranylated)以形成大麻萜酚酸(CBGA)(Fellermeier和Zenk,1998),其是通过氧化环化[0008]在vanBakel等(2011)中报道了大麻(Cannabisstativa)的基因组序列。然而没有鉴定CBCA合酶的序列。[0009]遗传证据表明，尽管THCA合酶和CBDA合酶在相同的基因座上可以是等位的，但是[0011]大麻素是珍贵的源自植物的天然产物。编码大麻素生物合成酶的基因可用于含有超低水平THC和其它大麻素的大麻种类的代谢工程中。这些基因还可证明可用于产生特定大麻种类，用于生产基于大麻素的药物，用于生产催化大麻素形成步骤的酶，或用于在其它生物体如细菌或酵母菌中重建大麻素生物合成。5发明内容[0012]一方面，提供一种分离的和/或纯化的核酸分子，所述核酸分子包含：i)核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少、大于或约96%的序列同一性；ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5或8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽；iii)i)或ii)的补体；或者i)、ii)或iii)的大于、至少或约15个连续核苷酸的片段。[0013]此外，另一方面，提供引物和探针，所述引物和探针包含与SEQIDNO:1、5或8或9的片段具有至少、大于或约96%的序列同一性的核苷酸序列或其补体。[0014]另一方面是一种核酸分子，所述核酸分子编码与SEQIDNO:2或6具有至少、大于或约95%的序列同一性的多肽，可选地针对在除大麻之外的生物体中的表达进行了密码子[0015]在一个实施方案中，所述核酸分子包含具有SEQIDNO:1、5、8或9的序列的核苷酸[0016]另一方面，提供一种分离的和/或纯化的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:2或6具有至少、大于或约95%的序列同一性的氨基酸序列。[0017]另一方面，还提供一种本文描述的连接至异源信号序列或标签的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有的氨基酸序列与连接至异源信号序列或标签的SEQIDNO:2或6具有至少、大于或约95%的序列同一性。[0018]另一方面，还提供一种抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段特异性结合本文所述的SEQIDNO:2或6或者其片段中的氨基酸序列的表位。[0019]另一方面包括一种核酸分子，所述核酸分子包含：i)核苷酸序列或其补体，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性；或ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽；可操作地与适于在细胞或生物体中表达的异源核酸序列连接。[0020]还提供载体构建体，所述载体构建体包含：i)核苷酸序列或其补体，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性；或ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽；可操作地与适于在细胞或生物体中表达的异源核酸序列连接。[0021]另一方面包括一种包含核酸的细胞或生物体，所述核酸包含：与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性的核苷酸序列，或与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性的核苷酸序列并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽；和/或表达包含与SEQIDNO:2或6具有至少约95%的序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。[0022]再一方面包括一种组合物，所述组合物包含本文所述的分离的核酸、分离的多肽、[0023]再又一方面，提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括在生物体、细胞或组织中表达或过表达本发明的核酸分子或多肽。[0024]另一方面，提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括引入本发明的核酸分子或载体构建体或其片段，以使生物体、细胞或组织中的CBCAS沉默和/或低表达。6[0025]大麻环萜酚酸合酶和编码这种酶的核苷酸序列现已经被鉴定和表征。所述核苷酸序列可用于通过筛选或遗传工程产生过量或不足量产生大麻素化合物或其混合物的大麻植物。包含SEQIDNO:1和5的核苷酸序列的片段(如至少15个核苷酸长度)的引物和探针可用于鉴定大麻环萜酚酸合酶中的突变体或变体。这种大麻环萜酚酸合酶的核苷酸序列还可单独或与编码大麻素合成途径中其它酶的核酸分子组合表达，以在其它植物或在微生物(如酵母菌、细菌、真菌)或其它原核或真核生物体中工程化大麻素生物合成。此外，敲除大麻中该基因的表达可以用来阻断大麻素生物合成和由此降低大麻素的产量。[0026]根据以下的详细描述过程，进一步特征将得以阐释或变得显而易见。[0028]为了更清晰地理解本发明，结合附图将其实施方案以实施例的形式进行详细描[0029]图1示出一种在大麻中得到主要大麻素类型的建议途径。缩写：THCA合酶是△⁹-四[0030]图2示出纯的大麻素标准品和CBCAS反应产物的HPLC色谱图。A:CBGA标准品(保留反应产物表明重组酶产生CBCA(保留时间9.9分钟)。插图是这一反应产生的CBCA的紫外光[0031]图3示出了在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达的纯化重组CBCAS的SDS-纯化的CBCAS。上面的条带示出了EndoHf(70kDa),下面的条带示出了去糖基化的CBCAS[0032]图4示出了CBCAS活性的最佳条件。小图A显示了缓冲液和缓冲液pH对CBCA产量的具体实施方式[0033]本文描述了一种来自大麻的编码CBCA合酶(CBCAS)的多核苷酸及编码的多肽。描述了包括通过植物育种、诱变或遗传工程使用所述CBCAS的方法，以及用于制备重组细胞和重组生物体(比如，如具有增加的CBCA含量的大麻植物的重组植物)以及无细胞系统的方和/或降低大麻细胞或植物的CBCA生物合成和CBCA含量。一些实施方案描述了所述CBCA与编码其它酶的核酸组合在大麻素途径中的用途。合酶具有高度相似性的基因，从而鉴定了与THCA合酶具有96%的核苷酸相似性的基因。基于随后的生物化学表征，将所鉴定的基因命名为大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)。测的信号序列。[0036]CBCAS开放阅读框的相应氨基酸序列提供于SEQIDNO:2.SEQIDNO:2包含在氨基酸1-28处发现的预测的信号序列。SEQIDNO:6不包含该预测的信号序列。7[0037]一个实施方案提供一种分离的核酸，所述核酸编码由SEQIDNO:2或6或其片段编码的多肽。[0038]在一个实施方案中，使所述分离的或纯化的核酸缺失全部或部分编码信号序列的[0039]5'密码子ATG(和或另外的密码子，可选地1-50个另外的密码子，可选地27个另外的密码子)可被另一核酸序列替换，例如以引入编码5'异源部分的序列，所示5'异源部分例如标签或如α交配因子信号序列的信号序列。[0040]在一个实施方案中，使所述分离的或纯化的多肽缺失全部或部分信号序列，例如[0041]5'甲硫氨酸和/或5'端另外的氨基酸(例如，多达50个另外的氨基酸)可被如5'异源部分(例如标签或如α交配因子信号序列的信号序列)的另一氨基酸序列替换。[0042]其它信号序列可包括：例如来自黑曲霉(Aspergillusniger)的α-淀粉酶信号序列、来自泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的葡糖淀粉酶信号序列、来自智人的血清白蛋白信号序列、来自Kluyveromcyesmaxianus的菊糖酶信号序列、来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的转化酶信号序列、来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的杀伤蛋白信号序列或来自原鸡(Gallusgallus)的溶菌酶信号序列。[0043]CBCAS的信号序列还可通过添加精氨酸残基或用精氨酸残基替换氨基酸而突变。[0044]SEQIDNO:8和9提供分别针对大肠杆菌和酵母菌优化的密码子优化的核酸序列。因此，在一个实施方案中，该序列是密码子优化的序列。所述密码子优化的序列与SEQIDNO:1具有约78%和79%的序列同一性并其编码的SEQIDNO:2。在一个实施方案中，使所述优化的序列缺失全部或部分相应的预测的信号序列的核苷酸。在一个实施方案中，将信号序列用另一信号序列替换，或缺失并用甲硫氨酸起始密码子替换。[0045]一些实施方案涉及分离的或纯化的核酸分子，所述核酸分子与SEQIDNO:1、5、8和/或9具有至少或约78%、至少或约80%、至少或约81%、至少或约82%、至少或约83%、至少或约84%、至少或约85%、至少或约86%、至少或约87%、至少或约88%、至少或约89%、至少或约90%、至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%或者至少或约99%的序列同一性。在某些实施方案中，所述分离的或纯化的核酸分子是SEQIDNO:1、5、8或9的密码子简并序列。在一个实施方案中，所述核酸分子具有大麻环萜酚酸合酶活性。[0046]还考虑上述序列的片段，包括SEQIDNO:1、5、8和9和与其具有至少或约78%或更9或者与其具有至少或约78%或更多，例如约96%序列同一性的序列的至少和/或多达或约15个、至少和/或多达或约20个、至少和/或多达或约25个、至少和/或多达或约30个、至少和/或多达或约40个、至少和/或多达或约50个、至少和/或多达或约60个、至少和/或多达或约70个、至少和/或多达或约80个、至少和/或多达或约90个、至少和/或多达或约100个、至少和/或多达200个、至少或多达或约300个、至少或多达或约400个、至少或多达或约500个、至少或多达或约600个、至少或多达或约700个、至少或多达或约800个、至少或多达或约900个、至少或多达或约1000个、至少或多达或约1100个、至少或多达或约1200个、至少或多达或约1300个、至少或多达或约1400个或者至少或多达或约1500个连续核苷酸。例如，所述核8酸分子可以是从15个连续核苷酸直至15000个连续核苷酸或两者之间的任何范围或数目的核苷酸。[0047]还包括与上述公开的序列杂交的核酸分子。杂交条件可以是严格的，其中当与SEQIDNO:1或5中的核酸分子具有至少约96%或约97%的序列同一性时，杂交才会发生。所述严格的条件可以包括用于已知Southern杂交的那些条件，比如，例如，在具有50%甲酰胺、糖硫酸酯和20mg/mL变性的剪切鲑鱼精子DNA的溶液中于42℃下培养过夜，然后在约65℃下于0.1xSSC中洗涤杂交支持物。其它已知杂交条件是熟知的并描述于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdE[0048]本领域技术人员将理解，核酸序列的变化并不一定改变所编码多肽的氨基酸序列。本领域技术人员将理解，特定核酸序列中改变所编码多肽氨基酸序列的核苷酸种类的变化可导致基因的有效性减少或增加，并且在一些应用中(如反义、共抑制或RNAi),可采用部分序列。如测试经改变序列的有效性的方法一样，可以改变或缩短核苷酸序列的方法是本领域技术人员熟知的。在某些实施方案中，可以容易地测试有效性，例如，通过常规的气相色谱法。因此，所有所述核酸序列的这种改变都包括作为本发明公开的一部分。[0049]本领域技术人员将理解，上述核酸分子的长度取决于预期用途。例如，若预期用途是作为引物或探针，如用于PCR扩增或用于筛选文库，则核酸分子的长度将小于全长序列，例如，约15至约50个核苷酸的片段，可选地SEQIDNO:1、5、5、8或9的至少约19个核苷酸或其补体，可选地SEQIDNO:1、5、8或9的至少约25个核苷酸和/或其补体。在这些实施方案中，引物或探针可以与核酸序列的高度保守区基本相同或者可以与DNA序列的5'或3'端基本相同。在一些情况下，这些引物或探针在一些位点可使用通用碱基来满足“基本相同”但又在序列识别中提供灵活性。值得注意的是，合适的引物和探针杂交条件是本领域熟知的。[0050]在一个实施方案中，所述核酸分子可用作引物且例如该核酸分子包含SEQIDNO:3或4的序列。[0051]在一个实施方案中，所述核酸分子缀合至和/或包含异源部分，例如独特尾部、纯化标签或可检测标记。[0052]所述独特尾部可以是特异性核酸序列。[0053]核酸可以是例如末端标记的(5’或3')或在合成期间可随机引入标记。[0054]在另一实施方案中，还提供一种分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含：i)含有SEQIDNO:1、5、8或9的至少约15个核苷酸(如SEQIDN:1、5、8或5=9的片段)的核酸分子，或含有15个核苷酸并与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同一性的核酸；和ii)异源部分。在一个实施方案中，所述核酸分子编码包含酶活性的多肽。[0055]在一个实施方案中，所述异源部分是编码异源多肽的异源核酸且所述多核苷酸分子编码融合多肽。9[0056]一些实施方案涉及分离的或纯化的多肽，该分离或纯化的多肽与SEQIDNO:2或6所示的氨基酸序列具有至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同一性。[0057]还考虑SEQIDNO:2或6的片段。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:2或6的至少和/或多达约5个、至少和/或多达或约10个、至少和/或多达或约15个、至少和/或多达或约20个、至少和/或多达或约25个、至少和/或多达或约30个、至少和/或多达或约40个、至少和/或多达或约50个、至少和/或多达或约60个、至少和/或多达或约70个、至少和/或多达或约80个、至少和/或多达或约90个、至少和/或多达或约100个、至少和/或多达或约150个、至少和/或多达或约200个、至少和/或多达或约250个、至少和/或多达或约300个、至少和/或多达或约350个、至少和/或多达或约400个、至少和/或多达或约450个、至少和/或多达或约500个连续氨基酸。[0058]在一个实施方案中，所述片段与SEQIDNO:2或6所示的氨基酸序列具有至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同一性。[0059]在一个实施方案中，与大麻产生的CBCAS相比，分离的多肽是差异糖基化的、非糖基化的(例如缺乏N和/或0-连接的糖基化)和/或去糖基化的。例如，可以采用化学或酶方法，如用EndoHf或去糖基化酶混合物(mix)处理，使所述分离的多肽去糖基化。由于在酵母菌或其它表达系统中表达，分离的多肽是例如差异糖基化的。[0060]其它实施方案涉及分离的或纯化的复合多肽，所述分离或纯化的复合多肽包含：i)含有SEQIDNO:2或6的至少5个氨基酸残基且可选地与SEQIDNO:2或6所示的氨基酸序列具有至少、大于或约96%,至少、大于或约97%,至少、大于或约98%,或者至少、大于或约99%的同一性的多肽；和ii)异源部分。[0061]在一个实施方案中，所述异源部分是异源多肽且该复合多肽是融合多肽。例如该异源多肽可以是如α交配因子信号序列的信号序列。[0062]在一个实施方案中，融合多肽可选地包含将含有SEQIDNO:2或6的全部或部分的多肽与异源多肽连接的肽连接子。[0063]在一个实施方案中，异源部分是可检测标记或标签。[0064]优选地，可检测标记能够(直接或间接)产生可检测信号。例如，标记可以是不光(荧光团)或化学发光(生色团)化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，如碱性和硫氧还蛋白-标签。[0067]另一方面包含一种抗体，所述抗体特异性结合例如如SEQIDNO:2或6所示的或其片段，无论是从自然界取出(从血清中分离)还是合成(通过重组手段生产)的抗体或其不含，优选地至少约75%不含，和更优选地至少约90%不含与其天然相关或在合成后相关的其它组分。[0069]本发明的另一方面包括一种组合物，所述组合物包含本文所述的核酸、构建体、多其中该组合物包含抗体或其片段、合适的载体可以是如BSA的蛋白。[0070]在一个实施方案中，该组合物包含本文所述的分离的核酸、分离的构建体、分离的多肽、分离的抗体或其片段和/或分离的细胞，可选地与合适的载体、稀释剂或添加剂组合。[0071]在一个实施方案中，该组合物是例如本文所述重组细胞或重组生物体的纯化的提取物，例如包含增加水平的一种或多种大麻素和/或CBCAS的重组植物提取物。在一个实施面包括大麻素或包含根据本文所述的方法或系统生产的如CBCA或CBC的大麻素的组合物。[0072]在一个实施方案中，该纯化的提取物包含重组生物体培养物的培养物上清液，例[0073]另一方面还提供一种发酵系统，所述发酵系统包含重组生物体或细胞，例如重组酵母细胞。该系统可包含CBGA和/或其他底物以及一种或多种酶或表达大麻素合成途径中的一种或多种酶的细胞。[0074]一些实施方案涉及一种包含分离的或纯化的核酸分子的构建体或体外表达系统，所述分离的或纯化的核酸分子与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%或更多，可选地至少、大于或约96%的序列同一性，可选地包含异源部分。因此，此处提供一种用于制备包含这样的序列或其片段的构建体或体外表达系统的方法，用于将以有义或反义取向的序列或部分序列或其补体引入细胞。[0076]如本文所用，“构建体”是指人工产生的包含递送载体和目标多核苷酸的核酸，例如，包含本文所述的多核苷酸的载体。可将目标多核苷酸克隆至目标载体以产生构建体。[0077]在一个实施方案中，载体是表达载体。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒或修饰的病毒(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),只要该载体与所使用的宿主细胞是相容的。表达载体是“适合宿主细胞转化的”,这是指该表达载体包含应用的核酸分子和基于用于表达的宿主细胞选择的调节序列，该调节序列与该核酸分子可操作地连接。可操作地连接意指核酸以允许该核酸表达的方式连接到调节序列。[0078]在一些实施方案中，分离的和/或纯化的核酸分子、多核苷酸或包含这些分离的和/或纯化的核酸分子的载体、构建体或体外表达系统，可用于产生转基因或重组生物体或重组细胞(如可选地重组生物体的细胞),所述转基因或重组生物体或重组细胞产生具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽和/或具有大麻环萜酚酸合酶活性的调节水平的多肽。[0079]因此，一个实施方案涉及包含具有SEQIDNO:1和5的至少15个连续核苷酸和可选地与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性的核酸分子的重组生物体、该生物体的宿主细胞或生殖组织(如种子)和/或包含所述分离的和/或纯化的核酸分子的构建体。[0080]在一个实施方案中，该重组生物体、细胞和/或生殖组织表达一种多肽，所述多肽具有该多肽序列的至少和/或多达约150、约175、约200、约225或约250个氨基酸，和可选地与SEQIDNO:2或6具有至少约96%的序列同一性。[0081]当将编码多肽的目标核酸引入框内的载体时，重组表达载体还可以含有编码产生11融合多肽的异源多肽(如融合部分)的核酸序列。该异源多肽可提供重组蛋白的增加的表达；重组蛋白的增加的溶解性；和/或通过在亲和纯化中作为配体而在靶标重组蛋白的纯化中提供帮助。例如，可将蛋白水解切割位点加入靶标重组蛋白之间以允许在纯化融合多肽后从融合部分分离重组蛋白。典型的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至重组蛋白的pGEX(AmradCorp.,Melbourne,Australia)、pMal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)。[0082]优选地，所述重组生物体是重组植物、重组多细胞微生物或重组昆虫。优选的植物是大麻属，如大麻、印度大麻(CannabisindicaLam)和莠草大麻(CannabisruderalisJanisch),特别是大麻。优选的微生物是细菌(如大肠杆菌(Escherichiacoli))或酵母菌细胞微生物看作是生物体或包括宿主细胞的细胞。优选的昆虫是草地夜蛾(Spodoptera[0083]通过已知的植物转化方法例如农杆菌介导的转化、经由粒子轰击的转化、花粉管或原生质体转化，可产生包含CBCAS核苷酸序列的大麻植物。在这些方法学手段下，将目的基因引入靶标生物体的基因组中。例如，Feeney和Punja,2003中描述了组织培养和农杆菌介导的大麻(hemp)转化。[0084]可将重组表达载体引入宿主细胞以产生转化的宿主细胞。可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化，用核酸转化原核和/或真核细胞。例如，可通过常规技术(如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体、病毒介导的方法酸引入哺乳动物细胞。可在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)和其它实验教材中发现用于转化和转染细胞的合适的方法。[0085]合适的宿主细胞包括多种真核细胞和原核细胞。例如，本发明的核酸和蛋白可在植物细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。优选的植物细胞是大麻属，如大麻、印度大麻(CannabisindicaLam)和莠草大麻(CannabisruderalisJanisch),特别是大麻。优选的微生物是细菌(如大肠杆菌(Escherichiacoli))或酵母菌(如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))。优选的昆虫是草地夜蛾(Spodoptera[0086]因此，一个实施方案包括一种重组细胞，和在一个优选的实施方案中，该重组细胞是重组植物细胞。在另一优选的实施方案中，该重组细胞是重组酵母细胞。[0087]可在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEAcademicPress,SanDiego,CA(1991)中发现其它合适的宿主细胞。此外，本发明的蛋白可基于假单胞杆菌的表达系统，如荧光假单胞菌(美国专利申请公开号：US2005/0186666)。[0088]因此，本文还提供一种包含本发明的核酸分子或多核苷酸的重组细胞。在一个实施方案中，该核酸分子导致大麻环萜酚酸合酶的水平增加。[0089]本文所述重组生物体、细胞和生殖组织可以具有改变的大麻素化合物水平。参照图1,本领域技术人员可以理解，核酸分子的表达或过表达会导致大麻环萜酚酸合酶的表达或过表达，这可以导致大麻素化合物(如大麻环萜酚酸和大麻环萜酚)的产量增加。生物体、细胞或组织中的大麻环萜酚酸合酶的沉默将导致大麻环萜酚酸合酶的低表达，这可以导致酚或这些化合物的具有甲基或丙基侧链的变体的积累。生殖组织可包括包含该分离的核酸[0090]核酸分子的表达或过表达可以结合编码大麻素生物合成途径中一种或多种其它酶的一种或多种其它核酸的表达或过表达来完成。其它核酸的一些实例包括编码下述酶的核酸：己酰辅酶A合成酶、丁烯酮(tetraket[0091]与在相似或相同条件下生长的具有正常水平的酶的相同品种的对照相比，本发明的大麻环萜酚酸合酶的表达或过表达将使大麻素化合物的水平增加，例如约1%-约20%、约2%-约20%、约5%-约20%、约10%-约20%、约15%-约20%、约1%-约15%、约1%-约10%、约2%-约15%、约2%-约10%、约5%-约15%、或约10%-约15%(w/w)。[0092]因此，另一方面包括一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括采用本发明的核酸分子或其片段以使生物体、细胞或组织中的CBCAS沉默和/或低表达。[0093]在一个实施方案中，可在生产CBGA的细胞或生物体中，或在生产CBCA和/或CBC的细胞和生物体中改变和/或生产CBCA和CBC,通过制备表达CBCAS的重组细胞可使所述CBCA和/或CBC的产量增加。[0094]另一方面包括生产CBCA的体外方法，所述方法包括：在合适条件下，使CBGA与CBCAS在溶液中或固定状态下接触合适的时间以生产CBCA和/或CBC;和分离和/或纯化CBCA[0095]所述接触可以例如通过在一定条件下将CBGA与重组CBCAS在溶液中和/或固定状态下混合合适的时间从而将CBGA的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约100%转化为CBCA。[0097]可选地，体外分析在温度35℃至50℃下或在两者之间的(如约35℃至约50℃之间的任何0.1℃的增量)约任何温度下，可选地在约35℃、约40℃、约45℃或约50℃下实施。[0098]可将CBCAS固定在例如珠子或柱树脂上并用于例如体外系统中。[0099]CBCA的脱羧产物大麻环萜酚(CBC)对大麻的精神活性没有显著贡献，但在高浓度和生物学效应，包括镇痛(Davis和Hatoum,1983)和抗伤害(antinocieptin)(Maione等，Turner,1982)、抗菌(Elsohly和Turner,1982)和抗肿瘤(Ligresti等，2006)活性。方法包括：[0101]i)将载体引入生产CBGA的细胞或生物体中以生产重组细胞或重组生物体，所述载体包含含有SEQIDNO:1、5、8或9或其保留CBCAS活性的片段的核酸，可选地所述片段与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少或约78%或更多、可选地96%的序列同一性；[0102]ii)在允许所述核酸表达的条件下培养重组细胞和/或使重组生物体生长；和可选地[0104]重组细胞可以瞬时表达、诱导表达和/或稳定表达。[0105]在一个实施方案中，所述方法包括加热和/或储存CBCA以生产CBC。储存和/或加热CBCA增加脱羧为CBC。例如，已显示在>94℃的温度下发生THCA和CBDA的热脱羧(Veress等，1990)。因此，在一个实施方案中，将CBCA加热至至少约94℃,可选地加热至少或约20分钟、至少或约30分钟、至少或约40分钟、至少或约50分钟或者至少或约60分钟或更长。在另一实或约30分钟、至少或约40分钟、至少或约50分钟，或者至少或约60分钟或更长。在另一实施方案中，将CBCA加热至至少约120℃,可选地加热至少或约10分钟、至少或约15分钟、至少或另一实施方案中，所述温度是约94℃至约150℃之间的任何0.1℃的增量，和所述加热时间是约3分钟至约90分钟之间的任何1分钟的增量。[0106]在一个实施方案中，分离和/或纯化中性和酸性大麻素。在一个实施方案中，分离和/或纯化中性大麻素。在一个实施方案中，分离和/或纯化酸性大麻素。[0108]i)将载体引入生产CBGA的细胞或生物体中以生产重组细胞或重组生物体，所述载SEQIDNO:1、5、8或9具有至少约96%的同一性；[0109]ii)在允许所述核酸表达的条件下培养重组细胞和/或使重组生物体生长；[0112]在一个实施方案中，所述细胞是植物细胞。在一个实施方案中，所述植物细胞是大[0113]在大麻植物中，通过使用编码大麻素生物合成途径的酶的基因(如本发明的CBCA合酶基因)的育种和选择以及遗传工程，可以实现大麻素产量增加或大麻素的减少或去除。此外，可将得到大麻素的生物合成途径转移至细菌、酵母菌、真菌或其它异源生物体中，或通过体外生物催化来生产大麻素而无需大麻植物。[0114]在一个实施方案中，所述生物体是植物。在一个实施方案中，所述植物是大麻植[0115]核酸的分离和克隆是熟知的。类似地，分离的基因可以插入到载体中并通过常规技术转化至细胞中。核酸分子可转化至细胞和/或生物体中。如本领域已知，可以通过多种方法将基因、载体和构建体引入到细胞和/或生物体中，并且转化和组织培养技术的组合已经成功地整合成为用于产生重组细胞和/或生物体的有效策略。可用于本文中的这些方法已经在其它地方描述过(Potrykus,1991;Vasil,1994;Walden和Wingender,1995;Songstad等，1995),并为本领域人员所熟知。合适的载体为本领域技术人员所熟知并描述于一般技可以确定地知道，除了通过真空浸染(Bechtold等，1993)或伤口接种(Katavic等，1994)的农杆菌(Agrobacterium)介导的拟南芥转化，同样可以使用农杆菌Ti质粒介导的转化(如下胚轴(DeBlock等，1989)或子叶叶柄(Moloney等，1989)伤口浸染)、粒子轰击/基因枪法(Sanford等，1987;Nehra.等，1994;Becker等，1994)或聚乙二醇辅助的原生质体转化法[0116]在一个实施方案中，重组细胞或生物体是转基因细胞或转基因生物体。在一个实施方案中，重组细胞或生物体包含含有所述分离的多核苷酸的附加体。[0117]重组表达载体除包含本文公开的核酸分子或多核苷酸外，还包含用于插入的核酸分子的转录和翻译的调节序列。[0118]合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述的调节序列)。合适的调节序列的选择依赖于如下所述选择的宿主细胞，并且可以容易地由本领域普通技术人员完成。这种调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信限制性位点、增强子和赋予转录诱导能力的序列引入表达载体中。[0119]对本领域技术人员来说同样显而易见的是，如其它地方描述的(Meyer,1995;Datla等，1997),可以利用启动子来指导任何预期上调或下调的转基因表达，其中使用组成型启动子(如基于CaMV35S的那些启动子),或通过使用下述启动子：所述启动子可以使基因表达靶向至特定细胞、组织(如用于转基因在发育种子子叶中表达的napin启动子)、器官[0120]本文所使用的启动子可以是诱导型的、组成型的、或组织特异性的或具有这些特性的不同组合。有用的启动子包括但不限于组成型启动子，如香石竹蚀环病毒(CERV)、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、或更特别的是包含两个串联的CaMV35S启动子(被称为“双35S”启动子)的双重增强的花椰菜花叶病毒启动子。在一个实施方案中，启动子是在单子叶要使用组织特异性或发育调节启动子代替组成型启动子。组织特异性启动子允许在某些组织中过表达而不影响在其它组织中的表达。[0121]启动子和终止调节区在宿主细胞中有功能且对细胞和基因而言可以是异源的(即，非天然存在的)或同源的(源自植物宿主物种的)。上文描述了可用的合适的启动子。[0122]终止调节区可以源自获得启动子的基因的3'区，或源自另一基因。可用的合适终止区是本领域熟知的，包括根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合酶终止子(Tons)、根癌农杆菌甘露碱合酶终止子(Tmas)和CaMV35S终止子(T35S)。用于本文的特别优选的终止区包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基终止区(TrbcS)或Tnos终止区。这些基因构建体可以适用于通过经由农杆菌转化至宿主植物中并筛选改变的大麻素水平来针对活性进行筛选。[0123]本发明的重组表达构建体还可包含可选标记物基因，其有助于选择用本申请的重组分子转化或转染的宿主细胞。可选标记物基因的实例是编码蛋白的基因，所述蛋白如赋或免疫球蛋白或其部分(如免疫球蛋白可选地IgG的Fc部分)。可选标记物基因的转录通过可选标记物蛋白(如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或荧火虫荧光素酶)的浓度的改变监测。如果可选标记物基因编码赋予抗生素抗性(如新霉素抗性)的蛋白，则可以用G418选择转化体细胞。已经引入可选标记物基因的细胞将存活，而其它细胞死亡。这使得可以观察并分析本申请的重组表达构建体的表达，并且特别是测定突变对表达和表型的影响。应当理解，可将可选标记物引入与目标核酸的分离的载体上。[0124]核酸分子或其片段可用于阻断天然产生大麻素化合物的生物体中的大麻素生物合成。使用本文公开的核酸分子的沉默可通过本领域公知的多种方法完成，例如，RNA干扰术和靶点诱变技术。[0125]RNAi技术涉及用RNA干扰(RNAi)质粒构建体的稳定转化(Helliwell和Waterhouse,2005)。此类质粒包含待沉默的目的基因以反向重复结构的片段。反向重复片段通过通常为内含子的间隔子隔开。RNAi构建体通过合适的启动子驱动，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，所述RNAi构建体被整合到植物基因组中，随后转基因的转录使RNA分子自身折回形成双链发夹RNA。该双链RNA结构可被植物识别并切割成被称为小干扰RNA物继续指导目的基因的mRNA的降解。[0126]人工微小RNA(amiRNA)技术利用微小RNA(miRNA)途径，所述途径在植物和其它真默基因的约21个核苷酸长的片段被引入到pre-miRNA基因中形成pre-amiRNA构建体。pre-miRNA构建体利用本领域技术人员显而易见的转化方法转移到生物体基因组中。pre-amiRNA转录后，加工得到amiRNA,所述amiRNA靶向与该21个核苷酸的amiRNA序列共有核苷酸同一性的基因。[0127]在RNAi沉默技术中，有两个因素能影响片段长度的选择。片段越短越不易达到有效沉默，但过长的发夹会增加细菌宿主菌株中重组的机会。沉默的有效性也表现出了基因依赖性并能反映目标mRNA的可访问性或目标mRNA和基因被激活的细胞中的hpRNA的相对丰度。约100至约800bp、优选约300至约600bp的片段长度通常适于使得到的沉默效率最大化。另一个考虑是待靶向的基因部分。可以使用5'UTR、编码区和3'UTR片段，得到同样好的结果。由于沉默机制依赖于序列同源性，相关mRNA序列存在交叉沉默的可能性。这种交叉沉默是不可取的，因此应当选择与其它序列有低序列相似性的区域，如5'或3'UTR。避免同源交叉沉默出现的规则是使用这样的序列：所述序列在构建体与非目标基因序列之间不含超过约20个碱基的序列同一性的块(block)。许多这些同样的原则适用于设计amiRNA目标区域的选择。[0128]病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是一种变型的RNAi技术，它利用了植物的内源抗病毒防御性。用包含宿主DNA片段的重组VIGS病毒感染植物导致目标基因的转录后基因沉默。在一个实施方案中，可使用基于烟草脆裂病毒(TRV)的VIGS系统。[0129]反义技术涉及向植物中引入反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与由目的基因产生一序列被称为“有义”序列。mRNA的有义区段的活性被反义mRNA区段阻断，由此有效地灭活基因表达。导致植物中基因沉默的反义的应用更详细地描述于Stam等，2000。[0130]有义共抑制技术涉及向植物中引入高表达的有义转基因，其结果是降低转基因和内源基因的表达(Depicker等，1997)。效果取决于转基因与内源基因之间的序列同一性。[0131]靶向诱变技术，例如TILLING(靶向诱导基因组局部损伤技术)和使用快中子轰击涉及用诱变剂处理种质或单个细胞从而产生点突变，然后用灵敏的单核苷酸突变检测方法来发现目的基因中的点突变。检测所需的突变(例如，导致目的基因产物失活的突变)可以通过例如测序方法来完成。例如，可制备源自目的基因的寡核苷酸引物，PCR可用于从诱变种群中的生物体中扩增目的基因区域。可使扩增的突变基因与野生型基因退火，以发现突变基因与野生型基因之间的错配。检测到的差异可以追溯到含有该突变基因的生物体，由此揭示哪个诱变生物体具有所需的表达(例如，目的基因的沉默)。然后这些生物体可以被选择性繁殖以产生具有所需表达的群体。TILLING可以提供包含错义和敲除突变的等位基因系列，这表现为目的基因的表达降低。TILLING被看作是一种不涉及转基因引入、因此可更易被消费者接受的基因敲除可能方法。快中子轰击诱导生物体基因组的突变，即“缺失”,[0133]为了便于考察本发明的各实施方案，提供以下具体术语的解释：[0134]如本文所用，术语“约”将被本领域普通技术人员理解，并将根据其使用的上下文而在一定程度上变化。如果存在在其使用的给定上下文中本领域普通技术人员不清楚的术体可以来自重组来源和/或在转基因动物中产生。[0136]抗体结合片段：如本文所用，术语“抗体结合片段”旨在包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、规技术将抗体片段化。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab')₂片段。可处理得到的F(ab')₂片段以减少二硫桥从而产生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可导致Fab片段的形成。双特异性抗体片段和其它片段。[0137]抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更大的多特异性的。多特异性抗体可以免疫特异性结合大麻环萜酚酸合酶的不同表位和/或固定支持材料。[0139]可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体。可采用分离的天然或重组多肽制备抗体。参见，例如，Kohler等，(1975)Nature256:495-497;Kozbor等，(1985)J.Immunol.Methods,81:31-4Cole等，(1984)MolCellBiol.,62Protocols,HumanaPress,Totowa,N.J.,用于制备噬菌粒或B淋巴细胞免疫球蛋白文库以CN107075523B说明书14/28页识别抗体。[0140]密码子简并性：将被理解的是，本发明涵盖本领域普通技术人员可以理解的密码子简并用法，如表1所示。实施例8中提供了密码子优化的序列。表1-密码子简并性密码子起始终止[0143]保守性置换：此外，本领域技术人员理解，保守性置换可以发生在多肽的氨基酸序列中，而不破坏该多肽的结构或功能。技术人员通过将氨基酸置换为另一个具有相似疏水性、极性和R-链长度的氨基酸来完成保守性氨基酸置换。此外，通过比较来自不同物种的同源蛋白的比对序列，可以通过定位物种之间已突变的氨基酸残基且编码的蛋白质的基本功能没有改变来鉴定保守性氨基酸置换。表2提供了保守性置换的示例性列表。氨基酸类型可置换的氨基酸Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、脂肪族芳香族[0146]互补的核苷酸序列：序列的“互补的核苷酸序列”理解为表示其核苷酸与本发明的序列的核苷酸是互补的并且其取向是相反的(反向平行序列)的任何核酸分子。[0147]序列同源性程度或百分比：术语“序列同源性程度或百分比”是指最佳比对后两个序列之间的序列同一性程度或百分比。序列同一性百分比(或同一性程度)通过在比较窗口上比较两条最佳比对序列来测定，其中比较窗口中的肽或多核苷酸序列的部分与用于两条序列最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比可能含添加或缺失(如，间隔)。百分比如下计算：测定在两条序列中出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位点的数量从而得到配对位点的数量，将配对位点的数量除以比较窗口中位点的总数量，然后将结果乘以100,得到序列同一性百分比。[0148]融合分子：术语“融合分子”是指将源自具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽(SEQIDNO:2或6)的一个或多个胞外结构域的肽序列与融合配偶体连接，并且该连接可以是通过共价或非-共价连接(linkage)的直接或间接连接。该融合配偶体可与源自大麻环萜酚酸合酶的肽序列(SEQIDNO:2或6)的N-末端或C-末端连接。[0149]同源的分离和/或纯化的序列：“同源的分离和/或纯化的序列”理解为是指分离和/或纯化的序列，所述序列与核苷酸序列的碱基或多肽序列的氨基酸具有至少约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、约99.5%、约99.6%、或约99.7%的同一性百分比。该百分比为纯统计学的，并且可能在两条核苷酸序列之间随机或在其全长上分布差异。序列的同一性可以通过，例如，设计为执行单个和多重序列比对的计算机程序进行测定。将被理解的是，本发明涵盖本领域普通技术人员可以理解的密码子简并用法。[0150]此外，本领域技术人员理解，保守性置换可以发生在多肽的氨基酸序列中，而不破坏该多肽的结构或功能。技术人员通过将氨基酸置换为另一个具有相似疏水性、极性和R-链长度的氨基酸来完成保守性置换。此外，通过比较来自不同物种的同源蛋白的比对序列，可以通过定位物种之间已突变的氨基酸残基且编码的蛋白质的基本功能没有改变来鉴定保守性置换。但是没有导致增加、减少、调节或改变的修饰的相似品种生长的比较。在一些情况下，其可以为未经转化的对照、经假转化的对照、或经载体转化的对照。所用，术语“分离的核酸分子”是指当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料或培养基或者当通过化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的核酸。分离的核酸也基本上不含这样的序列，该序列天然位于该核酸所来源的核酸的两侧(即位于该核酸的5’和3'端的序列)。[0153]体外表达系统：如本文所用，术语“体外表达系统”理解为是指用于重组蛋白表达的试剂和组分(如在试剂盒中)和/或包含所述试剂和组分的溶液，其中所述体外表达系统不含细胞，且可选地包括全细胞的胜任翻译的提取物和/或可选地位于溶液中的其它翻译机制(machinery)试剂或组分，所述试剂和组分可选地包含RNA聚合酶、一种或多种调节蛋白因子、一种或多种转录因子、核糖体和tRNA,可选地补充有辅因子和核苷酸以及目标特异性基因模板。还包括基于化学品的表达系统，可选地采用非天然存在的氨基酸。[0154]在一个实施方案中，体外表达系统包含任选地具有5’T7启动子的载体，所述启动子下游引入分离的多核苷酸。[0155]多核苷酸或核酸分子：“多核苷酸或核酸分子”将理解为是指单体和二聚体(所谓串联)形式的双链或单链及其转录产物以及互补的核酸序列。多核苷酸和核酸分子包括由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括含有非-天然存在的单体或其部分的修饰或置换序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA),并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。该序列还可包含修饰的碱基。此类修饰的碱基的实例包含氮杂[0156]蛋白或多肽：“蛋白或多肽”理解为是指由核酸分子编码的氨基酸残基的序列。在本申请的上下文中，在一个实施方案中，本发明的多肽可以包括各种结构形式的一级蛋白。例如，本发明的多肽可以是酸性或碱性盐形式的或中性形式的。此外，可以通过氧化或还原修饰单个氨基酸残基。本发明的蛋白和多肽还可包括本文描述的与本发明的蛋白或多肽具有基本相同功能(如具有大麻环萜酚酸合酶活性)的蛋白和多肽的截短、类似物和同源物。[0157]序列同一性：当两条序列中的氨基酸或核苷酸残基的序列如下文所述进行最大匹配度比对时两者相同，则两条氨基酸或核苷酸序列被称为“同一的”。两个(或更多个)肽或多核苷酸之间的序列比较通常通过以下方式实施：在区段或“比较窗口”上比较两个最佳比对序列的序列以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和WatermanAd.App.Math2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman,Proc.Nat1.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性检索法、这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics[0158]上述给出的序列同一性的定义是本领域技术人员使用的定义。定义本身无需任何算法的帮助，所述算法只有在得到序列最佳比对时有帮助，而不是在序列同一性的计算中有帮助。[0159]从上述给出的定义，可以得出两个比较序列之间的序列同一性仅有一个准确定义且唯一的值，该值与最佳或最适比对序列得到的值相对应。500个连续残基的核酸或氨基酸序列，例如包含SEQIDNO:1的多达约3个、约5个、约10个、[0161]严格杂交：在严格条件下与核苷酸序列杂交理解为表示在选择的温度和离子强度的条件下杂交，所述条件使得它们允许在两个互补的核酸分子片段之间维持杂交。从其他生物体(例如，植物)获得的本文所述CBCAS的同系物可通过筛选包括所述同系物的合适文库获得，其中所述筛选采用本文公开的特定CBCAS基因的核苷酸序列或其部分或探针进行，可能技术将核酸(如构建体)引入细胞。[0163]当单链核酸分子基于鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)碱基配对和腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基配对的能力，能与其它的核酸分子的全部或部分碱基配对(杂交)以形成双螺旋(双链核酸分子)时，该单链核酸分子与另[0164]在对本发明范围的理解中，如本文所用，术语“包含”及其衍生词旨在为开放式术是指所修饰术语的使得最终结果不会显著改变的合理偏差量。如果这种偏差并不会否定程度术语所修饰的词的含义，这些程度术语应视为包括所修饰术语至少±10%的偏差。[0165]在对本发明范围的理解中，如本文所用，术语“由…组成”及其衍生词旨在为封闭[0166]本文中通过端点表述的数值范围包括在该范围内包含的所有数字和分数(例如，另有明确规定。[0167]此外，在特定部分中描述的定义和实施方案旨在适用于它们适合的本文中描述的其它实施方案，如本领域技术人员将理解的。例如，在下面的段落中，将更详细地限定本发明的不同方面。这样限定的每个方面可以与任何其它一个或多个方面组合，除非有明确的相反指示。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。以上公开内容概括地描述了本申请。更完整的理解可以通过参考下列具体实例获得。这些实例仅仅描述为用于说明的目的，而不是意在限制本申请的范围。形式变化和等同物替代被认为是可能建议或提出权宜之计的情况。尽管本文中已使用了特定术语，但是这些术语意在以描述性的意义存在，而不是为了限制目的。[0168]本文参考的所有公众可得到的文献，包括但不限于美国专利，以参考形式明确引入本文。[0169]以下非限制性实施例说明了本发明：[0171]实施例1:大麻基因组中CBCA合酶的鉴定相似性的基因。这导致了与THCA合酶具有96%核苷酸相似性的基因的鉴定。根据随后的生化表征，作者将该基因命名为大麻大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)。[0173]SEQIDNO:1提供了大麻大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)的cDNA序列-1635bp。下划线的序列涉及SEQIDNO:5中缺失的序列。SEQIDNO:1可包含全序列或缺失下划线序列中的3个重复和/或第一个ATG以维持编码框。CN107075523B说明书19/28页[0174]ATGAATTGCTCAACATTCTCCTTTTGGTTTGTTTGCAAACAAATTTCAATAGCTAATCCTCAAAATTCATATACACTCAACCTGATACAACCCCAAAACCACTCGTTATTGTCACTCCTTCAAATGTCTCCCATATCCAGGGAGCTACCCTTGGAGAAGTTTATTATTGGATCAATGAGATGAGACTACAGTACATGGTTACTTCTCTTCCATTTTTCTTGGTGGAGTGGATAGTCTAGTTGACTTGATACTGGGTTCGAAGTGTTTATAATTTCACA[0175]SEQIDNO:2提供了大麻大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)的开放阅读框的相应氨基酸[0176]MNCSTFSFWFVCKIIFFFLSFNIQISIANPQENFLKCFSEYIPNNPANPKFIYTQHNLRFTSDTTPKPLVIVTPSNVSHIQASILCSKKVGLQIRTRSGGHDAEGLSYISQVPFAIVDLRNMHTVKVDIEDLFWAIRGGGGENFGIIAACKIKLVVVPSKATIFSVKKNMEIHGLVKLFNKWQNIAYKYDKDLMLTNHGKNKTTVHGYFSSIFLGGVDSLVDLMNKSFPELGIKKTDCKELSWIDTTIFYSGVVNYNTANFKKEILLDRSAKTAFSIKLDYVKKLIPETAMVKILEKLYEEEVGVGMYVLYPYGGIMDEISESAIPFPHRAGIMYELWYNEKHINWVRSVYNFTTPYVSQNPRLAYLNYRDLDLGKTNPESPNNYTQARIWGEKYFGKNFNRLVKVKTKADPTCATGGTACCCCATGATGACGCGGTGGAAGA-3'(SEQIDNO:4)从大麻基因组DNA片段中扩增性酶切割并去磷酸化的IPICzaC(Invitrogen)。将完整CBCA合酶编码序列，包括天然N-末端分泌信号，用于毕赤酵母表达载体的构建中。[0179]该酶表达为N-末端融合产物，其中载体编码α-因子信号肽以确保从毕赤酵母细胞中的蛋白分泌。通过电穿孔将IPICzaC:CBCAS转化至巴斯德毕赤酵母菌株X33(Invitrogen)中。选择腐草霉素抗性菌落并在最少甲醇平板上划线，从中挑取单个菌落，并用于接种50mL×10-5%生物素、1%甘油),生长两天。使用近20mL该培养物接种400mL修饰的BMMY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、50mMHEPESpH7、1.34%酵母氮源基础、4×10⁻5%生物素、1%甲醇、0.0001%核黄素)至近似初始0D600为1。使该培养物在20℃下以90RPM振荡生长4天。每24小时加入甲醇至终浓度为1%。4天后，通过离心(13kg20分钟)将细胞从培养基中pH7的10mM磷酸钠平衡的羟基磷灰石筒(BioRadBio-ScaleMiniCHTType1,40μm介Äkta,AmershamBioscience[0180]实施例3:CBCAS分析[0181]通过将10μmolCBGA在500μ1澄清培养基中温育14小时来进行采用培养基的反应。用一滴4NHC1酸化并用400μL乙腈萃取两次。离心后，合并有机相并蒸发至干。将产物重悬于20μL的50%甲醇中，其中10μL用LCMS分析。使用采用二元溶剂系统(溶剂A:10%乙腈、0.05%甲酸；溶剂B:99.95%乙腈、0.05%甲酸)的WatersAllianceHPLC和AscnetisC185%A,在5%A保持2.5分钟，在2分钟内返回初始条件并在初始条件下平衡7分钟。使用在200-350nm下的光电二极管阵列检测获得紫外光谱。[0182]如图2所示，重组CBCAS催化由CBGA形成CBCA。如图3所示，在用内切糖苷酶(Endo时的活性，在40℃时观察到最大活性。[0184]本发明的基因编码来自大麻的CBCAS酶。这些基因可以通过重组植物的育种、靶向诱变或基因工程产生大麻素产量提高的大麻植物。此外，使大麻中的该基因失活或沉默可用于阻断大麻素生物合成，由此降低大麻植物(例如工业大麻)中大麻素如CBCA(CBC的前体)的产量。该基因可与编码大麻素途径中其它酶的基因联合用于其它植物或微生物中的大麻素生物合成的工程化。[0185]实施例4[0186]缺少预测的信号序列并包含起始密码子/起始甲硫氨酸的重组序列CN107075523B说明书21/28页[0189]SEQIDNO:6-破折号表示缺失的序列[0190]MNPQENFLKCFSEYIPNNPANPKFIYTQHDQLYMSVLQNLRFTSDTTPKPLVIVTPSNVSHIQASILCSKKVGLQIRTRSGGHDAEGLSYISQVPFAIVDL[0192]预测的N末端信号肽：[0193]MNCSTFSFWFVCKIIFFFLSFNIQISIA[0194]实施例5[0196]大肠杆菌优化的序列CN107075523B说明书22/28页TTTAACATTCAGATTAGTATTGCAAACCCGCAGGAGAACTTTCTCAAATGTTTTTATATCCCGAACAACCCGGCATGAGCGTATTGAACAGCACCATCCTCTGGTCATCGTTACGCCCTCGAATGTTTCACATATCCAAAAAGGTCGGCCTGCAGATTCGCACACGGTCGGGCGGCCAGGTCTGTCTTACATCTCACAAGTCCCAGTATATTACTGGATTAACGAAACCGTAGGTGTGGGCGGTCATTTTTCCGGAGGCGGTTATGGTGCGTTAAGGATCGCAAATCAATGGGTGAAGACCTCTTAAGCGACCATCTTTAGCGTGAAAAAAAAACAAATGGCAGAACATCGCTTACAAAGTAGTATCTTCCTGGGTGGAGTCGATTCCCT