CN109419786B 大麻二酚在制备抗流感的药物中的用途 （汉义生物科技（北京）有限公司）

(12)发明专利(10)授权公告号CN109419786B(65)同一申请的已公布的文献号(73)专利权人汉义生物科技(北京)有限公司地址100020北京市朝阳区呼家楼(京广中心)1号楼26层13室(74)专利代理机构中国贸促会专利商标事务所有限公司11038A61K31/05(2006.01)A61K36/185(2006.01)A61K45/06(2006.01)审查员刘琳大麻二酚在制备抗流感的药物中的用途本发明属于生物医药领域，涉及大麻二酚在制备抗流感的药物中的用途。具体地，本发明涉及选自如下的(1)一(3)中的任一项在制备治疗或预防流感的药物或者缓解流感症状的药物中的用途：(1)大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯；(2)含有大麻二酚的植物提取物；优选地，为含有大麻二酚的大麻提取物；优选地，为含有大麻二酚的工业大麻提取物；(3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料。大麻21.选自如下的(1)一(3)中的任一项在制备治疗或预防流感的药物或者缓解流感症状的药物中的用途：(1)大麻二酚或其药学上可接受的盐；(2)含有大麻二酚的植物提取物；(3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料；其中，所述流感由选自甲型流感病毒引起；并且所述甲型流感病毒为H1N1亚型或H5NI亚型的甲型流感病毒。2.根据权利要求1所述的用途，其中，第(2)项中，所述植物提取物为含有大麻二酚的大麻提取物。3.根据权利要求1所述的用途，其中，第(2)项中，所述植物提取物为含有大麻二酚的工业大麻提取物。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的用途，其中，所述流感的患病对象为哺乳动物或者禽类。6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述禽类为家禽或野生禽类。7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述家禽为鸡、鸭或鹅。8.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的用途，其中，所述流感症状为流感引起的选自如下症状中的至少一种：9.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的用途，其中，所述药物组合物还包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：肌苷单磷酸脱氢酶抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制其中，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林；所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔；所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺或盐酸金刚乙胺；所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米韦。10.选自如下的(1)一(3)中的任一项在制备抗流感病毒的药物中的用途：(1)大麻二酚或其药学上可接受的盐；(2)含有大麻二酚的植物提取物；(3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料；其中，所述流感病毒为甲型流感病毒；并且所述甲型流感病毒为H1N1亚型或H5NI亚型的甲型流感病毒。11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述抗流感病毒是指抑制流感病毒在宿主细胞3中的复制。12.根据权利要求10所述的用途，其中，第(2)项中，所述植物提取物为含有大麻二酚的大麻提取物。13.根据权利要求10所述的用途，其中，第(2)项中，所述植物提取物为含有大麻二酚的工业大麻提取物。14.根据权利要求10至13中任一权利要求所述的用途，其中，所述宿主细胞为哺乳动物的细胞或者禽类的细胞。16.根据权利要求14所述的用途，其中，所述禽类为家禽或野生禽类。17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述家禽为鸡、鸭或鹅。18.根据权利要求10至13中任一权利要求所述的用途，其中，所述药物组合物还包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：肌苷单磷酸脱氢酶抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制其中，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林；所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔；所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺或盐酸金刚乙胺；所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米韦。19.一种药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料，并且所述的药物组合物，其还包含有效量的神经氨酸酶抑制药；其中，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米韦。20.一种组合产品，其包含独立包装的产品1和产品2,其中，所述产品1选自如下的(1)一(3)中的任意一种：(1)大麻二酚或其药学上可接受的盐；(2)含有大麻二酚的植物提取物；和(3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料；所述产品2包含有效量的神经氨酸酶抑制药；其中，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米韦。21.根据权利要求20所述的组合产品，其中，第(2)项中，所述植物提取物为含有大麻二酚的大麻提取物。22.根据权利要求20所述的组合产品，其中，第(2)项中，所述植物提取物为含有大麻二酚的工业大麻提取物。4大麻二酚在制备抗流感的药物中的用途技术领域[0001]本发明属于生物医药领域，涉及大麻二酚在制备抗流感的药物中的用途。背景技术[0002]流行性感冒简称流感(Influenza),是由流感病毒(InfluenzaVirus)引起的一种人、禽、畜共患的急性呼吸道传染病，它因传播速度快、发病率高和严重并发症而成为严重威胁人类健康的疾病。[0003]流感病毒是经急性呼吸道传播的流感致病因子，属于正粘病毒科，单股负链RNA病毒。根据其核蛋白(Nucleoprotein,NP)和基质蛋白(Matrixprotein,M)抗原性的不同，可(InfluenzaAVirus,IAV)最为常见，对人类威胁最大，可引起流感季节性和地区性爆发。除感染人外，还可引起禽、猪、马等多种动物感染。[0004]IAV为单股负链8节段的RNA病毒，每个RNA片段均由核蛋白(Nucleoprotein,NP)包被形成核蛋白复合体(Ribonucleoprotein,RNPs)。IAV基因组至少编码13种蛋白质，分别为囊膜表面分布着3种蛋白3个亚基即Polymerase1(PB1)、Polymerase2(PB2)和PolymeraseA(PA)包被成RNPs.PB1以行使宿主RNA核酸内切酶功能，还可能具有蛋白酶水解活性。NP行使单链RNA结合蛋白的功能，并在RNPs中充当结构蛋白。[0005]在IAV基因组中，编码PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因在进化上具有高度的保守性，而IAV的抗原性极易发生变异。因此，根据其所携带的外膜蛋白血凝素抗原(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的不同，可将其分成若干亚型，目前已发现了16种HA亚型和10种NA亚型，它们不断变异，发生排列组合，实现自我进化，也不断带给人类新的威胁。[0006]其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。具有高致病性的H5NI、H7N9、H9N2等禽流感病毒，一旦变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。polymerase,RdRP)的作用进行复制和转录，进而翻译成具有感染性的病毒颗粒。如果该聚合酶失去活性，病毒便无法进行复制转录以生成完整的病毒颗粒。[0008]临床研究结果显示，IAV潜伏期一般为3至4天，最长可达7天。患者一般表现为发热、咳嗽、少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛、腹泻等全身症状。该病如不及时治疗，病情发展迅速，重症患者主要表现为重症急性肺损伤(Acutelunginjury,ALI),可引致严重的并发症，例如急性肺炎、支气管炎、充血性心力衰竭、肠胃炎、晕厥、出现幻觉等，严重者可导致死5亡。ALI是指严重感染后，出现以肺泡毛细血管损伤导致的肺水肿和微肺不张等病理特征。急性呼吸窘迫综合征(Acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是一种严重的ALI(Bernardetal.,1987),此外还能诱发全身的炎症反应综合征(Systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)。由于ARDS病死率高达40%-50%,这也是IAV致死的一个重要[0009]目前，经世界各国批准上市的抗流感病毒药主要有：肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制药利巴韦林(ribavirin)、干扰素诱导剂盐酸阿比朵尔(arbidolhydrochloride)、M2离phosphate)和扎那米韦(zanamivir)4大类6个品种(Glezen,2006;Kolocourisetal.,[0010]M2离子通道阻断剂，包括金刚烷胺和金刚乙胺，它们通过阻断M2离子通道蛋白来阻止病毒脱壳，使病毒RNA不能释放到细胞质中，病毒的早期复制被中断，从而起到抗流感病毒的作用。但金刚烷胺类药物对B型流感无效，现失眠、注意力分散和神经质等副作用，且金刚烷胺类药物在实验条件下和临床应用时易产生抗药性毒株。但目前大多数流感病毒株已经对这两个药物耐药，而且只有A型流感病毒才有M2离子通道蛋白，因而其临床使用并不广泛。[0011]NA抑制剂，目前上市的只有扎那米韦和奥塞米韦(Oseltamivir,达菲)两个药物，另外一个静脉注射剂型的帕拉米韦(peramivir)于2010年1月在日本获批。它们通过抑制NA活性，使感染细胞表面的唾液酸不能被切割，导致新生病毒不能从感染细胞表面释放，从而防止病毒进一步感染其它细胞。但即使应用达菲，H5N1型禽流感的病人也具有很高的死亡率，对达菲具有耐药性的病毒株也不断被分离到。目前流行的IAV已经出现了对于神经氨酸酶抑制剂的耐药性。此外，达菲可引起突发呼吸困难等严重不良反应，例如，日本非盈利机构“医药警戒中心”的一项研究发现，服用了达菲的119名死亡患者内出现重症状态或死亡。[0012]大麻二酚(Cannabidiol,CBD)是大麻素类物质中的一种，其结构式如下面的式I所[0015]大麻二酚提取于天然植物大麻，无精神效应，对焦虑、抑郁、惊厥和肿瘤等均具有治疗作用。有研究表明，CBD具有良好的抗炎效果。在2000年，《美国科学院学报》(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences)报道，英国伦敦肯尼迪风湿病研究所的M·费尔德曼博士等发现，口服和全身使用CBD都可明显降低关节损坏的严重性以及6发明内容[0017]本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，大麻二酚能够有效地抑制流感病毒以及流感病毒的RNA聚合酶，具有防治流感的潜力。由此提供了下述发明：[0018]本发明的一个方面涉及选自如下的(1)-(3)中的任一项在制备治疗或预防流感的药物或者缓解流感症状的药物中的用途：[0019](1)大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯；为含有大麻二酚的工业大麻提取物；[0021](3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料。[0022]在本发明的一个实施方案中，所述流感由选自甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙[0023]在本发明的一个实施方案中，所述流感的患病对象为哺乳动物(例如人、猿、猴、[0024]在本发明的一个实施方案中，所述流感症状为流感引起的选自如下症状中的至少一种：[0026]在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物还包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：[0027]肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制药；[0028]优选地，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林(ribavirin);[0029]优选地，所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔(arbidolhydrochloride);[0030]优选地，所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺(amantadinehydrochloride)或盐酸金刚乙胺(rimantadinehydrochloride);[0031]优选地，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦(osehamivirphospha米韦(Oseltamivir,达菲)、扎那米韦(zanamivir)或帕拉米韦(peramivir)。[0032]本发明的另一方面涉及选自如下的(1)一(3)中的任一项在制备抗流感病毒(例如抑制流感病毒在宿主细胞中的复制)的药物中的用途：[0033](1)大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯；为含有大麻二酚的工业大麻提取物；[0035](3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料。7[0036]在本发明的一个实施方案中，所述流感病毒选自甲型流感病毒、乙型流感病毒和[0037]在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物(例羊)的细胞或者禽类(例如家禽如鸡、鸭或鹅，或者野生禽类)的细胞。[0038]在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物还包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：[0039]肌苷单磷酸脱氢酶抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制药；[0040]优选地，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林；[0041]优选地，所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔；[0042]优选地，所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺或盐酸金刚乙胺；[0043]优选地，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米[0044]本发明的再一方面涉及选自如下的(1)一(3)中的任一项在制备抑制流感病毒RNA聚合酶的复制的药物、抑制流感病毒RNA聚合酶的表达水平的药物或者抑制流感病毒RNA聚合酶的活性的药物中的用途：[0045](1)大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯；为含有大麻二酚的工业大麻提取物；[0047](3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料。[0048]在本发明的一个实施方案中，所述流感病毒RNA聚合酶选自酶、乙型流感病毒RNA聚合酶和丙型流感病毒RNA聚合酶中的一种或多种；优选地，所述甲型流感病毒RNA聚合酶为H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、H5NI型流感病毒的RNA聚合酶。[0049]在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物还包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：[0050]肌苷单磷酸脱氢酶抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制药；[0051]优选地，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林；[0052]优选地，所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔；[0053]优选地，所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺或盐酸金刚乙胺；[0054]优选地，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米[0055]在本发明的一个实施方案中，所述抑制流感病毒RNA聚合酶的表达水平是指，例如流感病毒RNA聚合酶的蛋白水平或编码流感病毒RNA聚合酶的mRNA水平。[0056]在本发明的一个实施方案中，所述流感病毒RNA聚合酶的表达水平，可以通过流感8[0057]本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料，并且所述的药物组合物，其还包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：[0058]肌苷单磷酸脱氢酶抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制药；[0059]优选地，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林；[0060]优选地，所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔；[0061]优选地，所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺或盐酸金刚乙胺；[0062]优选地，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米韦。[0063]所述药物组合物的制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。[0065]优选的给予受试者的大麻二酚的剂量介于0.1-50mg/kg体重/天，更优选为0.5mg/kg-30mg/kg体重/天、0.5mg/kg-20mg/kg体重/天、5mg/kg-30mg/kg体5mg/kg-20mg/kg体重/天，进一步优选为0.5mg/kg-10mg/kg体重/天，特别优选为0.5mg/kg-5mg/kg体重/天。[0066]需要指出的是，活性成分大麻二酚的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。[0067]本发明的再一方面涉及一种组合产品，其包含独立包装的产品1和产品2,[0069]所述产品1选自如下的(1)一(3)中的任意一种：[0070](1)大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯；[0071](2)含有大麻二酚的植物提取物；优选地，为含为含有大麻二酚的工业大麻提取物；和[0072](3)药物组合物，其含有有效量的大麻二酚或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料；[0073]所述产品2包含有效量的选自如下的一种或者多种成分：肌苷单磷酸脱氢酶抑制药、干扰素诱导剂、M2离子通道蛋白抑制药和神经氨酸酶抑制药；[0074]优选地，所述肌苷单磷酸脱氢酶抑制药为利巴韦林；[0075]优选地，所述干扰素诱导剂为盐酸阿比朵尔；9[0076]优选地，所述M2离子通道蛋白抑制药为盐酸金刚烷胺或盐酸金刚乙胺；[0077]优选地，所述神经氨酸酶抑制药为磷酸奥司他韦、奥塞米韦、扎那米韦或帕拉米韦。[0078]本发明中，[0079]所述大麻二酚即式I化合物可通过商业途径购买(例如购自Sigma等)或者利用市售原料，通过现有技术合成。合成后可以通过柱色谱法、液液萃取法、分子蒸馏方法或结晶[0081]在本发明的一些实施方式中，大麻二酚的药学上可接受的盐可以为大麻二酚(CBD)与氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌、氢氧化钡、氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N′-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苯甲基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟基甲基)-氨基甲烷等形成的盐。[0082]在本发明的一些实施方式中，大麻二酚药学上可接受的酯可以为大麻二酚与一个C₀-C₆烷基羧酸形成的单酯，也可以为大麻二酚与两个相同或不同的C₀-C₆烷基羧酸形成的二酯，所述的C₀-C₆烷基羧酸可以是直链烷基羧酸、支链烷基羧酸或环烷基羧酸，例如HCOOH、CH₃CH₂(CH₃)₂CCOOH、环丙烷羧酸、环丁烷羧酸、环戊烷羧酸。[0083]所述的大麻提取物，可以是含有大麻二酚的大麻，尤其是工业大麻的提取物，例如乙醇提取液、浸膏等。其中，大麻二酚的含量并不特别限定，而且可以通过本领域技术人员知悉的手段例如浓缩等来进一步提高大麻提取物中大麻二酚的含量。在本发明的一个实施方案中，所述的大麻提取物，其为浸膏，优选地，其中大麻二酚的含量为18%—25%。根和花中的任意一种或者多种为原料得到的提取物。优选地，所述大麻提取物为大麻叶提取物。明所述疾病或病症的剂量。[0086]术语“受试者”可以指患者或者其它接受本[0087]术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。[0088]本发明中，如果没有特别说明，所述产品1、产品2仅仅是为了指代清楚，并不具有次序的含义。[0089]本发明中，如果没有特别说明，大麻优选为工业大麻；大麻提取物优选为工业大麻提取物。[0090]发明的有益效果[0091]大麻二酚能够有效地抑制流感病毒，具有制备或者作为治疗或预防流感的药物的附图说明±标准误差表示。每个点代表小鼠体重变化当天平均值，(n=20/组)。使用posthoc方法对±标准误差表示。每个点代表小鼠体重变化当天平均值，(n=15-2±标准误差表示(n=5/组)。使用posthoc方法对差异进行显著性分析，显著性差异以*表[0095]图4:WSN感染的小鼠死亡率的变化。小鼠感染WSN后，连续监测存活数12天平均值±标准误差表示。每个点代表小鼠存活数，(n=20/组)。使用posthoc方法对差异进行显著性分析。[0096]图5:WSN感染的小鼠肺指数的变化。取感染第8天的鼠，检测肺部感染情况。数据以[0097]图6:WSN感染的小鼠肺病理的变化。取感染第8天的鼠，检测肺病理分析情况。图[0098]图7:WSN感染的小鼠肺指数的变化。取感染第8天的鼠，检测肺部血管通透性检测。数据以平均值±标准误表示，*p<0.05;**p<0.01。[0099]图8:WSN感染的小鼠肺泡灌注液中中性粒细胞的变化。取DPI8天的鼠，检测肺泡灌注液中性粒细胞的数目。数据以平均值±标准误表示，***p<0.001。[0100]图9:WSN感染的小鼠肺泡灌注液中淋巴细胞的变化。取DPI8天的鼠，检测肺泡灌注液中淋巴细胞数目。数据以平均值±标准误表[0101]图10:WSN感染的小鼠肺泡灌注液中巨噬细胞的变化。取DPI8天的鼠，检测肺泡灌注液中巨噬细胞数目。数据以平均值±标准误表示，**p<0.01,***p<0.001。[0102]图11A:CBD处理的WSN感染的小鼠BMDM细胞中PA基因的表达变化。CBD处理的感染理的感染H1N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，NP基因的表达变化。数据以平均值理的感染H1N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，PA基因的表达变化。数据以平均值理的感染H1N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，PB1基因的表达变化。数据以平均值±标11理的感染H1N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，PB2基因的表达变化。数据以平均值±标[0108]图13:H5N1感染的小鼠体重变化。小鼠感染H5N1后，连续监测体重12天。数据以平均值(n=10/组)。[0109]图14:H5N1感染的小鼠体温变化。小鼠感染H5N1后，连续监测体温11天。数据以平均值±标准误差表示(n=10/组)。[0110]图15:H5N1感染的小鼠行为变化。小鼠感染IAV后，监测第9天行为。数据以平均值±标准误差表示(n=5/组)。使用posthoc方法对差异进行显著性分析，显著性差异以*表[0111]图16:H5N1感染的小鼠死亡率。理的感染H5N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，NP基因的表达变化。数据以平均值±标准[0113]图17B:CBD处理的H5N1感染的人肺上皮细胞系A理的感染H5N1的人肺上皮细胞系A54924理的感染H5N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，PB1基因的表达变化。数据以平均值±标[0115]图17D:CBD处理的H5N1感染的人肺上皮细胞系A549中PB2基因的表达变化。CBD处理的感染H5N1的人肺上皮细胞系A54924h之后，PB2基因的表达变化。数据以平均值±标具体实施方式[0116]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。2009(H5N1)毒株由中国科学院微生物研究所提供。[0119]涉及H1N1的实验均在生物安全二级实验室内进行，涉及H5N1的实验均在生物安全三级实验室内进行。[0120]实施例1:大麻二酚抗甲型流感病毒H1N1的动物实验[0121]1.实验动物和前期准备[0122]6周龄的昆明白雄鼠，购自北京维通利华实验技术有限公司。[0123]动物常规饲养于中国科学院微生物研究所P2和P3动物中心(Biosafetylevel2and3,P2/P3),光照周期为12小时光照/12小时黑暗，动物自由采食，自由饮水。动物适应新环境1天后进行相关实验。中国农业大学和农业生物技术国家重点实验室动物伦理委员会(SKLAB-2017-3-002)批准了动物实验。[0124]9-11日龄SPF鸡胚购于北京梅里亚维实验动物技术有限公司。[0128]用碘伏和70%乙醇将鸡蛋外壳进行消毒；在划线处2—3mm上方打孔，取PBS适度稀释的流感病毒200μl注入到鸡胚的尿囊腔；用蜡将所打小孔封口；[0129]将鸡蛋在37℃下培养48h-72h,每24h观察一次鸡胚存活情况，若观察到鸡胚死亡，将鸡胚置于4℃过夜后收集尿囊液，到72h时，将剩余鸡胚均置于4℃过夜后收集尿囊液。[0130]收集尿囊液方法：用无菌的镊子将鸡蛋气室上方的蛋壳敲碎，再撕开气室上方的尿囊膜，用1ml的移液器慢慢吸取尿囊液。[0131]将收获的尿囊液以2000-3000rpm离心10min,吸取上清，即可收获病毒。保存于-80℃备用。汇合度达到95%,使用上面鸡胚扩增的病毒的H1N1毒株感染并进行扩增，离心，收集上清，[0135]本发明人前期的6次预试验的结果表明，达菲组(20mg/kg/d)和两组CBD注射液组(20mg/kg/d和60mg/kg/d)能够显著地抑制IAV感染引起的小鼠的死亡率。H1N1(12000pfu)滴鼻染毒，能够引起95%的小鼠死亡，且两组CBD注射液组(20mg/kg/d和60mg/kg/d)抑制IAV感染引起的小鼠的死亡率相同。H5N1(1000pfu)滴鼻染毒，能够引起95%的小鼠死亡，且两组CBD注射液组(20mg/kg/d和60mg/kg/d)抑制IAV感染引起的小鼠的死亡率相同。昆明白雄鼠随机分为4组，每组20只小鼠，从感染第4天起[0137]空白组(野生型):不感染，第4天开始注射等量生理盐水。[0138]12000pfu流感组(高毒组):感染第4天开始注射等量生理盐水。[0141]感染操作步骤：以乙醚轻度麻醉小鼠后，以H1N1流感病毒液(前面保存于-80℃备用的病毒原液按照1:120稀释于PBS)滴鼻感染小鼠，0.05ml/只，空白组以等量生理盐水滴[0142](4)小鼠生理特征和发病症状的观察和记录[0143]记录不同时间的小鼠体重、温度、观察小鼠发病症状，记录小鼠死亡时间和死亡[0144]1)体重的测量：在电子称上放一个合适的烧杯，将读数归零，将小鼠放入其中，待读数稳定时记录。小鼠体重每24小时称一次。[0145]H1N1(WSN)感染小鼠当天(Dayofpostinfection,DPI0)至感染后10天(DPI10),每天进行称重，以当天体重减去DPI0体重，再除以DPI0体重，计算出体重变化百分[0146]2)体温的测量：H1N1引起的体温降低[0147]同时，另外设置8000pfu流感组，仅用于体温的测量。WSN以8000pfu剂量感染，监测体温的变化。感染小鼠每组5只，DPI0至DPI12,每天进行肛温测量，以当天肛温减去DPIO肛温，再除以DPIO肛温，计算出体温变化百分数，[0148]用正确的操作方法抓取小鼠，即使其腹部正对操作者，将电子体温计感应头蘸植物油，由小鼠肛门径直插入，待探测头刚好完全进入肛门时测量。小鼠体温每隔24小时测一[0149]3)定期录制各组视频(每组2分钟，n=6)。小鼠活动状况的量化参照下面的表1。[0150]表1RAPID行为动作分类法的行为动作操作说明[0152]在攻毒的第6天(DPI)和第8天(DPI)分别对小鼠的活动状况的进行了录像，检测和量化，小鼠行为的变化分为主动作和修饰动作(站立、坐，站起、行走、躺下、头转动、观望、闻、洗脸等),详细情况参见实验材料和方法部分。取有代表性的2分钟内的行为活动。[0153]4)存活率的计算[0154]每天观察并记录各组小鼠的存活个数。[0155]每组的存活率=每组存活的个体数(只)/每组总个体数(只)×100%,计算出每组小鼠每天的存活率之后进行汇总作图，分析其死亡趋势。[0156](5)小鼠肺指数和脾指数[0157]在感染DPI8时，每组各取5只小鼠进行肺指数和脾指数检测。在IAV感染第8天，将小鼠用戊巴比妥150-200μ1麻醉，测量小鼠体重，眼球取血，随后将小鼠固定于解剖板上，沿腹中线解剖小鼠，依次取下心、肺、肝、脾和淋巴结，其中取半肺测量肺重，脾测全重(测量时用吸水纸将肺、脾表面水分尽量除尽),随后固定于多聚甲醛中用于切片。[0158]肺指数与抑制率按以下公式计算：[0161](6)肺组织病理切片观察[0162]称量肺重量后，将肺组织浸于10%甲醛固定后再在浓度梯度的酒精中各浸泡2一4h中脱去组织块中的水分，置于透明剂二甲苯中0.5—2h。将已透明的组织块用石蜡包埋后固定于切片机上，切成薄片(厚约4-5μm)。再用二甲苯脱去切片中的石蜡后，用苏木精伊红(HE)染色，光学显微镜0lympusCX41(0lympus,日本)下观察肺组织形态学病理改变。[0164]在感染DPI8时，每组各取5只小鼠进行肺血管的通透性检测脉注射伊文蓝溶液，5min后取肺泡灌注液，1500rpm离心5min,取上清液，利用分光光度计检测590nm处测吸光度OD。[0165](8)小鼠肺泡灌注液的获取及Diff-Quick染色[0166]在感染DPI8时，每组各取5只小鼠测肺泡灌注液的炎症细胞数。与高毒处理组相数目。[0168]剪开小鼠颈部皮肤，暴露出气管。[0170]1500rpm离心5min,上清转移至一新的10mL离心管-80℃冻存，细胞沉淀用450μl[0172]血球计数板计数。[0174]Diff-Quick染色：涂片带湿(即不进行干燥)浸入乙醇乙醚溶液固定15s,稍去掉边缘处固定液，插入Diff-QuickI、Diff-QuickⅡ溶液各15s,流水冲去多余染料。[0175]带湿(即不进行干燥)在镜下检测计数，统计各细胞比例。[0176](9)以上实验结果的数据统计学分析[0177]采用SPSS12.0.1数据处理软件(SPSSInc.,Chicago,IL)单因素方差分析进行，数据符合正态分布，显著性检验采用t检验。数据用平均值±标准误差表示，p<0.05为差异显著;p<0.01为差异极显著。[0178]3.实验结果[0179](1)CBD注射组能显著地抑制H1N1引起的体重降低[0181]从图中可以看出，最开始小鼠体温波动，是由于小鼠购买后用于实验，适应新环境时出现的应激反应，但由于各组小鼠初期体重百分比曲线大致相当，可忽略该应激反应造成的变化。小鼠在感染流感病毒后第3天开始有明显体重下降，约第7-8天到达最低点，然后开始回升，7天不再死亡的个体体重开始明显回升。与高毒组相比，达菲组(20mg/kg/d)和CBD组(20mg/kg/d)能显著地抑制体重的降低(p<0.01)。[0182](2)CBD注射组能显著地抑制H1N1引起的体温降低[0184]DPI7-9小鼠体温变化具有显著性差异，在DPI7-8达到最大变化。从图中可以看出，小鼠在感染IAV后第4天开始有明显体温下降，约第7-8天到达最低点，然后开始回升，7天不再死亡的个体体温开始明显回升。与高毒组相比，达菲组(20mg/kg/d)和CBD组(20mg/kg/d)能显著地抑制体温的降低。[0185](3)CBD组能显著地降低H1N1感染组的流感症状和行为不适[0187]在感染6-9DPI时，小鼠行为变化具有显著性差异，在DPI8达到最大变化。与高毒处理组相比，达菲组(20mg/kg/d)和CBD注射液组(20mg/kg/d)能显著的增加感染鼠的活动[0188](4)CBD注射组能显著地降低H1N1感染组的死亡率[0190]与高毒处理组相比，达菲组(20mg/kg/d)和CBD组(20mg/kg/d)能显著地降低H1N1WSN感染引起的小鼠死亡率(达菲组，P<0.001;CBD组，P<0.001)。达菲处理组死亡9只(9/20),CBD组死亡10只(10/20),CBD组体现出非常明显的治疗效果。达菲组(9/20)和CBD组(10/20)死亡率没有显著性差异。[0191](5)CBD组能显著地降低H1N1感染组的肺损伤[0192]如图5和图6A—6D所示。染引起的小鼠肺损伤指数(达菲组，P<0.05;CBD组，P<0.05),CBD组体现出非常明显的治疗细胞数侵润。[0194](6)CBD组能显著地降低H1N1感染组肺血管的通透性[0197](7)CBD组能显著地降低H1N1感染组肺泡灌注液的炎症细胞数注液中中性粒细胞的数目。的数目。CN109419786B说明书13/16页[0204]传代的小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone-marrowderivedmacrophage,BMDM)和人成1升)、[0208]达菲组(10μM)。[0209]以上4组均在37℃过夜培养，18-24h细胞汇合度达100%且细胞间无间隙时感染H1N1WSN.MOI=0.01感染细胞1h。[0212]NP-F1:CGGGGAGTCTTCGAGC[0213]NP-R1:TTGTCTCCGAAGAAATAAGA(SEQID[0214]PA-F1:ATGGAAGATTTTGTGCGA[0215]PA-R1:TGACTCGCCTTGC[0216]PB1-F1:TACCGGTGCCATAGAGG[0217]PB1-R1:CGCCCCTGGTAATCCTCATC(SEQIDNO:6)[0218]PB2-F1:GCGATTGAATCC[0219]PB2-R1:TCCGCGCTGGAA[0220]实验结果分别如图11A和图11B(小鼠的BMDM细胞)以及图12A一图12D(人肺上皮细[0225]6周龄的C57BL/6雄鼠，购自北京维通利华实验技术有限公司。[0226]与实例1条件一致。动物常规饲养于中国科学院微生物研究所P2和P3动物中心验室动物伦理委员会(SKLAB-2017-3-002)批准了动物实验。[0227]将C57BL/6雄鼠随机分为2组，每组10只小鼠，从感染第4天起，每天腹腔注射给药1[0228]流感组(H5N11000pfu):感染第4天开始注射等量生理盐水。[0231]H5N1病毒的扩增方法和滴度检测方法与实施例1完全相同，只是病毒亚型是H5N1。[0232]小鼠生理特征和发病症状的观察和记录与实例1完全相同。[0233]H5N1感染小鼠当天(Dayofpostinfection,DPIO)至感[0234]H5N1(以1000pfu剂量感染，监[0235]在功毒的第9天(DPI)分别对小鼠的活动状况的进行了录像，检测和量化，小鼠行细情况参见实验材料和方法部分。取有代表性的1分钟内的行为活动，进行计数。[0236]每天记录H5N1感染小鼠的死亡情况。[0238](1)CBD组能显著的抑制H5N1引起的体重降低[0240]从图中可以看出，最开始小鼠体温波动，是由于小鼠购买后用于实验，适应新环境时出现的应激反应，但由于各组小鼠初期体重百分比曲线大致相当，可忽略该应激反应造成的变化。小鼠在感染流感病毒后第6天开始有明显体重下降，约第10天到达最低点，然后[0241](2)CBD组能显著的抑制H5N1引起的体温降低[0243]DPI9小鼠体温变化具有显著性差异，与流感组相比，CBD组(20mg/kg/d)能显著的抑制体温的降低。由于第9天小鼠死亡一半，不能进行统计学分析了，[0244](3)CBD组能显著的降低H5N1感染组的流感症状和行为不适[0245]如图15所示。在感染DPI9时(n=5/组),小鼠行为变化具有显著性差异(p<0.001)。与流感组(n=5/组)相比，CBD组(20mg/kg/d)(n=5/组)能显著的增加感染鼠的活[0246](4)CBD组能显著的延长H5N1感染组的生存时间CBD组(20mg/kg/d)在每个时间点都能显著的延长H5N1感染后小鼠的生存时间为24小时[0248]另外，由于昆明鼠是封闭群，C57BL/6s是自交系，对药物的敏感度和反应程度不一样，同时又是两种不同的品系，这从另一方面说明CBD的广谱性。[0249]实施例4:大麻二酚抑制甲型流感病毒H5N1的RNA聚合酶的体外实验[0250]人非小细胞肺癌细胞系A549(ATCCRCCL-185M),将其接种于6孔板，并分为如CN109419786B说明书15/16页成1升)、[0254]达菲组(1μM)。[0255]以上4组均在37℃过夜[0258]NP-F1:GTGGCCCATAAGTCCTGCTT(SEQIDNO:9)[0259]NP-R1:GGTCGCTCTTTCGAAGGGAA(SEQIDNO:10)[0260]PA-F1:GCCGCAATATGCACACACTT(S[0261]PA-R1:TTGATTCGCCTCGTTCGTCA(SEQI[0262]PB1-F1:AGACTACCAGGGCAGAC[0263]PB1-R1:CAACTGGCCTCCGATAC[0264]PB2-F1:GCAGCAATGGGTCTGAG[0265]PB2-R1:CAATGTTTGGAGGTTGCCCG(SEQIDNO[0266]实验结果分别如图17A、图17B、图17C和图17D所示。humaninfluenzaviruses.PhilosophicaltransactionsoftheRoyalSocietyofLondonSeriesB,Biologicalsciences356,1861-1W.J.,Kariman,K.,Higgins,S.,Bradley,R.,Metz,C.A.,etalNewEnglandjournalofmedicine317,1565-1570.medicine355,79-81.[0273]Kolocouris,N.,Kolocouris,A.,FoscE.,Balzarini,J.,Snoeck,R.,Andantiviralactivityevaluationofsomenewaminoadamantanederivatives.Pinheiro,M.L.,Vitoretti,L.B.,Gimenes-Junior,J.A.,Akamine,A.TTavares-de-Lima,W.,etal.(2015).Cannabidiolimproveslungfinflammationininjury.Immunopharmacologyandimmunotoxicology37,35-41.[0275]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和