CN110892075A 在酵母中生产大麻素 （生物医学股份有限公司）

(19)中华人民共和国国家知识产权局(21)申请号201880046655.9(22)申请日2018.07.12(30)优先权数据(85)PCT国际申请进入国家阶段日(86)PCT国际申请的申请数据(87)PCT国际申请的公布数据(74)专利代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司11219(71)申请人生物医学股份有限公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人马克西姆·米哈耶夫高第丰(54)发明名称在酵母中生产大麻素(57)摘要本公开涉及在酵母中生产大麻素。在一个方多种GPP产生基因和任选地一种或多种GPP途径基因；两种或更多种橄榄酸产生基因；一种或多种大麻素前体或大麻素产生基因；一种或多种己酰辅酶A人聚酮合酶橄榄醇聚酮合酶~己酰基三乙酸内酯榄酸己酰基三乙酸内酯芳族异戊二烯基转移酶大麻萜酚酸△°-四氢大麻酚酸大麻二酚酸热转化热转化大麻色烯酸大麻色烯2(a)一种或多种GPP产生基因和任选地一种或多种GPP途径基因；(b)两种或更多种橄榄酸产生基因；(c)一种或多种大麻素前体或大麻素产生基因；(d)一种或多种己酰辅酶A产生基因，和(e)至少5%干重的脂肪酸或脂肪。2.根据权利要求1所述的酵母，其中所述一种或多种GPP产生基因包含以下中的至少一a)突变的法呢基二磷酸合酶；b)包含K197E取代的突变的酿酒酵母(S.cerevisiae)ERG20;d)包含K189E取代的突变的解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)ERG20;f)编码与SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；g)与SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或h)(a)-(g)的任何组合。3.根据权利要求1所述的酵母，其中所述一种或多种GPP产生基因选自GPP途径基因。4.根据权利要求3所述的酵母，其中所述GPP途径基因选自：b)截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMGR);c)编码与SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；d)与SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或e)(a)-(d)的任何组合。5.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述两种或更多种橄榄酸产生基因包含：(a)-(d)中的至少一者和(e)-(h)中的至少一者；a)橄榄醇合酶(OLS);b)编码与SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；c)与SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或d)(a)-(c)的任何组合；并且其中(e)-(h)包含：e)橄榄酸环化酶(OAC);f)编码与SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、395%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；g)与SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或h)(e)-(g)的任何组合。6.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述一种或多种大麻素前体或大麻素产生基因包含以下中的至少一者：a)可溶性芳族异戊二烯基转移酶；b)大麻萜酚酸合酶(CBGAS);c)编码与SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；d)与SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或e)(a)-(e)的任何组合；其单独地或与以下中的至少一者组合：f)四氢大麻酚酸合酶(THCAS);g)大麻二酚酸合酶(CBDAS);h)大麻色烯酸合酶(CBCAS);i)编码与SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；j)与SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或k)(f)-(j)的任何组合。7.根据权利要求6所述的酵母，其中所述可溶性芳族异戊二烯基转移酶是来自链霉属菌种(Streptomycessp.)CL190菌株的NphB。8.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述一种或多种己酰辅酶A产生基因包含以下中的至少一者：a)己酰辅酶A合酶；d)突变的FAS1和突变的FAS2;e)编码与SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和编码与SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；f)与SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和与SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；g)编码与SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、495%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和编码与SEQIDNO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；h)与SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和与SEQIDNO:19具有至少70%、i)编码与SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和编码与SEQIDNO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；j)与SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和与SEQIDNO:21具有至少70%、k)(a)-(j)的任何组合。9.根据权利要求8所述的酵母，其中所述突变的FAS1和FAS2基因包含选自以下的遗传10.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述酵母包含至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。11.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述酵母被遗传修饰成生产至少5%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。12.根据权利要求11所述的酵母，其中所述酵母还包含提高脂肪酸或脂肪的生产的遗传修饰。a)根据权利要求12所述的酵母，其中所述提高脂肪酸或脂肪的生产的遗传修饰包含以b)编码与SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；c)与SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；d)乙酰辅酶A羧化酶(ACC1);e)编码与SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；5f)与SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；g)二酰基甘油酯酰基转移酶(DGA1);h)编码与SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；i)与SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或j)(a)-(j)的任何组合。13.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述酵母是产油的。14.根据权利要求12所述的酵母，其中所述酵母选自红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、隐球酵母属(Cryptococcus)、假丝酵母属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)。15.根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、斯达氏油脂酵母(Lipomycestoruloides)、粘红酵母(Rhodotorulafermentans)或弯曲隐球酵母(Cryptococcusglutinis)、发酵性丝孢酵母(Trichosporoncurvatus)。16.一种生产至少一种大麻素或大麻素前体的方法，其包括使根据权利要求1至16中任一项所述的酵母与碳水化合物源在培养条件下接触足以生产所述至少一种大麻素或大麻素前体的时间。17.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种大麻素或大麻素前体包括CBGA、18.一种大麻素前体、大麻素或其组合，所述大麻素前体、大麻素或其组合是使用根据权利要求17或18所述的方法生产的。6[0002]本申请要求于2017年7月12日提交的题为“在酵母中生产包含大麻素的萜烯第62531827号的优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。技术领域[0003]本公开涉及在酵母中生产大麻素。背景技术[0004]大麻素是一大类的化学物质，其作用于大麻素受体和其它靶分子，以调节宽范围的生理行为，例如神经递质释放。大麻素在人类中天然产生(称为内源性大麻素),以及由包括大麻(Cannabissativa)在内的几种植物物种产生(称为植物性大麻素)。大麻素已显示出具有若干有益的医学/治疗作用，因此，大麻素是制药工业研究的活跃领域，可用作各种不同疾病的药物产品。[0005]当前，用于药物或其它用途的大麻素的生产是通过化学合成或通过从生产这些大麻素的植物例如大麻(C.sativa)中提取大麻素来进行的。当前的大麻素生产方法有若干缺点。与从天然存在的植物中提取大麻素相比，各种大麻素的化学合成是一个昂贵的过程。大麻素的化学合成还涉及使用不环保的化学物质，这可以被认为是额外的生产成本。此外，各种大麻素的合成化学生产已被分类为药理活性不如从植物如大麻中提取的那些大麻素。尽管化学合成的大麻素存在缺点，但这种生产方法的益处在于最终产品是高纯度的单一大麻素。该纯度水平对于药物用途来说是优选的。制药工业所需的纯度水平反映在以下事实：尚未有基于植物提取物的大麻素生产获得FDA批准，只有合成化合物获得批准。[0006]与大麻素的合成化学生产相反，目前用于生产大麻素的另一种方法是在天然产生这些化学物质的植物中产生大麻素；对此来说最常用的植物是大麻。在这种方法中，栽培植物大麻，并且该植物在开花周期中天然产生各种大麻素。可以收获该植物并且可以各种不同的方法直接从植物本身中摄取大麻素以用于药物目的，或者可以从该植物中提取大麻素。存在多种从植物大麻中提取大麻素的方法。所有这些方法通常都涉及将含有大麻素的植物大麻置于化学溶液中，该化学溶液选择性地将大麻素溶解到该溶液中。存在各种不同有所有不同的大麻素的这种化学溶液，留下多余的植物材料。然后可以进一步处理含有大麻素的溶液以供使用。[0007]在植物如大麻中天然生产和提取大麻素存在若干缺点。由于大麻产生的大麻素种类繁多，因此通常难以利用提取工艺在植物中重现相同的大麻素谱。此外，植物生长的变化将导致植物本身中大麻素的含量不同，从而难以进行可重现提取。不同的大麻素谱将具有药物产品所不希望的不同药物作用。此外，从大麻提取物中提取大麻素会产生大麻素的混合物，而不是高纯度的单一药物化合物。由于许多大麻素的结构相似，因此难以将这些混合7物纯化到高水平，从而导致最终产品的大麻素污染。[0008]因此，需要提供一种改进的大麻素生产方法。发明内容[0009]提供本发明内容是为了以简化形式介绍一些概念，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容既不旨在鉴定所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。根据以下书面的具体实施方式，包括在附图中示出以及在所附权利要求中限定的那些方面，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用和优点将变得显而易见。[0010]根据本公开的第一方面，提供了一种遗传修饰的酵母，其包含：[0011](a)一种或多种GPP产生基因和任选地一种或多种GPP途径基因；[0012](b)两种或更多种橄榄酸产生基因；[0013](c)一种或多种大麻素前体或大麻素产生基因；[0014](d)一种或多种己酰辅酶A产生基因，和[0015](e)至少5%干重的脂肪酸或脂肪。[0016]在某些实施方式中，所述一种或多种GPP产生基因包含以下中的至少一者：[0017]a)突变的法呢基二磷酸合酶；[0018]b)包含K197E取代的突变的酿酒酵母(S.cerevisiae)ERG20;[0020]d)包含K189E取代的突变的解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)ERG20;[0022]f)编码与SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0023]g)与SEQIDNO:1-4中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0024]h)(a)-(g)的任何[0025]在某些实施方式中，所述一种或多种GPP产生基因选自GPP途径基因。在某些实施[0026]a)羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR);[0027]b)截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMGR);[0028]c)编码与SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0029]d)与SEQIDNO:5-6中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0030]e)(a)-(d)的任何组合。[0031]在某些实施方式中，所述两种或更多种橄榄酸产生基因包含：(a)-(d)中的至少一者和(e)-(h)中的至少一者；其中(a)-(d)包含：[0032]a)橄榄醇合酶(OLS);[0033]b)编码与SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、894%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0034]c)与SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0035]d)(a)-(c)的任何组合；[0036]并且其中(e)-(h)包含：[0037]e)橄榄酸环化酶(0AC);[0038]f)编码与SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0039]g)与SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0040]h)(e)-(g)的任何组合。[0041]在某些实施方式中，所述一种或多种大麻素前体或大麻素产生基因包含以下中的至少一者：[0042]a)可溶性芳族异戊二烯基转移酶；[0043]b)大麻萜酚酸合酶(CBGAS);[0044]c)编码与SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷[0045]d)与SEQIDNO:9-12中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0046]e)(a)-(e)的任何组合；[0047]其单独地或与以下中的至少一者组合：[0048]f)四氢大麻酚酸合酶(THCAS);[0049]g)大麻二酚酸合酶(CBDAS);[0050]h)大麻色烯酸合酶(CBCAS);[0051]i)编码与SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷[0052]j)与SEQIDNO:13-15中的任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0053]k)(f)-(j)的任何组合。[0054]在某些实施方式中，所述可溶性芳族异戊二烯基转移酶是来自链霉属菌种(Streptomycessp.)CL190菌株的NphB。[0055]在某些实施方式中，所述一种或多种己酰辅酶A产生基因包含以下中的至少一者：[0056]a)己酰辅酶A合酶；[0057]b)HexA和HexB;[0060]e)编码与SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、994%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和编码与SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0061]f)与SEQIDNO:16具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和与SEQIDNO:17具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同[0062]g)编码与SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和编码与SEQIDNO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0063]h)与SEQIDNO:18具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和与SEQIDNO:19具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同[0064]i)编码与SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸和编码与SEQIDNO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0065]j)与SEQIDNO:20具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽和与SEQIDNO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或至少25%干重的脂肪酸或脂肪。[0072]b)编码与SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0073]c)与SEQIDNO:22具有至少70%、75%、80%、85%、90%、995%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；[0075]e)编码与SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0076]f)与SEQIDNO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；[0077]g)二酰基甘油酯酰基转移酶(DGA1);[0078]h)编码与SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸；[0079]i)与SEQIDNO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽；或[0080]j)(a)-(i)的任何组合。[0081]在某些实施方式中，所述酵母是产油的。在某些实施方式中，所述酵母选自红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、隐球酵母属(Cryptococcus)、假丝酵母属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)。根据前述权利要求中任一项所述的酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母、红酵母(Rhodotorulaglutinis)、发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)或弯曲隐[0082]根据本公开的第二方面，提供了一种生产至少一种大麻素或大麻素前体的方法，该方法包括在培养条件下使本公开的酵母与碳水化合物源接触足以生产所述至少一种大麻素或大麻素前体的时间。[0084]根据本公开的第二方面，提供了一种大麻素前体、大麻素或其组合，所述大麻素前体、大麻素或其组合是使用根据权利要求17或18所述的方法生产的。附图说明[0085]将参考附图讨论本公开的实施方式，其中：[0086]图1是大麻素合成途径的图；[0087]图2是包括非酶促步骤的大麻素合成途径的图；[0088]图3是酵母细胞组织的高级图解；和[0089]图4修饰前后解脂耶氏酵母的油含量。浅色的圆形区域表示图片上的油(参见箭头)。ad9突变体(右图)与野生型解脂耶氏酵母(左图)相比积累更多的油。具体实施方式[0091]对于在以下书面描述中使用的特定术语提供以下定义。[0092]除非上下文另外明确指出，否则如说明书和权利要求书中所用的不带具体数量的11[0093]当在本文中使用时，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。“基本上由……组成”应意味着排除对该组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本上由所生产的大麻素组成的组合物不会排除来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药学上可接受的载体例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。对于所生产的大麻素来说，“由……组成”应意味着排除超过痕量的其它成分的元素和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个所定义的实施方式均在本发明的范围内。[0094]术语“约”或“大约”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受范围给定值的至多20%、优选至多10%、更优选至多5%并且还更优选地至多1%的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程来说，该术语可以指在数值的一个数量级内，优选在5倍以如±1-20%,优选±1-10%并且更优选±1-5%。[0095]在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限与所述范围内的任何其它所述值或中间值之间的每个中间值都被包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在较小范围中，并且也被包括在本发明内，但要遵守所述范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些包括的两个极限中的任一个的范围也被包括在本发明中。核苷酸的聚合形式。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括例如列的分离的RNA,核酸探针和引物。核酸分子还可包含修饰的核酸分子(例如，包含修饰碱[0097]当在本文中使用时，术语“肽”是指两种或更多种亚基氨基酸、氨基酸类似物或拟[0098]当在本文中使用时，术语“氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。如果肽链短，则三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链长(例如，大于约10个氨基酸),则该肽通常称为多肽或蛋白质。剪接。编码序列的适当并置来控制的多核苷酸序列的表达(例如，转录或翻译)。在一个方面，当表[0101]当在本文中使用时，“编码序列”是当置于适当表达控制序列的控制下时被转录并翻译成多肽的序列。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核序列，来自真核mRNA的cDNA,来自真核终止序列通常位于编码序列的3'端。[0102]当在本文中使用时，如果两个编码序列或其互补序列编码相同的氨基酸序列，则肽与细胞通信以将与其连接(例如，经由化学键连接)的多肽引导到内质网囊泡室，进入外生/内生细胞器，被递送至细胞囊泡室、细胞表面或分泌多肽。在有时会被细胞切断。可以发现信号序列与原核生物和真核生物的多种天然蛋白质相关。[0104]当在本文中使用时，“杂交”是指一种或多种多核苷酸反应形成经由核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而稳定化的复合物的反应。氢键键合可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它序列特异性方式发生。所述复合物可以包括形成双链体结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，一条自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，例如PCR反应的启动，或核糖酶对多核苷酸的酶促切[0105]当在本文中使用时，多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)与另一序列具有特定百分比(例如，至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%)的“序列同一性”是指，当使用本领域中的常规软件程序最大程度对齐时，所述百分比的碱基(或氨基酸)在两个序列的比较中是相同的。[0106]当至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、优选至少约80%并且最优选至少约90%或95%的核苷酸在DNA序列的限定长度上匹配时，两个序列是“基本上同源约75%、优选至少约80%并且最优选至少约90%或95%的多肽的氨基酸残基在多肽序列的列数据库中可用的标准软件比较序列来鉴定基本上同源的序列。基本上同源的核酸序列也可以在Southern杂交实验中在例如针对该特定系统所限定的严格条件下鉴定。限定适当的杂交条件在本领域技术范围内。例如，严格条件可以是：在42℃下在5xSSC和50%甲酰胺下杂交，以及在60℃下在0.1xSSC和0.1%十二烷基硫酸钠下洗涤。严格杂交条件的其它实例包括：温育温度为约25℃至约37℃;杂交缓冲液浓度为约6xSSC至约10XSSC;甲酰胺浓度为约0%至约25%;以及洗涤溶液为约6xSSC。中等杂交条件的实例包括：温育温度为约40℃至约50℃;缓冲液浓度为约9xSSC至约2xSSC;甲酰胺浓度为约30%至约50%;以及洗涤溶液为约sxSSC至约2xSSC。高严格条件的实例包括：温育温度为约55℃至约68℃;缓冲液浓度为约1xSSC至约0.1xSSC;甲酰胺浓度为约55%至约75%;以及洗涤溶液为约1xSSC、0.1xSSC或去离子水。通常，杂交温育时间为5分钟至24小时，其中具有1、使用其它缓冲系统的SSC的等效物。可以通过测序来验证相似性，但是优选地，也可以或替代地使用适合于所讨论的特定结构域的测定法，通过功能(例如，运输到内体区室的能力等)来验证相似性。[0107]术语“序列相似性百分比(%)”、“序列同一性百分比(%)”等通常是指核酸分子的不同核苷酸序列或多肽的氨基酸序列之间的同一性或对应程度，所述序列可能有或可能没有共同的进化起源(参见Reeck等，同上)。序列同一性可以使用许多公开可用的序列比较算[0108]为了确定两个氨基酸序列或两个核酸分子之间的同一性百分比，将序列对齐以达到最佳的比较目的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置数的函数(即，同一性百分比=相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方式中，两个序列的长度相同或大约相同。可以使用与以下描述的技术类似的技术来确定两个序列之间的同一性百分比，允许或不允许存在空位。在计算序列同一性百分比时，通常对精确匹配进行计数。[0109]可以使用数学算法来确定两个序列之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1990,87:2264的算法，其按Karlin和Altschul,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分=100,字长=12,以获得与本发明序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，得分=50,字长=3,以获得与本发明的蛋白质序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul万维网(WorldWideWeb)上的/BLAST/。[0110]用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS罚分12和空位罚分4。[0111]在一个优选的实施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.1970,48:444-453)的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被并入到GCG软件包(Accelrys,Burlington,MA;可在万维网上的获得)的GAP程序中，该程序使用度权重为1、2、3、4、5或6。一组特别优选的参数(以及当专业人员不来确定分子是本发明的序列同一性还是同源性限制时可以使用的参数)是使用Blossum62评分矩阵，其中空位开放罚分为12,空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5。[0112]可以如何确定同一性百分比的另一个非限制性实例是通过使用软件程序，例如在《现代分子生物学实验指南》(CurrentProtocolsInMolecularBiology)(F.M.Aus等编，1987)增刊30,第7.7.18节，表7.7.1中所述的软件程序。优选地，使用默认参数进行比以下默认参数：遗传密码=标准；过滤器=无；链=两个；截止值=60;期望值=10;矩阵=GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的细节可见于以下[0113]可以通过标准检验，例如t检验、ANOVA或卡方检验来进行本文所述性质的统计分析。通常，统计显著性将被测得为以下水平：p=0.05(5%[0114]也可以提供结构域序列的“保守修饰的变体”。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列或者其中核酸不编码氨基酸序列的那些核酸，指基本上相同的序列。具体而言，简并的密码子取代可通过产生如下序列来实现，其中一种或多种选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer衍生物”具有与野生型蛋白的生物学活性至少基本上相等(例如，与其无显著差异)的生物学活性，如使用适合于检测所述活性的测定法所测量的。抗体或其片段通常天然相关的细胞成分和其它成分分离(或基本上不含所述细胞成分和其或其片段不需要“分离”即可将其与天然存在的对应物区分开。基本上不含或基本上纯化是指至少50%的群体，优选至少70%、更优选至少80%并且甚至更优选至少90%的群体不含与它们天然相关的组分。可以与构成细胞基因组的染色体DNA整合(共价连接),或者可以不整合(共价连接)。例如，多核苷酸可以维持在游离元件例如质粒上，或者稳定转化的细胞是其中多核苷酸已经整合到染色体中以致它能通过染色体复制被子代细胞遗传的细胞。该稳定性通过所述细胞建立由包含转化的多核苷酸的子代细胞群体组成的细胞系或克隆的能力来证实。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代(例如至少约10代)的原代细胞的克隆。[0118]“载体”包括质粒和病毒以及可用于转化或转染细否自我复制。[0119]当在本文中使用时，“遗传修饰”是指对细胞的正常核苷酸的任何添加、缺失或破坏，和/或酵母中附加异源序列。可以实现遗传修饰的任何方法都在本发明的精神和范围[0120]除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微和Sambrook,《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(1982);《DNA克隆：实用方法》(DNACloning:APracticalApproach),第I和《转录和翻译》(TranscriptionandTranslation)(B.D《动物细胞培养》(AnimalCellCulture)(R.I.Freshney编，1986);《固定化细胞和酶》 PracticalGuidetoMolecularCloning)(1984)。[0121]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了描述和公开可与本文描述的发明结合使用的装置、制剂和方法的目的，本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。[0122]遗传修饰的酵母菌株[0123]本文公开了包含一种或多种导致产生至少一种大麻素或大麻素前体的遗传修饰的遗传修饰酵母及其产生方法。所公开的酵母可以从简单的糖源产生各种大麻素，例如在的遗传工程涉及在酵母中插入产生适当酶的各种基因和/或改变天然代谢途径，以实现所需化合物的生产。通过酵母的遗传工程，可以将这些代谢途径引入这些酵母中，并且酵母可以产生与植物大麻中产生的相同的代谢产物。这种方法的益处是，一旦对酵母进行了工程改造，大麻素的生产就会成本低廉且可靠，并且取决于生物体和基因操作，仅产生特定的大麻素或产生其子集。大麻素的纯化非常简单，因为酵母中仅存在单一大麻素或选定的少数[0124]图1示出了生产大麻素的高水平生物合成路线。该途径始于通过聚酮合酶(OLS)和橄榄酸环化酶(OAC)的作用将己酰辅酶A转化为橄榄酸(OA),一种聚酮化合物。然后，通过芳族异戊二烯基转移酶用单萜烯香叶基二磷酸(GPP)将OA异戊二烯化为大麻萜酚酸(CBGA)。氢大麻酚酸合酶(THCAS)从CBGA产生四氢大麻酚酸(THCA),或者通过大麻色烯酸合酶(CBCAS)从CBGA产生大麻色烯酸(CBCA)。[0125]图2显示了非酶促修饰的生产途径。[0126]过去，曾多次尝试在酵母中生产大麻素。目前，由于产率极低，没有人能够达到合理的生产价格。我们已经确定了可以如何提高产率。[0127]我们已经建立了酵母中的油产量与理论最大大麻素产量之间的联系。基于这个出乎意料的联系：(1)我们建议使用具有至少5%干重的脂肪酸或脂肪的酵母，例如油性酵母，例如解脂耶氏酵母，而不是在传统酵母中生产大麻素；(2)我们还建议进行其它遗传修饰，以提高工程改造酵母的产油水平；(3)将来自大麻素生产途径的其它基因与来自生产大麻素中间体的替代途径的基因例如NphB组合添加；(4)通过例如遗传突变ERG20和/或通过使用来自替代途径的等同基因来增加GPP的产量；(5)增加用于大麻素生产途径的来自脂肪酸[0128]大麻素在水溶液中的溶解度有限。但是，它们在疏水性液体如脂质、油或脂肪中具酶几乎不能将CBGA转化为THCA。在同一篇论文中，作者证实了未纯化的酵母裂解物可明显中，作者进一步改善了无细胞过程。他们使用了有机疏水相和水相的两相反应。作者证实从此，我们可以得出结论，疏水相是成功合成所必需的，并且大麻素主要存在于有机相中。[0129]酵母细胞的高级图解如图3所示。传统酵母如酿酒酵母、K.phaffii、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)中的主要脂质物质沉积在脂质膜中。这些类型的酵母几乎没有油性体。在这种情况下，产生的任何大麻素都会溶解在该膜中。太多的大麻素会破坏膜的稳定性，从而导致细胞死亡。据报道，在糖含量高且没有氮供应的最佳条件下，这些酵母可具有最高2-3%干重的油(即脂肪和脂肪酸)。[0130]存在若干种非传统的酵母，如解脂耶氏酵母。解脂耶氏酵母的天然形式可以具有高达17%干重的油。油的主要物质位于油性体中。溶解在此类油性体内的大麻素不会引起膜不稳定。因此，解脂耶氏酵母可以具有高得多的大麻素生产水平。多项工作已证实对解脂耶氏酵母的修饰可以使脂质含量超过干重的80%(Qiao等，2015)。图4取自Qiao等，2015,并证实了修饰型和野生型解脂耶氏酵母中油含量的差异。使用一组最少3个遗传修饰。[0131]因此，我们建议大麻素生产可以达到酵母中油含量的一定百分比。这给出了相关性：更多的油意味着更多的大麻素生产。[0132]一篇综述文章(Ângela等，2017)分析了作为大麻素的潜在生产者的不同类型的酵母。表1改编自Ângela等，2017的汇总表，其中作者在不同参数下比较了4种酵母类型。但是，他们完全忽略了油含量、理论最大生产极限和最小生产商品成本。最右边的两列显示最大油量(以干重的百分比表示),以及在油中仅存在1%的大麻素时的生产成本。底行显示了本公开的修饰的解脂耶氏酵母的一个实施方式。最后，Ângela等，2017的作者认为，乙酰辅酶A库工程改造具有优化潜力；+。然而，我们发现在未修饰下YL具有高浓度的乙酰辅酶A。2017;Poulos和Farnia[0135]大麻素的途径在多个出版物中都有描述。我们可以使用来自最近论文(2017;Poulos和Farnia[0135]大麻素的途径在多个出版物中都有描述。我们可以使用来自最近论文(Zirpel等，2016;2016;Angela等，2017)以及其它论文的所有建议的修饰。我们可以二植物蛋白质大肠杆菌(E.coli)十-++巴斯德毕赤酵母(P.++马克斯克鲁维酵母+十++母十+++,在未修饰下YL具*最大油%是指在最佳培养条件下可以产生多少油。%计算自干表1改编自Carvalho,Angela等，“设计用于大麻素的异源生物合成的微生物(Designingmicroorganismsforheterologousbiosynthesisofcannabinoids).”FEMSyeastresearch17.4(2017).1.+++,许多出版物可用，充分确定；++,有出版物可用，优化可能；+,第一出版物可用，尚未确定/无法使用；-,不可能；‘空’,尚未描述。[0136]如关于大麻素和萜烯生产的多篇论文中所描述的，我大麻素前体或大麻素产生基因；(d)一种或多种己酰辅酶A产生基因，以及(e)至少5%干重[0139]所公开的基因可以是内源的或异源的，并且包括保留所公开基因的功能的同源少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的多60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约100%的功效保留将CBGA环化以产生白在将CBGA环化以生产CBDA中具有大于110%、120%、130%、140%或和150%的改进的活任何合适的终止子。短的合成终止子特别合适并且容易获得，参见例如MacPherson等，某些实施方式中，基因的过表达可以使酵母中的基因产物的活性增加约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约100%、约105%、约110%、约115%、约120%、约125%、约130%、约135%、约140%、约145%、约150%、约155%、约160%、约165%、约170%、约175%、约180%、约185%、约190%、约95%或约200%。少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%干重的脂肪酸或脂肪。酵母也可以被遗传修饰成积累或生产更多的脂肪酸少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%干重基焦磷酸(GPP),然后将两个GPP分子缩合以提供氧戊基焦磷酸(feranylpyrophosphate,突变是F96W和N127W的双取代。如本领域技术人员将容易理解的，由于来自酿酒酵母的包含：突变的法呢基二磷酸合酶；包含K197E取代的突变具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%SEQIDNO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在某些实施方式中，酿酒酵母ERG20(F96W和N127W)包含编码与SEQIDNO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。等同的解脂耶氏酵母氨基酸序列以SEQIDNO:3和4所示。在某些实施方式中，解脂耶氏酵母ERG20(K189E)包含编码与SEQIDNO:3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，解脂耶氏酵母ERG20(K189E)包含与SEQIDNO:3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，解脂耶氏酵母ERG20(F88W和N119W)包含与SEQIDN0:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。GPP蛋白质的变体例如ERG20以与原始序列相比至少约80%、至少约90%或至少约100%的功效保留将异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAP)缩合为香叶基焦磷酸(GPP)的能力，而与其来源的序列相比，将GPP缩合为FPP的能力降低了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(无效突变)。MASEKEIRRERFLNVFPKLVEELNASLLAYGMPKEACDWYAHSLNYNTPGGKLNILSNKTVEQLGQEEYEKVAILGWCIELLQAYFLVADDMMDKSITRRGQPCWYKAFMLEAAIYKLLKSHFRNEKYYIDITELFHEVTFQTELGQLMDLITAPEDKVDLSKF[0147]IVTFETAYYSFYLPVALAMYVAGITDEKDLKQARDVLIPLGEYFQIQDDYLDTDIQDNKCSWVINKALELASAEQRKTLDENYGKKDSVAEAKCKKIFNDLKIEQLDI.KAKTSOVDESRGFKADVI.TAFI.NKVAFMLEAAIYKLLKSHFRNEKYYIDITELFHEVTFQTELGQLMDLITAPEDKVDLSKFIVTFKTAYYSFYLPVALAMYVAGITDEKDLKQARDVLIPLGEYFQIQDDYLDCFTDIQDNKCSWVINKALELASAEQRKTLDENYGKKDSVAEAKCKKIFNDLKIEQLDLKAKISQVDESRGFKADVLTAFLNKVMSKAKFESVFPRISEELVQLLRDEGLPQDAVQWFSDSLQYNCVGGKLNRGLSVVDTELDDEEYYRLALLGWLIELLQAFFLVSDDIMDESKTRRGQPCWYLKPKVGMIAIYILLKKHFRQEKYYIDLVELFHDISFKTELGQLVDLLTAPEDEVDLNRFSLDKHSFYSFYLPVVLAMYVAGITNPKDLQQAMDVLIPLGEYFQVQDDYLDNFGDPEFIGKIGTSWLVNKALQKATPEQRQILEDNYGVKDKSKELVIKKLYDDMKIEQDVDESRGFKKEVLNAFLAKIYKASKAKFESVFPRISEELVQLLRDEGLPQDAVQWFSDSLQYNCVGGKLNRGLSVVDTYQELDDEEYYRLALLGWLIELLQAFWLVSDDIMDESKTRRGQPCWYLKPKVGMIAYILLKKHFRQEKYYIDLVELFHDISFKTELGQLVDLLTAPEDEVDLNRFSLDKHSFIYSFYLPVVLAMYVAGITNPKDLQQAMDVLIPLGEYFQVQDDYLDNFGDPEFIGKIGTSWLVNKALQKATPEQRQILEDNYGVKDKSKELVIKKLYDDMKIEQDVDESRGFKKEVLNAFLAKIYK同一YALIOE05753P[解脂耶氏酵母CLIB122]假定蛋白[斯达氏油脂酵母NRRLY-11557]法呢基焦磷酸合酶[白地霉(galactomycescandidus)]法呢基焦磷酸合酶[复杂赛氏菌(Saitoellacomplicata)假定蛋白[TetrapisisporablattaeCBS6284]假定蛋白[德尔布有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)]未命名蛋白产物[小麦叶枯菌(Zymoseptoriatritici)ST99CH1E4]ERG20法呢基二磷酸合酶[小麦叶枯菌IPO323]LAFE0G04434g11[发酵性拉茜斯酵母(Lachanceafermentati)]ERG20样蛋白[库德里亚夫酵母(Saccharomyceskudriavze假定蛋白[坚粘孢单顶孢(Dactylellinahaptotyla)CBS200.50]可能的法呢基焦磷酸合酶[柱隔孢叶斑病菌(Ramularia法呢基焦磷酸合酶[马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042]含聚异戊二烯基合成结构域的蛋白质[芭蕉亚球壳(Sp[0156]高水平的GPP生产取决于足够的甲羟戊酸酯生产。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶编码与SEQIDNO:5具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，HMGR包含与SEQIDNO:5具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在某些实施方式中，tHmgR包含编码与SEQIDNO:6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，tHmgR包含与SEQIDNO:6具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。CN110892075A说明书17/36页终止子(Curran等，2015)来表达GPP产生和GPP途径基因。可以通过过表达编码芳樟醇合酶1mg/L的芳樟醇浓度来指示。MLQAAIGKIVGFAVNRPIHTVVLTSIVASTAYLAILDIAIPGFEGTQPISYYHPAASKSSQLAPMVQVITKIASKALFEYSLEVAALFAGAYTGVPRLSQFCIFMVLGFLGLNLINLTAIPHLGKAAAAAQSVTPITLSPELLHAIPASVPVVVTFIVIEKPSEKEEDTSSEDSIELTVGKQPKPVTETRSLDDLEAIMKAGKTKLLEDHSMPSIEVGTIGGGTILEPQGAMLEMLGVRGPHIETPGANAQQLARTQSVKVVEKHVPIVIEKPSEKEEDTSSEDSIELTVGKQPKPVTETRSLDDLEMSNVDGNLLISVSMPSIEVGTIGGGTI同一YALIOE04807P[解脂耶氏酵母CLIB122]假定蛋白[红棕拿逊酵母伸长变体DSM6958]假定蛋白[白地霉]假定蛋白[斯达氏油脂酵母NRRLY-11557]假定蛋自[季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)ATCC6260]HMG1[木质栖息苏吉雅玛菌(Sugiyamaellalignohabitans)]假定蛋白[季也蒙毕赤酵母ATCC6260]假定蛋白[肌酸巴氏杆菌(Babjeviellainositovora)NRRLY-12698]DEHA2D09372P[汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)CBS767]3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1[光滑[假丝酵母]]假定蛋白[多孢范德瓦尔托兹菌(Vanderwaltozymapolyspora)DSM70294]LAFE_0A01552g1_1[发酵性拉茜斯酵母]假定蛋白[法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)]未表征蛋白[KuraishiacapsulataCBS1993]未表征蛋白[光滑假丝酵母][0166]橄榄酸(OA)的生产需要底物己酰辅酶A和3个丙二酰辅酶A分子，其中丙二酰辅酶A分子在酵母中由ACC1从乙酰辅酶A天然产生。橄榄酸的生产需要两种酶来缩合和随后环化丙二酰辅酶A与己酰辅酶A。该过程需要四酮合酶即橄榄酸合酶(OS)和聚酮环化酶即橄榄酸环化酶(OAC)。在某些实施方式中，两种或更多种橄榄酸产生基因包含橄榄醇合酶(LS)和橄榄酸环化酶(OAC)。此处显示了大麻基因的序列，但是技术人员应理解，同源基因也可能85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，OLS包含与SEQIDNO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在某些实施方式中，OAC包含编码与SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，OAC包含与SEQIDNO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。[0167]OA蛋白的变体例如0AC保留了例如催化作为底物的线性戊基四-β-酮辅酶A进行C2-C7醛醇环化以生成OA的能力。例如，OA蛋白的变体例如0AC必须以与原始序列相比至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约100%的功效保留催化作为底物的线性戊基四-β-酮辅酶A进行C2-C7醛醇环化以生成OA的能力。在优选的实施方式中，OA蛋白的变体例如OAC与其来源的序列相比具有改进的活性，因为所述改进的变体普通大麻素蛋白与所述改进的变体所来源的序列相比，在催化作为底物的线性戊基四-β-酮辅酶A进行C2-C7醛醇环化以生成OA中具有大于110%、120%、130%、140%或和150%的改进的活性。[0168]OA产生基因OLS和OAC可以使用例如组成型TEF内含子启动子或天然启动子(Wong等，2017)和合成的短终止子(Curran等，2015)来表达。可以使用高效液相色谱(HPLC)或液相色谱-质谱(LC/MS)来确定0A的产量增加。由于酵母不内源性生产OA,因此0A的存在表明OLS和OAS起作用。LPNSEGTIGGHIREAGLIFDLHKDVPMLISNNIEKCLIEAFTPIGISDWN大麻素前体或大麻素产生基因大麻素四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻色烯酸(CBCA)的生产涉及通过芳族异戊二烯基转移酶用GPP将OA异戊二烯化为CBGA,然后分别通过CBDAS、THCAS或[0175]酵母不天然生产CBGA,因此CBGA可以通过异源表达来自大麻的CBGA合酶如膜结合85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。CBGA也可以通过可溶性芳族异戊二烯基转移酶的异源表达来形可溶性芳族异戊二烯基转移酶是NphB,其包含Q161A取代的突变。NphB(Q161A)与野生型80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，NphB包含与SEQIDNO:12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性[0177]大麻素前体或大麻素产生蛋白的变体例如NphB(Q161A)保留了将香叶基基团连接如NphB(Q161A