CN110004179B 一种大麻素类活性物质的通 用检测方法及其检测试剂盒 （浙江诺迦生物科技有限公司）

(19)国家知识产权局(12)发明专利地址311200浙江省杭州市萧山区萧山经济技术开发区启迪路198号杭州湾信合伙)33213CO7K14/705(2006.01)FuraRed-FuraRed-Cr黄光值copGFP焚光值CB1.copGFP/293细胞copGFP293阴性对照细胞本发明公开了一种大麻素类活性物质的通荧光探针试剂FuraRed,对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293.本发明的荧光值(Ca²+F)与copGFP的荧光值(PF)的比值21.一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)将大麻素受体基因CB1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；所述大麻素受体基因CB1为人源大麻素受体CB1基因，荧光蛋白为2)将步骤1)构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程备得到EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293,得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293;3)步骤2)检测组培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²+F,以测得的荧光值Ca²+F/荧光值PF比值作为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；4)步骤2)检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₁和荧光钙离子的荧光值Ca²+F₁,对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₂和荧光钙离子的荧光值Ca²+F₂,计算得到荧光值Ca²+F₁/荧光值PF₁比值与荧光值Ca²+F₂/荧光值PF₂比值之差，并代入步骤3)回归方程，即可计算出检测样本中的大麻素类活性物质含量；步骤1)构建的质粒为pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，连接酶切位点步骤2)中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V,建立EF1-荧光蛋白基因稳转胞293V,制备得到CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293;并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·copGFP/293;步骤3)和步骤4)中的细胞内游离钙离子探针试剂均为FuraRed。2.如权利要求1所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3)中，向检测组培养液加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/3.如权利要求1所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3)中，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²+F的方法为：用荧光酶标仪进光蛋白的荧光值PF,640nm波长下检测荧光钙离子的荧光值Ca²+F。4.如权利要求1所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤4)中，35.一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed,所述对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed;所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293,得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293;稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·copGFP/293的制备方法为：将pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293;并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·4一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。背景技术[0002]对于吸毒人员吸食大麻类精神物质的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成大麻素层出不穷，且分子结构发明内容[0003]针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。[0004]本发明构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号通路使内质网内储存的Ca²+迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答。由于有非常多的钙离子指示剂可用于胞质内游离钙离子浓度的测定，因而我们通过建立同时表达绿色荧光蛋白copGFP稳转CB1以荧光钙与copGFP的荧光比值为测定参数，建立一种新型的快速简便、高效精准、高通量通用的大麻素类活性物质检测方法。[0005]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：[0006]1)将大麻素受体基因CB1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动[0007]2)将步骤1)构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；[0008]3)步骤2)检测组培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²+F,以测得的荧光值Ca²+F/荧光值PF比值作为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；[0009]4)步骤2)检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧5光蛋白的荧光值PF₁和荧光钙离子的荧光值Ca²F₁,对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF₂和荧光钙离子的荧光值Ca²F₂,计算得到荧光值Ca²F₁/荧光值PF₁比值与荧光值Ca²F₂/荧光值PF₂比值之差，并代入步骤3)回归方程，即可计算出检测样本中的大麻素类活性物质含量。[0010]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1)中，所述大麻素受体基因CB1为人源大麻素受体CB1基因，荧光蛋白为copGFP。[0011]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1)构建的质粒为pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达[0012]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2)中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V,建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293;并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·[0013]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2)中，所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系293V,制备得到EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293,得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293。[0014]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3)中，向检测组培养液加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL和1.6ng/mL的5种检测组标准液。[0015]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3)和步骤4)中的细胞内游离钙离子探针试剂均为FuraRed;步骤3)中，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²+F的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择482nm单波长激发，以507nm和640nm双波长检测，其中507nm波长下检测胞内荧光蛋白的荧光值PF,640nm波长下检测荧光钙离子的荧光值Ca²+F。[0016]所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤4)中，所述待测[0017]所述的一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1的单克隆细胞系CB1·copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed,所述对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed;所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293,得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/6[0019](1)避免了免疫检测法依赖于抗体的局限，可直接对所有大麻素类活性物质进行通用检测，没有非特异性结合问题，无需昂贵人力物力和繁复长周期的抗体研发过程；同时也避免了气质联用、液质联用法依赖于对照品的局限、有限的检测限、以及复杂的样品前处理工作。本发明的技术方案可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。[0020](2)用现有成熟的胞质内游离钙离子指示剂，以稳转表达的绿色荧光蛋白为内参质控，可对痕量大麻类精神活性物质进行定性定量检测分析。[0021](3)用通用荧光酶标仪、流式细胞仪等仪器测定，可在绝大多数普通实验室实现[0022](4)由于是基于受体信号通路的生物学效应的检测，结果不仅可正确判断是否是大麻素类活性物质，而且可以对其活性进行定量评估，为监管、和医学干预提供可靠的实验[0023](5)本发明提供一种稳转细胞系，其能够通过CB1的IP3-DAG信号通路对包括天然大麻素和合成大麻素在内的所有大麻素类活性物质产生应答，从而可应用于大麻素类活性物质的高灵敏的通用检测。该稳转细胞系中包含一个由CMV启动高表达基因CB1;当大麻素胞质，胞质内游离Ca²+可瞬间提高百倍，通过在稳转CB1的细胞中同时表达绿色荧光蛋白copGFP,以copGFP为内参质控，FuraRed为钙离子荧光指示剂；用荧光酶标仪进行胞内荧光与copGFP的荧光值(PF)的比值Ca²F/PF作为检测对象的定性定量判定依据，建立一种新型的快速简便、高效精准、高通量通用的大麻素类活性物质定性定量检测方法，另一方面本发试剂盒，该检测试剂盒基于CB1受体的IP3-DAG信号通路，通过检测胞质内游离钙离子浓度变化，以荧光钙的荧光值(Ca²+F)与copGFP的荧光值(PF)的比值Ca²+F/PF参数作为判定依附图说明[0024]图1为pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒图谱；值(507nm检测)比值为纵坐标绘制的标准曲线；[0026]图3为采用本发明的大麻素类活性物质的检测试剂盒对毛发样本的检测结果。[0027]图4为竞争ELISA法对0-12.8ng/mL浓度THC的检测结果，结果表明对THC的检测极限>0.4ng/mL;[0028]图5为竞争ELISA法对0.4-12.8ng/mL浓度THC的检测标准曲线；[0029]图6为竞争ELISA法对毛发样本的检测结果。7具体实施方式[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。[0031]以下实施例中，慢病毒包装细胞293V购自于北京英茂盛业生物科技有限公司。[0032]实施例1pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒构建[0033]通过连接酶切位点EcoRI和NotI,将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达[0034]实施例2建立CB1·copGFP/293稳转细胞系和copGFP/293稳转细胞系[0035]将pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞霉素、100μg/mL链霉素双抗)将慢病毒包装系细胞293V配成1×10⁶个/mL浓度，并接种于一[0037]2)转染：待培养皿中细胞长至70%-80%的融合度时，用PEI转染试剂(参照其标准的共转染培养皿中的细胞293V。[0038]3)收集病毒：步骤2)培养70-72小时后收集上清液；于4℃温度且8000g相对离心力条件下进行离心分离15分钟，去沉淀，取上清病毒液过0.45μm滤膜，得到滤过的上清病毒[0039]4)病毒浓缩：取步骤3)滤过的上清病毒液(约30mL),于4℃温度且90000g相对离心[0040]5)HEK293细胞准备：预先将1×10⁵个/mL浓度的HEK293细胞接种12孔细胞培养板1[0041]6)HEK293细胞转染：将步骤5)的12孔板中的培养HEK293细胞的培养液吸掉，加入DMEM-H完全培养液。[0042]7)CB1·copGFP/293单克隆稳转细胞系建立：将步骤6)转染细胞培养一周以上后，配成1×10³个/mL浓度接种于6孔细胞培养板，2mL/孔；培养10天后在荧光显微镜下用50μl的移液枪挑取不同荧光强度的单个克隆细胞团，移至新的6孔细胞培养板培养，1个克隆/copGFP/293细胞克隆系，用于不同活性效应程度的大麻素类活性物质检测。[0043]copGFP/293单克隆稳转细胞系建立：依上述1)-7)的步骤，建立copGFP/293单克隆稳转细胞系，不同之处在于：步骤2)中的pCMV-CB1·EF1-copGFP质粒用同等质量的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒替换，最后得到copGFP/293单克隆稳[0044]实施例3大麻素类活性物质通用检测试剂盒的应用[0045]基于本发明技术方案研发的大麻素类活性物质通用检测试剂盒可应用于含大麻素类活性物质的各种样本检测。本实施例中我们以吸食大麻人员的毛发为例。具体步骤如8[0046]1)毛发样本处理：取6份大麻吸食人员的毛发样本和8份无吸食史的正常人的毛发[0047]剪取发根3cm以内的毛发样本20mg/份，剪碎后放入5mL的EP管，加2mL含1%角蛋白酶的HBSS缓冲液(pH7.4),加入少量锆珠和石英砂，粉碎仪上振荡粉碎1分钟，分别得到相应的样本液。表1毛发样本编号样本大麻吸食人员的毛发样本无吸食史的正常人的毛发样本编号[0049]2)细胞准备：提前一天将5×10⁵个/mL浓度的单克隆CB1·copGFP/293细胞和空白[0051]标准品组：CB1·copGFP/293细胞共5孔，各孔含THC标准品终浓度分别为0.1ng/骤处理。[0052]样本组：CB1·copGFP/293细胞共42孔(每样3个重复孔),加入步骤1)所得样本液，细胞同样步骤处理。[0053]4)检测：对步骤3)处理的标准品组和样本组，分别进行胞内荧光蛋白的荧光值检测和荧光钙离子的荧光值检测，标准品组和样本组的检测方法步骤相同。标准品组的检测过程为：将FuraRed工作液加入步骤3)处理的标准品组中，37℃培养20分钟，加入3倍体积离心细胞，以防细胞丢失；37℃培养10分钟，然后用荧光酶标仪进行细胞内荧光钙离子检(标记为FuraRed-Ca²+荧光值),507nm下检测细胞内荧光蛋白的荧光值(标记为copGFP荧光值)。[0054]5)结果：对步骤3)标准品组的检测结果绘制标准曲线，标准曲线的横坐标为THC标准品浓度，标准曲线的纵坐标为FuraRed-Ca²+荧光值/copGFP荧光值比值，回归方程为y=0.7627x+0.8093,R²=0.9885,绘制的标准曲线如图2所示。步骤3)样本组对CB1·copGFP/293细胞和copGFP/293阴性对照细胞的检测应答结果如图3,从图3可以看出，可明显区分出阳性样本和阴性样本，有极显著差异。根据回归方程为y=0.7627x+0.8093计算，阴性样本均检测不到大麻素成分，阳性样本中大麻素相对含量分别为(ng/mg):C1:[0055]对比例1:竞争ELISA法检测大麻吸食人员的毛发样本[0056]目前大麻类检测主要依赖于免疫法检测，包括胶体金免疫层析法和竞争ELISA法。胶体金法适合快检，但在灵敏度上ELISA法要比胶体金法高1个数量级。本对比例即以ELISA9法检测大麻吸食人员的毛发样本为例。具体步骤如下：[0057]1)毛发样本处理：用实施例3中步骤1)的方法处理样本，分别得到相应的样本液(毛发样本编号与表1相同)。[0058]2)包被抗原：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将THC-BSA抗原蛋白配制成1μg/异性结合。[0060]标准曲线组：将THC标准品用PBS缓冲液(pH7.4)配成终浓度分别为0、0.1、0.2、[0062]4)竞争结合