CN110927284A 一种利用hplc检测工业大麻中大麻酚（cbn）的方法 （云南绿新生物药业有限公司）

(10)申请公布号CN110927284A(21)申请号201911290644.8(71)申请人云南绿新生物药业有限公司地址655000云南省曲靖市沾益区城西工业园区(72)发明人刘胜贵王钲霖马海悦付彬彬李智高孔令羽(54)发明名称一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法(57)摘要本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的定量检测方法。本方法用甲醇进行超声提取工业大麻花叶中的大麻酚(CBN),用高效液相色谱仪(HPLC)对待测液进行检测。采用外标法定量得到花叶样品2(1)样品的准备：将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥，粉碎机粉碎，混匀待(2)样品的前处理：准确称取花叶样品于离心管中(3)标准工作溶液的配置：将购买得大麻酚(CBN)标准溶液用甲醇稀释至浓度范围为1μg/mL～100μg/mL的标准工作溶液，其浓度范围覆盖试样中待测组份的含量；(4)用高效液相色谱法(HPLC法)测定：利用HPLC对标准工作溶液和样品处理液进行检测，测定方法是以标准工作溶液目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对制备好的样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品中待测组分的浓度，进而计算得其含量；若样品处理液浓度超过标准工作溶液浓度范围，则稀释后再检测。2.根据权利要求1所述的一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪(HPLC)条件如下：流动相为乙腈(色谱纯)和水(去离子水),乙腈与水的比例为65%:35%,等度洗脱，流速为1mL/min;进样量为10uL;柱温为30℃;检测器检测波3.根据权利要求1所述的一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法，其特征在于，所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物，60℃干燥至水分小于5%,粉碎机粉碎至20目。4.根据权利要求1所述的一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法，其特征在于所述有机溶剂为色谱纯甲醇，甲醇所用体积量与花叶样品质量比为10:1;所述超声时间为20min,超声功率为250W,工作频率为40kHz;所述离心的转速为10000转/分钟，时间为5分5.根据权利要求1所述的一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法，所述配制①将购自美国Sigma公司的CBN标准物质(1mg/mL,共1mL)转移至10mL容量瓶中，用色谱级甲醇洗涤原瓶及滴管数次，并全部转移至容量瓶中(注意转移过程中不能洒出),定容，得6.根据权利要求1所述的一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法，其特征在于所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260;色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18;所述检测器为二极管阵列检测器(简称DAD检测器)。3技术领域[0001]本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法。背景技术[0002]工业大麻是指四氢大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻，是大麻科大麻属一年生草本植物，大麻中的主要活性成分是大麻素类化合物，主要的大麻酚类化合物有四氢大麻酚占大麻酚类化合物的90%以上。[0003]目前人们对大麻素的研究主要集中在四氢大麻酚和大麻二酚，对大麻酚(以下简神活性是THC的1/10,是一个极具医疗用途的大麻素。[0004]现有技术中大部分关于大麻酚类化合物成分的检测都局限于THC和CBD的检测。CBN有较高的医用价值，故准确测定花叶原料中的CBN含量十分重要。但目前尚未有权威的CBN检测标准，因此开发一种能够准确测定工业大麻花叶中CBN含量的检测方法十分必要。发明内容[0005]本发明使用甲醇超声提取工业大麻花叶中的大麻酚(CBN),用高效液相色谱仪本发明提供了一种工业大麻花叶中大麻酚(CBN)含量的测定方法，包括如下步骤：①样品的准备：将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥，粉碎机粉碎，混匀待[0007]②样品的前处理：准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，离心[0008]③标准工作溶液的配置：将购买的大麻酚(CBN)标准溶液用甲醇稀释至浓度范围[0009]④用高效液相色谱法(HPLC法)测定：利用HPLC对标准工作溶液和样品处理液进行检测，测定方法是以标准工作溶液目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对制备好的样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品中待测组分的浓度，进而计算得其含量；若样品处理液浓度超过标准工作溶液浓度范[0010]高效液相色谱仪(HPLC)条件如下：流动相为乙腈(色谱纯)和水(去离子水),乙腈与水的比例为65%:35%,等度洗脱，流速为1mL/min;进样量为10uL;柱温为30℃;检测器检测[0011]进一步的，步骤①中所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物。4[0012]进一步的，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯甲醇，甲醇所用体积量与花叶样品质量比为10:1;所述超声时间为20min,超声功率为250W,工作频率为40kHz;所述离心的转速[0013]进一步的，步骤③中所述配制浓度范围为1μg/mL～100μg/mL的CBN系列标准工作溶液步骤为：①将购自美国Sigma公司的CBN标准物质(1mg/mL,共1mL)转移至10mL容量瓶中，用色谱级甲醇洗涤原瓶及滴管数次，并全部转移至容量瓶中(注意转移过程中不能洒出),定容，得[0017]进一步地，所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260;流动相的乙腈为色谱纯，水为去离子水；色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18;所述检测器为二极管阵列检测器(简称DAD检测器)。①本发明建立了一种利用HPLC检测工业大麻中大麻酚(CBN)的方法，能够对工业大麻中CBN化合物进行定性和定量分析，为大麻酚成分和含量的准确判定和快速检测提供科学[0019]②本发明用甲醇进行超声提取大麻花叶中的CBN,实验操作简单，处理时间短，分附图说明[0020]图1大麻酚(CBN)标准对照品色谱图。[0021]图2大麻酚(CBN)标准曲线。[0022]图3实施例1大麻花叶样品色谱图。具体实施方式[0023]以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。[0024]实施例1(1)样品的准备：将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时(水分小于5%),粉碎机[0025](2)样品的前处理：准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10mL色谱纯甲醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10mL甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪(温度40℃)浓缩除去部分溶5级甲醇洗涤原瓶及滴管数次，并全部转移至容量瓶中(注意转移过程中不能洒出),定容，得[0030](4)用高效液相色谱法(HPLC法)测定：利用HPLC对标准工作溶液和样品处理液进行检测，测定方法是以标准工作溶液目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对制备好的样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品中待测组分的浓度，进而计算得其含量；若样品处理液浓度超过标准工作溶液浓度[0031]高效液相色谱仪(HPLC)品牌型号为安捷伦1260条件如下：流动相为乙腈和水，乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为65%:35%,等度洗脱，流速为1mL/min;进样量为10uL;色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18,柱温为30℃;检测器为波长二极管阵列检测器(简称DAD检测器),检测波长为220nm。[0032]CBN出峰时间：22.0min,标准曲线：Y=91.2243X-71.0329,R=0.99813,R2=[0033]实验例1重复性实验按照实施例1的方法制备处理样品。取同一个样品做6份平行样，平行操作，重复做三天，考察重复性。结果见表1,目标物CBN重复性良好。[0034]表1重复性实验结果(峰面积)物质时间第1天第2天第3天实验例2加标回收率实验按照实施例1的方法制备处理样品。同一个样品称取4份，两份作为基底样品，另两份中加入CBN标准品作为加标样品(CBN添加量为10μg/g,称样后加入标准品，平衡12h后进行处理),4个样品平行操作，样品检测结果及加标回收率结果见表2。两个加标样品平均加标回6收率为91.0%,说明发明方法准确度高，能够满足检测要求。[0035]