《生物化学(第2版)》教学课件13DNA的生物合成

第十三章DNA的生物合成概述遗传信息：DNA是生物体遗传信息的主要物质基础。核酸分子中的核苷酸排列顺序，具有世代遗传意义。中心法则：转录反转录翻译复制复制蛋白质DNARNA

复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。

转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。

翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的核苷酸密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。

逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。第一节DNA的复制细胞内（活生物体内）DNA的合成方式：DNA的复制合成（DNA指导下的DNA复制）----大多数生物

反转录合成（RNA指导下的DNA的合成）

-----RNA病毒一、DNA的半保留复制合成1953年，Watson和Crick开创性的论文，对DNA双螺旋的描述以这样一段陈述结尾：“不出我们的意料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。”1.Watson和Crick推测的DNA的复制方式：DNA半保留复制母链子链子链DNA半保留复制2.半保留复制的实验证据1958年法国学者Meselson和Stahl（米西尔逊和斯塔尔）用同位素15N标记大肠杆菌DNA，并用CsCl密度梯度超速离心技术，首先证明了DNA的半保留复制。本实验利用了两大试验技术：（1）15N标记实验（2）CsCl密度梯度超速离心技术实验步骤：（2）转入14N培养基培养一代（细胞数目加倍）—分离DNA，离心。（第一代）（3）14N培养基培养二代—分离DNA，离心。（第二代）（4）14N培养基培养三代，14N纯合与杂合的比例？（1）以15NH4Cl为唯一氮源，培养大肠杆菌12-15代—分离DNA，离心。（亲代）*为了进一步证实半保留复制，可将第一代杂交分子加热变性，然后，将变性前后的DNA分别进行CsCI密度梯度离心，结果会怎样？二、DNA复制的起点和方向1.两个起点，两个生长端的相向复制(存在于线性DNA病毒)3.1个起点，两个复制区的双向复制(最为普遍的DNA复制方式）2.1个起点，1个复制区的单向复制(见于一些环形DNA的复制)生长端生长端旧链新链复制叉复制叉复制叉原核生物与真核生物染色体DNA复制比较大肠杆菌环形染色体DNA分子θ型复制（1个复制原点的双向复制）真核生物染色体DNA复制（多个复制原点的双向复制）复制子：DNA分子上能独立进行复制的一个单位，有起始位点和终止位点。原核生物只有一个复制子真核生物多个复制子复制叉:DNA复制时,双链解开,分成两股,新链沿着张开的模板生成,复制中形成的Y字形的结构。三、参与DNA复制有关的酶①需要解开成单链的DNA母链做模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶；②以4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物催化合成DNA；③不能起始新的DNA链合成，需要RNA或DNA做为引物(primer)；④催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端；⑤催化DNA合成的方向是5'→3'；⑥需Mg2+激活，需要其他酶和蛋白质因子。DNA聚合酶共同的的催化特点：DNA聚合酶催化的反应:反应公式：（dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPiDNA模板链脱氧核苷三磷酸脱氧核糖DNA复制链（一）原核生物DNA聚合酶DNA聚合酶—依赖DNA的DNA聚合酶，是1957年由ArthurKornberg(阿瑟·科恩伯格)首次在大肠杆菌中发现的，后命名为DNA聚合酶I(DNApolyI)。1918年3月3日，阿瑟·科恩伯格(ArthurKornberg，1918-2007)生于美国纽约市。科恩伯格最引人注目的研究工作，是在20世纪50年代中期用实验证明DNA的复制并分离了复制所需的酶，1956年发表著名论文《脱氧核糖核酸的酶促合成》，他因此于1959年获得诺贝尔生理学和医学奖。荣誉在1953年以前，基因的物质本性一直是困扰着全世界生物学家的问题。1953年4月25日《自然》杂志发表了沃森(J.Watson)和克里克(F.Crick)的DNA双螺旋结构模型，既反映了DNA分子可能具有的无穷多样性，又能立刻提出DNA分子自我复制的可能机制，使生物学家一下子接受基因的物质本性就是DNA。但是，DNA双螺旋结构模型虽然是以众多的实验结果为依据，但它本身却尚有待于实验证明。尤其是，DNA果真是一种能自我复制的分子吗??在DNA双螺旋结构模型发表之后，科恩伯格就以这一模型作为设想基础，用实验方法研究DNA的复制，很快得到成功，于1956年发表了初步结果。他成功的原因之一在于他有一个正确的分析:他觉得构成DNA分子的单体虽然是4种脱氧核苷一磷酸，但是，DNA合成的原料却不是4种脱氧核苷一磷酸，而是4种脱氧核苷三磷酸。4种脱氧核苷三磷酸缺1种都不行，用4种脱氧核苷二磷酸或4种脱氧核苷一磷酸也都不行。他还设想，细胞内必有合成DNA所需的酶。于是他把大肠杆菌磨碎，用其提取液加上4种脱氧核苷三磷酸(其中至少有1种进行放射性同位素标记，以便于检查实验结果)，再加一点点微量DNA作为"模板"(如小牛胸腺DNA、大肠杆菌DNA以及大肠杆菌T2噬菌体DNA)。把上述混合液在有镁离子存在的条件下于37℃静置30min，发现放射性标记已进入DNA部分，说明有新合成的DNA分子。新合成的DNA分子即实验产物可以用过氯沉淀法同作为原料的脱氧核苷三磷酸单体分开。科恩伯格测定了产物DNA的碱基组成，发现它们同各自的模板DNA组成惊人地相似,这就充分证明新合成的DNA的特异性是由所加入的那一点点微量的模板DNA决定的，只不过数量大大增加了而已。DNA果然是一种能自我复制的分子!酶有不同的“爪、裂缝、凹陷、突起等的表面特性”，因而酶能利用这些特性来“抓、握、拉长、弯扭与它作用的分子”，从而使被它“抓”住的分子进行各种不同的化学反应，而生成不同的新化合物或物质。这种特殊的“抓”法使分子的反应提高了数百倍甚至数千倍。大肠杆菌DNA聚合酶特征：

现发现在大肠杆菌中存在5种DNApol，根据发现的先后顺序分别命名为DNApolⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、和V。其中主要的有DNApolⅠ、Ⅱ和Ⅲ。DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ分子量109kD120kD＞600kD每个细胞中分子数40010010-205′→3′外切活性（切引物）+--3′→5′外切活性（回头看，纠错）+++功能与作用DNA修复，切去RNA引物并填补空缺活性低，DNA损伤缺口的修复DNA复制主要酶1.DNA聚合酶Ⅰ：Kornberg酶：(单亚基多功能酶)聚合速度:667个核苷酸/每个酶分子.每分钟具有三种酶活性5′3′DNA聚合酶活性（共性）3′5′核酸外切酶活性（纠错，保真）5′3′核酸外切酶活性（切引物，修复损伤）

2.DNA聚合酶Ⅱ（多亚基酶，亚基数目≧7）该酶行使5′3′聚合酶活性时，需要带有缺口的双链DNA作为模板-引物。缺口不能太大（小于100核苷酸）。所以，DNA聚合酶Ⅱ主要作用可能是修复损伤缺口。3′-A-C-G-A-C-C-T-A-C-A-T-5′5′-T-G-C-TT-G-T-A-3′POH缺口：？切口：？具有二种酶活性5′3′DNA聚合酶活性（修补缺口）3′5′核酸外切酶活性（纠错）3.DNA聚合酶Ⅲ（亚基数目≧10）4.DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ：

1999年发现，它们涉及DNA的错误倾向修复。当DNA受到严重损伤时，诱导产生的两个酶。主要的复制酶，每个大肠杆菌细胞中只有10-20个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的。

聚合速度约为9000个核苷酸/每个酶分子.每分钟具有二种酶活性5′3′DNA聚合酶活性（主要复制酶）3′5′核酸外切酶活性（纠错）（二）真核生物的DNA聚合酶在哺乳动物细胞中主要有5种，分别为DNA聚合酶α、β、γ、δ及ε。性质αβγδε亚基数4-5122-3≥1细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－＋＋＋5′→3′外切活性－－－－－功能DNA合成引发DNA损伤修复线粒体DNA复制主要DNA复制酶复制修复

真核生物切除引物由核糖核酸酶H水解掉RNA引物。DNA解链过程中的其他酶及蛋白质：1.解旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白（SSBP）解链酶又称解旋酶(helicase)它能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。引物酶（primase）它是一种特殊的依赖DNA的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。单链结合蛋白(singlestrandbindingproteins,SSB蛋白)它与解开的单链DNA结合，稳定DNA单链状态，不会再度螺旋化，并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解。2.DNA拓扑异构酶，简称拓扑酶DNA拓扑异构酶有I型和II型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。拓扑异构酶I：主要作用是将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。此过程无需共给能量。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。DNA复制完成后，靠拓扑酶将DNA分子引入超螺旋结构。拓扑异构酶II：是在大肠杆菌中发现的，曾被称为旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口。DNA复制完成后，TopoII在ATP参与下，DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。TopoII还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要ATP参与。动画3.DNA连接酶催化相邻的双链DNA片段切口处的5′-磷酸基和3′-OH生成3′，5′-磷酸二酯键。ATCCPPPPOHTAGG3′5′5′3′3′5′ATCCTAGG注意：连接反应需要能量，大肠杆菌和其他细菌以NAD+作为能量来源；动物细胞及噬菌体以ATP作为能量来源。连接酶Mg2+ATPAMP+PPi或NAD+NMN++AMP四、DNA复制过程（原核生物）解链：解链酶破坏氢键解旋：拓扑异构酶破坏正超螺旋结构,贯穿始终。单链结合蛋白（SSBP）与单链结合防止氢键再形成和保护单链部分不被核酸酶降解。识别起点：由引物酶完成。即DNA指导的RNA聚合酶。生成引物RNA：由DNA转录合成。引物必然留有3′-OH末端.DNA的生成：DNA聚合酶Ⅲ催化合成。在RNA引物3′末端上按碱基互补原则合成。切除引物：由DNA聚合酶I催化切除引物，剩下的DNA片段即冈崎片段。补齐缺口：DNA聚合酶I利用其DNA聚合酶活性按碱基互补原则沿

5′3′方向填补两个冈崎片段之间的缺口。其3′末端羟基与下一个DNA片段5′末端磷酸基之间的切口在DNA连接酶催化下（由NAD+供能）形成磷酸二酯键而被连结起来，最终形成DNA模板链的完整新的互补链。动画半不连续复制DNA双螺旋的两条链是反向平行的，而合成方向只能是5′

3′。所以在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可连续复制，称为前导链；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成，称为滞后链。滞后链的片段叫作冈崎片段，它们合成后再连接起来。

动画3ˊ5ˊ注意修改一版教材p387页图片错误真核生物DNA复制特点：1.与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点。2.复制的主要酶是DNA聚合酶α和δ。3.端粒酶：保证了“随从链”复制的完整性。端粒酶：

真核生物体内存在的一种特殊的反转录酶，它是由蛋白质和RNA两部分组成，在端粒酶的催化下，它可以由自身携带的RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长，并继续合成随从链。从而保证染色体复制的完整性。视频第二节反转录作用（RNA指导下的DNA合成）1.反转录酶的发现：1964年，Temin提出前病毒假说(致癌RNA病毒的复制必需经过双链DNA中间体阶段)。1970年，Temin（蒂明）和DavidBaltimore（大卫·巴尔的摩）分别在劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒中同时找到反转录酶。1975年，两位同时获得诺贝尔生理学和医学奖。大卫·巴尔的摩教授（DavidBaltimore）从1997年起担任加州理工大学校长，37岁时（1975年）获得诺贝尔奖。在重组DNA研究，病毒的致病机理、基因转录调控，免疫学中的信号传导等领域做出了杰出的贡献。大卫·巴尔的摩蒂明2006.4泉州师范学院校领导与大卫•巴尔的摩教授夫妇合影留念巴尔的摩妻子为华裔病毒学家、加州理工学院生物学教授黄诗厚（AliceHuang）女士。黄诗厚女士祖籍贵州，生于江西。现为美国科学促进会(AAAS)主席。2018.11.27上午，由香港科学院、英国皇家学会、美国国家医学院举办的“第二届国际人类基因组编辑峰会”在香港大学李兆基大会堂举行。峰会筹委会主席由诺贝尔奖获得者、加州理工学院前任校长大卫·巴尔的摩担任。“基因编辑婴儿”（贺建奎）的话题出现在峰会上。2018世界生命科学大会在北京国家会议中心举行，1975年诺贝尔生理学医学奖获得者大卫·巴尔的摩发表致辞。有科技日报记者问，究竟“哪个生命科学领域将率先取得重大突破并对人类健康做出重大贡献”时，巴尔的摩毫不犹豫的说：“基于基因的一系列治疗方法，会像IT技术改变全球人类生活那样，在未来极大地改善人类健康、提高生命质量。”大卫·巴尔的摩：贺建奎“基因编辑婴儿”项目没必要且不负责任2.逆转录酶的性质依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力（RNA水解酶）依赖DNA的DNA聚合酶3.反转录过程+RNA

+

-DNA

-DNA前病毒-+双链DNA和平共处动画4.逆转录酶的意义完善发展了中心法则以mRNA为模板，合成cDNA。基因工程的工具酶。（筛选目的基因）用于RNA的测序。逆转录病毒经过改建，能成为理想的信息载体，用于肿瘤和遗传病的基因治疗。（利用前病毒能整合到染色体中的机制）第三节DNA的损伤（突变）与修复一、

DNA的突变（各种原因造成的DNA一级结构的改变）（一）

DNA突变的因素1.自发因素2.物理因素引起的DNA损伤3.化学因素引起的DNA损伤DNA突变与变异、生物进化？DNA是细胞内唯一能被修复的分子。包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等自发因素1.DNA复制中的错配2.DNA的自发性化学变化（1）碱基的异构互变（碱基异构体间的互变，造成碱基配对错误）（2）碱基的脱氨基作用（碱基环上的氨基可加水脱氨）（3）脱嘌呤与脱嘧啶（碱基与核糖间糖苷键的自发水解造成）（4）碱基修饰与链断裂（H2O2等的存在对DNA的损伤）保证DNA复制准确性的因素：（1）DNA聚合酶具有模板依赖性，复制时dNTP按碱基配对规律

使子代与亲代DNA核苷酸序列相同，但大约有10-4的错配；（2）DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ均有3′→5′核酸外切酶活性（纠错，

保真），使错配减至10-6；（3）再经错配修复机制，使错配减至10-9以下。物理因素引起的DNA损伤（1）紫外线引起的DNA损伤（2）电离辐射引起的DNA损伤TT二聚体：a.碱基变化：

b.脱氧核糖变化：

c.DNA链断裂：d.交联（DNA链交联，DNA与蛋白质交联）水电离形成的自由基引起碱基破坏、脱氧核糖分解、DAN断裂。3.