《生物化学(第2版)》教学课件17重组DNA技术

第十七章重组DNA技术PaulBergHerbertBoyerStanleyCohen1.1972年PaulBerg和他的同事将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40DNA中，首次构建出DNA的重组体（recombinant）。2.第二年（1973），StanleyCohen和HerbertBoyer将细菌质粒通过体外重组后导入宿主大肠杆菌细胞内，经繁殖得到基因的分子克隆(molecularcloning)，由此产生了基因工程。3.1983年K.M.Ulmer最早提出蛋白质工程这个名词，随即被学术界广泛采用。蛋白质工程又称为第二代基因工程第一节DNA克隆基础DNA克隆：包括从大段染色体上分离出特定基因或DNA片段，将其连接到一个小分子的DNA载体上，然后通过细胞的增殖及每个细胞中克隆DNA的增殖，使修饰过的DNA成百上千倍地复制，从而使特定的基因或DNA片段得到选择性的扩增。任何生物的DNA扩增都需要5个基本步骤，如右图所示。一、限制性内切酶和DNA连接酶构建重组DNA在DNA重组技术方面起重要作用的酶二、克隆载体使插入的DNA片段扩增实验室中常用的3类克隆载体：质粒、病毒和细菌人工染色体（一段能自主复制的染色体DNA）。（一）质粒（plasmid）质粒是独立于宿主染色体外能够复制的环状DNA分子。转化：质粒进入细菌细胞可通过转化（transformation）过程导入。可以将细胞与质粒DNA共同置于0⁰C的氯化钙溶液中，然后迅速转到37~43⁰C予以刺激，使宿主细胞接纳DNA。或者，与质粒DNA一起孵育的细胞用高压脉冲加以刺激，这种方法称为电穿孔法（electroporation），能在短时间让大分子进入细胞。筛选：无论用何种方法，实际上只有少量细胞可接纳质粒DNA，所以需要对这些细胞进行筛选。常用的方法是：保证质粒含有一个宿主细胞在特定情况下生长所需的基因，例如，一个能使细菌对抗生素抵抗的基因。最常用的抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（cmr）及卡那霉素抗性基因（kanr）。只有被转化过的、含有重组质粒的细胞才可以在这种抗生素存在的环境下生长，这样利用抗生素就可以筛选出含这些质粒的细胞。这种基因有时被称为选择性标记基因。（二）噬菌体(bacteriophage)λ噬菌体可以十分有效地将其48502bp的DNA导入细菌内，因此可用来克隆相对较大的DNA片段。它的两个重要特征有利于这方面的应用：1.在整个λ噬菌体基因组中，大约1/3的染色体DNA序列对于噬菌体的复制和装配来说是非必需的，因此可用外源DNA来取代它们。此时，λ噬菌体携带外源DNA一起增殖，起到载体的作用。2.只有介于40000-53000bp之间的DNA才能被包装成为有感染性的噬菌体颗粒，这一限制可使得仅仅那些重组DNA被包装。以λ噬菌体载体克隆DNA图解（三）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome）细菌人工染色体（BAC）是专门为了克隆大片段DNA而设计的简单质粒。这个质粒只包含选择性标记如氯霉素抗性（CmR）)和一个非常稳定的复制原点（ori），用于保证每个细胞中有1~2个拷贝。可将长达数百万碱基对的DNA片段克隆到BAC载体中，然后用电穿孔的方法将大的环状DNA导入到宿主菌中。用于重组BAC的宿主菌细胞壁成分产生了突变，从而使得摄取大分子DNA变得容易。利用细菌人工染色体（BAC）克隆三、基因的分离从事一项基因工程，通常总要先获得目的基因。利用限制酶切割生物基因组DNA，然后用适当方法常可分离到所需要的基因片段。倘若基因的序列是已知的，可以用化学方法合成，或者用聚合酶链式反应(PCR)由模板扩增出该基因。此外，最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因文库（genomiclibrary)或cDNA文库（cDNAlibrary），从中筛选出目的基因的克隆。（一）基因文库的构建大致可分为五个步骤：1.染色体DNA的片段化2.载体DNA的制备3.体外连接与包装4.重组噬菌体感染大肠杆菌5.基因文库的鉴定和扩增（二）cDNA文库的构建构建cDNA文库的基本步骤与上述基因文库的构建十分相似1.首先从特定个体或细胞中提取mRNA2.以mRNA为模板通过逆转录酶合成互补DNA（complementaryDNA,cDNA）3.制备载体DNA4.双链cDNA的分子克隆5.对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。（三）克隆基因的分离与鉴定1.基于载体特征的直接选择2.细菌菌落或噬菌斑的原位杂交3.PCR法4.免疫化学法5.受体／配体的结合性质6.Southwestern/Northwestern印迹法7.DNA限制性内切酶图谱分析法8.DNA序列分析法从一个庞大的克隆文库中分离出感兴趣的基因，这是一项难度很大、费时费力的工作。基于载体的特征或目的基因的序列或基因的产物，已经发展出一系列行之有效的方法：（四）特定DNA序列的扩增如果知道特定基因的部分序列，则可通过聚合酶链式反应（polymerasechainreaction;PCR)大量扩增该基因的拷贝。PCR是体外酶促扩增，故又称