12DNA的复制修复与重组DNA技术公开课一等奖课件省赛课获奖课件

第十二章DNA的复制、修复与重组转录翻译复制遗传信息的传递遗传信息的体现

分子生物学中心法则(centraldogma)1958年Crick

1970年Temin和Baltimore

DNARNA蛋白质

转录翻译逆转录复制第一节DNA复制的原则半保存复制(semiconservativereplication)半不持续复制(semi-discontimuousreplication)RNA引物复制起始点和复制方向一、半保存复制定义：亲代DNA分子的两条链能够分别作为模板，按碱基互补配对原则，指导DNA新链的合成。新合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代DNA分子完全同样，但一条链来自亲代DNA链，另一条链是新合成的DNA链。二、半不持续复制5`3`3`5`3`5`5`5`3`3`5`3`3`5`定义：DNA复制时，一条链是持续复制，另一条链是不持续复制，称半不持续复制。前导链(leadingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向持续不停地合成的DNA链。随从链(laggingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向不持续合成的DNA链。冈崎片段（Okazakifragment）：后随链上不持续合成的1000～2000或100～200个核苷酸构成的DNA小片段。三、RNA引物定义：DNA复制时，子链5`端的一段寡聚核糖核苷酸链，能为DNA聚合酶提供聚合新的脱氧核糖核苷酸所需的3`OH，最后可被切除。意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的3`OH确保复制起始部位的真实性3`5`DNA模板3`5`DNA模板RNA引物5`OH-3`RNA引物5`OH-3`3`引物酶（RNA聚合酶）第二节参加DNA复制的某些酶类和蛋白质一、原核生物大肠埃希菌的DNA聚合酶1、DNA聚合酶Ⅰ（Kornberg酶）发现:1955年Arshur.Kornberg（阿瑟.康恩伯格）1959年诺贝尔生理和医学奖活性:大片段5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性小片段5`→3`外切酶活性5`→3`外切5`→3`聚合3`→5`外切N`C`大片段Klenow片段小片段罗杰.科恩伯格接受父亲（左）的祝贺

TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"RogerD.Kornberg罗杰.科恩伯格5`→3`外切酶活性功效：切除RNA引物切除突变片段，在DNA损伤修复中起作用5`→3`聚合酶活性

功效：弥补片段切除后的空缺3`→5`外切酶活性TＧＣＡＣＡＴＡＡＣＧＴＧＴＡＣ5`3`5`3`T功效：校读功效（proofreading）意义：确保DNA复制的高度真实性

DNA聚合酶Ⅰ多功效酶Klenow片段惯用的工具酶5`3`3`5`2、DNA聚合酶Ⅱ活性：5`→3`聚合酶活性3`→5`外切酶活性功效：不确切

3、DNA聚合酶Ⅲ构成：多亚基复和物全酶

核心酶（αεθ）×2

连接二聚体（τ2）

单个运载夹钳复合物（γ2δδ`χψ）

β4

ααττεεθθδδ`γ2ψχββββ功效：α亚基—5`→3`聚合ε亚基—3`→5`外切τ亚基—连接γ2δδ`χψ亚基复合物—钳夹β亚基—钳夹、滑动

特点：高续进性（≥50万个脱氧核糖核苷酸）高效性（≈1000个脱氧核糖核苷酸/秒）高保真实性（校读功效）二、真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：α、β、γ、δ、ε五种功效：DNA聚合酶α—聚合随从链DNA聚合酶δ—聚合前导链（协同增殖细胞核抗原PCNA）DNA聚合酶γ—聚合线粒体DNADNA聚合酶β、ε—校读功效、参加DNA损伤修复三、解链、解旋酶类和蛋白质（大肠杆菌E.coli）1、DNA解链酶功效：解开DNA双链条件：需要ATP供能，2个ATP/对碱基2、单链DNA结合蛋白功效：维持模板单链状态保护模板不受核酸酶水解DNA拓扑异构酶Ⅰ功效：临时切断双链中的一股，另一股链旋转通过该缺口，张力下降后，再连接缺口DNA拓扑异构酶Ⅱ功效：临时切断双链中的两股，断端旋转，张力下降后，再连接缺口条件：需要ATP供能3、DNA拓扑异构酶4、引发体组分：DnaA识别并结合至复制起始部位DnaB解链酶作用DnaC协助DnaB结合至复制起始部位引物酶RNA聚合酶，合成RNA引物5、连接酶功效：催化两段DNA链间形成3`5`磷酸二酯键特点：只能催化双链DNA链上的一股或两股链的连接5`5`3`3`5`5`3`3`3`5`5`5`5`5`3`3`3`3`第三节DNA复制过程（大肠埃希菌）模板：单链DNA引物：RNA引物原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）聚合酶：DNA聚合酶辅助因子：Mg2＋其它：酶和蛋白因子方向：5`→3`一、复制的起始1、复制起始部位oriC单一：原核生物普通只有一种复制起始点特定：高度保守序列GATCTNTTNTTTTDnaA结合位点

真核生物有多个复制起始点GATCTNTTNTTTTTTATCCACADnaADnaADnaADnaADnaA:结合至oriC的4个DnaA结合位点，形成起始复合物作用于oriC的3个13bp序列，DNA在此处解链，形成开放型起始复合物DnaC:DnaB:解开复制起始部位的DNA双链协助DnaB结合至复制起始部位单链结合蛋白：稳定并保护已解开的DNA单链引物酶：RNA聚合酶，合成RNA引物维持模板单链状态2、复制方向双向复制复制眼（泡）：DNA复制时，局部解开DNA的双链，在电镜下呈眼泡状突起复制叉：DNA复制时，局部DNA双链解开，在复制迈进部位两侧形成的Y型或叉状构造真核生物DNA复制原核生物DNA复制二、复制的延长DNA拓扑异构酶解旋DNA聚合酶Ⅲ

催化3`5`磷酸二酯键形成，聚合DNA新链复制叉前进“前导链和随从链同时同方向合成”问题的解决——随从链摸板围绕二、复制的终止DNA聚合酶Ⅰ切除引物弥补空缺5`3`3`3`3`5`5`5`DNA连接酶连接前后两个片段间的缺口5`3`3`3`3`5`5`5`四、真核生物端粒DNA的复制1、端粒：真核生物线性DNA的两个末端构造：由数百个串联排列的GT丰富的寡聚核苷酸序列构成人(AGGGTT)n四膜虫(GGGGTT)n功效：维持染色体DNA的稳定性2、端粒酶：避免端粒缩短的一种逆转录酶构成：由RNA和蛋白质构成蛋白质—DNA聚合酶RNA—模板唯一携带RNA模板的逆转录酶功效：复制端粒序列，避免端粒缩短。

机制：端粒、端粒酶与肿瘤：生殖细胞、干细胞：端粒酶活性保持体细胞：端粒酶活性下降，正常衰老现象恶性肿瘤细胞：端粒酶的活性恢复，使细胞永生化，形成恶性增殖1994年，Couter人卵巢细胞端粒酶体现1997年，人端粒酶基因克隆85%肿瘤细胞中端粒酶活性升高第四节DNA的损伤与修复一、DNA损伤的因素1、自发因素环境中溶剂分子随即热碰撞N-糖苷键断裂，A、G脱落磷酸戊糖碱基2、物理因素紫外线电离辐射共价交联，嘧啶二聚体单（双）链断裂，碱基脱落破坏，分子交联，脱氧核糖破坏3、化学因素亚硝酸盐CU二、DNA损伤的类型1、点突变转换同型碱基颠换异型碱基调控序列影响基因体现编码序列故意突变—变化蛋白质功效无意突变—个别氨基酸变化，蛋白质功效不变静止突变—个别碱基变化，氨基酸不变镰刀型红细胞贫血N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu…….-C

N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu…….-C

5`-***.***.***.***.***.CTC.***………-3`5`-***.***.***.***.***.CAC.***………-3`2、缺失一种核苷酸、一段核苷酸、一种基因Lesch-Nyhan`s综合症次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因丢失3、插入一种碱基、一段核苷酸芳香族分子等移码突变4、倒位二、DNA损伤的修复机制1、光修复机制低等生物解聚嘧啶二聚体不需要光复活酶

需要光复活酶2、切除修复机制（暗修复）全部生物切割3`5`磷酸二酯键（扩创）、弥补、连接UV特异的核酸内切酶着色性干皮病

②AP特异的核酸内切酶③

DNA聚合酶I（5`→3`外切）PPPPOOOO5`3`④

DNA聚合酶I（5`→3`聚合）3、碱基切除修复机制①DNA糖苷酶⑤

DNA连接酶①切割错误碱基→②切割3`5`磷酸二酯键→③切除、弥补→④连接DNA糖苷酶：特异识别一种DNA分子中变化的碱基，并水解该碱基与脱氧核糖间的糖苷键,形成AP位点。AP特异的核酸内切酶：切割3`5`磷酸二酯键DNA聚合酶I：切除损伤链，弥补缺口连接酶：连接切口为什么构成DNA是ATCG，而构成RNA是AUCG？尿嘧啶-DNA糖苷酶的发现尿嘧啶

胸腺嘧啶5`C甲基化5`C去甲基“分辨正常的尿嘧啶与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶”的需要455111复制的真实性1、半保存复制2、碱基互补配对原则3、RNA引物4、DNA聚合酶：校读功效5、端粒与端粒酶6、DNA的损伤修复机制7、尿嘧啶-DNA糖苷酶DNA（T）RNA（U）第五节重组DNA技术1、DNA重组：指两个DNA分子之间，或一种DNA分子的两个不同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，变化了基因的组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA分子间。

2、DNA重组技术：在实验室内，用人工办法将不同来源的DNA分子拼接成一种重组(recombinant)DNA分子，并将其引入活细胞内，使其大量复制或体现，这种技术称为DNA重组技术或基因工程