2025年生化实战测试题及答案

2025年生化实战测试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.新型热启动Taq酶通过抗体可逆结合活性中心实现温度调控，其最适激活温度通常为：A.55℃B.72℃C.95℃D.68℃2.某酶促反应在底物浓度远低于Km时，加入竞争性抑制剂后，其动力学参数变化为：A.Vmax降低，Km不变B.Vmax不变，Km增大C.Vmax增大，Km降低D.Vmax降低，Km减小3.用于检测细胞内特定mRNA表达水平的原位杂交技术中，探针标记物首选：A.放射性同位素³²PB.荧光素FITCC.生物素-链霉亲和素系统D.地高辛半抗原4.合成生物学中构建人工代谢途径时，为避免中间产物积累毒性，通常采用的策略是：A.过表达速率限制酶B.引入动态调控元件（如转录调控开关）C.敲除竞争途径关键酶D.提高宿主菌膜通透性5.新型冠状病毒变异株刺突蛋白S1亚基N端结构域（NTD）出现K417N突变，为验证该突变是否影响与宿主受体ACE2的结合，最直接的实验方法是：A.酵母双杂交B.表面等离子共振（SPR）C.免疫共沉淀（Co-IP）D.荧光素酶报告基因检测6.工业发酵生产L-谷氨酸时，若发酵液pH持续低于6.0且菌体生物量异常升高，最可能的原因是：A.溶氧不足导致乳酸积累B.生物素添加过量促进菌体生长C.磷酸缓冲体系失效D.谷氨酸脱羧酶被激活7.蛋白质晶体学中，使用同步辐射X射线衍射收集数据时，晶体冷冻保护剂的主要作用是：A.防止晶体脱水B.减少辐射损伤C.提高衍射分辨率D.增强晶体对称性8.基因编辑技术中，CRISPR-Cas12a相较于Cas9的优势不包括：A.切割后产生粘性末端B.对PAM序列要求更宽松（TTTV）C.可同时加工多个gRNA前体D.脱靶率更低9.检测环境样本中未知病原微生物时，宏基因组测序（mNGS）的关键步骤不包括：A.样本核酸提取（去除宿主DNA/RNA）B.随机引物扩增C.数据库比对（如NCBIRefSeq）D.荧光定量PCR验证10.酶联免疫吸附试验（ELISA）中，若包被抗原浓度过高导致非特异性结合增强，应采取的优化措施是：A.延长封闭时间B.降低包被缓冲液pHC.减少洗涤次数D.稀释抗原至线性范围11.原核生物转录终止时，ρ因子的作用机制是：A.识别终止子发夹结构并水解ATP解离转录复合物B.与RNA聚合酶α亚基结合终止延伸C.结合mRNA3’端poly(A)尾阻碍核糖体结合D.促进RNA-DNA杂合链解旋12.蛋白质定向进化实验中，为提高突变库多样性，常用的方法是：A.易错PCR（error-pronePCR）B.重叠延伸PCR（SOE-PCR）C.反向PCR（reversePCR）D.实时定量PCR（qPCR）13.生物安全三级实验室（BSL-3）操作高致病性病原微生物时，必须配备的防护设备是：A.正压防护服B.Ⅱ级生物安全柜C.自动高压灭菌器D.紫外消毒灯14.代谢组学研究中，气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析前处理需对样品进行衍生化，主要目的是：A.提高挥发性和热稳定性B.增强离子化效率C.增加色谱保留时间D.减少基质干扰15.单克隆抗体制备过程中，杂交瘤细胞筛选常用HAT培养基，其作用机制是阻断：A.嘌呤从头合成途径B.嘧啶补救合成途径C.氨基酸转运D.糖酵解关键酶二、简答题（每题8分，共40分）1.简述WesternBlot实验中“转膜”步骤的关键参数控制及失败原因分析。2.设计实验验证某新型抗菌肽（AMP）的作用机制是破坏细菌细胞膜完整性（要求写出实验方法、预期结果及对照组设置）。3.比较原核生物（大肠杆菌）与真核生物（酵母）在DNA复制起始阶段的差异（从起始位点识别、参与蛋白、复制叉数量三方面回答）。4.某实验室保存的质粒pET-28a（含T7启动子、Kan抗性基因）出现降解，电泳显示条带模糊且有弥散，分析可能原因并提出解决方案。5.解释“代谢工程中的途径平衡”概念，并举例说明如何通过基因表达调控实现平衡（要求具体到调控元件和操作方法）。三、案例分析题（每题15分，共30分）案例1：2025年3月，某生物制药厂在生产重组人促红细胞提供素（rhEPO）时，发现发酵液中目标蛋白表达量仅为预期的30%，且SDS显示条带位置略高于标准品（标准品分子量约34kDa，检测条带约36kDa）。经检测，工程菌（CHO细胞）生长曲线正常，培养基成分无异常。（1）分析可能导致表达量低的原因（至少3点）；（2）推测条带偏移的可能机制；（3）提出验证条带偏移原因的实验方案（要求具体技术手段）。案例2：某边境口岸检测到一批来自热带地区的冷冻海产品，样本经初步检测显示细菌总数超标（10⁷CFU/g），且16SrRNA测序提示存在未知革兰氏阴性菌（与已知致病菌株同源性78%）。需完成以下任务：（1）设计该未知菌的生物安全风险评估流程（包括关键指标）；（2）若需确定其是否为新病原体，应进行哪些实验验证（要求结合柯赫法则）；（3）提出样本运输及实验室操作的生物安全防护要求（依据WHO《实验室生物风险管理手册》）。答案--一、单项选择题1.C（热启动酶通常在95℃变性阶段抗体解离，激活酶活性）2.B（竞争性抑制剂与底物竞争活性中心，Km增大，Vmax不变）3.D（地高辛半抗原无内源性干扰，检测灵敏度高，适用于原位杂交）4.B（动态调控元件可根据中间产物浓度自动调节酶表达，避免积累）5.B（SPR可实时监测分子间结合动力学，直接测定亲和力）6.B（生物素过量促进菌体生长，消耗更多碳源用于细胞增殖而非谷氨酸合成）7.B（冷冻至-173℃可显著降低X射线引起的自由基损伤）8.D（Cas12a脱靶率与Cas9无显著差异，优势在于粘性末端和多gRNA加工）9.B（mNGS无需扩增，直接测序避免偏好性）10.D（抗原浓度过高会导致包被过饱和，非特异性结合增加，需稀释至线性范围）11.A（ρ因子通过ATP酶活性沿RNA移动，解离RNA-DNA杂合链）12.A（易错PCR通过改变dNTP比例或添加Mn²+提高突变率）13.B（BSL-3必须使用Ⅱ级或Ⅲ级生物安全柜，正压防护服为BSL-4要求）14.A（衍生化（如硅烷化）可将极性代谢物转化为非极性，提高GC分离效率）15.A（HAT培养基中氨基蝶呤阻断从头合成，细胞需通过HGPRT（补救途径）合成嘌呤，未融合的骨髓瘤细胞缺乏HGPRT死亡）二、简答题1.转膜关键参数：电流/电压：湿转通常100V恒压1-2h，半干转15V恒压30-60min；时间：与蛋白分子量相关（大蛋白需延长时间）；缓冲液：含20%甲醇（促进蛋白与NC膜结合），pH8.3；膜类型：NC膜（低分子量）或PVDF膜（高分子量，需甲醇活化）。失败原因：条带模糊：电流过大导致产热，蛋白扩散；转膜不全：分子量＞100kDa未用高分子量转膜缓冲液（含SDS）；膜上无条带：膜与胶方向颠倒（胶在阴极，膜在阳极）；背景高：缓冲液甲醇浓度过高（＞25%）导致胶收缩，蛋白滞留。2.实验设计：（1）方法：荧光染色法：将细菌与AMP共孵育，加入碘化丙啶（PI，膜完整时不能进入）和SYTO9（膜完整时着色），流式细胞术检测PI阳性率；电镜观察：透射电镜观察细菌细胞膜是否出现孔洞、破裂；胞内物质泄漏检测：测定上清液中核酸（260nm吸光值）或ATP含量（荧光素酶法）。（2）预期结果：AMP处理组PI阳性率、260nm吸光值及ATP含量显著高于未处理对照组（P＜0.05），电镜可见膜结构破坏。（3）对照组：阴性对照：未加AMP的细菌悬液；阳性对照：加入已知膜破坏剂（如十二烷基硫酸钠SDS）的细菌悬液。3.复制起始差异：（1）起始位点识别：大肠杆菌识别OriC（含3个13bp重复序列和4个9bp重复序列），由DnaA蛋白结合；酵母识别ARS（自主复制序列，含A/T富集区和B1-B3元件），由ORC（复制起始复合物）结合。（2）参与蛋白：大肠杆菌需DnaA（识别位点）、DnaB（解旋酶）、DnaC（加载解旋酶）；酵母需ORC、Cdc6、Cdt1（加载Mcm解旋酶）。（3）复制叉数量：大肠杆菌单一起始位点，双向复制形成2个复制叉；酵母多个起始位点（约400个），每个位点形成2个复制叉，总复制叉数量＞800。4.质粒降解原因及解决：（1）可能原因：核酸酶污染：操作过程中未戴手套，引入外切酶（如DNaseI）；保存条件不当：-20℃反复冻融导致断裂；质粒自身结构不稳定：含重复序列或插入片段过大（＞10kb）易发生重组；转化用感受态细胞未灭活核酸酶：如使用未处理的大肠杆菌JM109（含endA1基因，编码内切酶）。（2）解决方案：优化操作：使用无核酸酶的枪头、离心管，操作前用75%乙醇擦拭台面；保存质粒：小份分装（5-10μL/管），避免反复冻融；更换宿主菌：使用endA1缺陷型菌株（如DH5α、Top10）；若为结构不稳定，改用低拷贝质粒（如pSC101）或删除重复序列。5.代谢途径平衡：指通过调控不同酶的表达水平，使代谢流在各分支途径中分配合理，避免前体积累或产物不足。举例：在大肠杆菌合成番茄红素的途径中，上游途径（MEP途径）的关键酶Dxs（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶）和下游途径（八氢番茄红素合成酶CrtB、八氢番茄红素脱氢酶CrtI）需协调表达。可通过以下方法调控：启动子工程：为Dxs基因更换弱启动子（如J23106，强度为100），为CrtB和CrtI更换强启动子（如J23101，强度为1000），避免上游代谢物（IPP、DMAPP）积累；核糖体结合位点（RBS）优化：通过RBS计算器调整CrtB和CrtI的RBS序列，使翻译效率匹配；动态调控：引入基于中间产物（如FPP）的转录调控开关（如LacI/IPTG系统），当FPP浓度过高时抑制Dxs表达，降低上游代谢流。三、案例分析题案例1：（1）表达量低的可能原因：①目的基因转录效率低：T7启动子突变或宿主细胞（CHO）中T7RNA聚合酶表达量不足（需确认是否共转染T7聚合酶基因）；②翻译水平抑制：mRNA二级结构过强（如5’UTR存在稳定茎环）阻碍核糖体结合；③蛋白分泌障碍：信号肽（如EPO天然信号肽）与CHO细胞分泌系统不兼容，导致蛋白滞留内质网；④蛋白酶降解：目标蛋白在胞内或培养基中被CHO细胞分泌的蛋白酶水解（可通过添加蛋白酶抑制剂验证）。（2）条带偏移机制：可能是糖基化异常。rhEPO为糖蛋白（糖链占比约40%），正常含3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点。若CHO细胞中糖基转移酶（如β-1,4-半乳糖转移酶）表达不足，可能导致糖链延长不完全（如唾液酸添加减少），分子量增加（异常糖链可能更大或电荷改变影响电泳迁移率）。（3）验证实验方案：①糖基化检测：使用PNGaseF（N-糖基化酶）处理样品，SDS观察条带是否恢复至34kDa（若恢复，说明N-糖基化异常）；②质谱分析：通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析糖肽，确定糖链组成（如唾液酸、半乳糖含量）；③实时定量PCR：检测CHO细胞中糖基转移酶（如ST3GAL3，唾液酸转移酶）的mRNA表达水平，与正常细胞对比；④免疫荧光：用抗唾液酸抗体（如SNA，识别α2,6-连接唾液酸）标记细胞，观察高尔基体中糖链修饰情况。案例2：（1）生物安全风险评估流程：①基本特性分析：革兰氏染色（确认阴性）、生长条件（需氧/厌氧、最适温度）、生化反应（氧化酶、触酶、API20E鉴定）；②毒力因子检测：PCR筛查已知毒力基因（如内毒素LPS合成基因、Ⅲ型分泌系统基因）、全基因组测序（WGS）预测毒力岛；③感染性实验：使用模式生物（如斑马鱼、小鼠）进行半数致死量（LD50）测定，观察病理损伤；④传播途径评估：检测是否通过消化道、呼吸道或接触传播（如菌毛、粘附素基因分析）；⑤防控难度：评估对抗生素敏感性（药敏试验）、环境存活能力（干燥/低温下存活时间）。（2）新病原体验证（柯赫法则）：①从患病宿主（若有）中分离该菌，纯培养；②将纯培养物接种健康模式生物（如小鼠），观察是否出现相同症状；③从接种后发病的生物体内重新分离该菌，确认与原菌形态、基因一致；④补充分子柯赫法则：敲除推测的毒力基因后，菌株致病性消失；恢复该基因后，致病性恢复（需构建基因敲除株）。（3）生物安全防护要求：①样本运输：使用三层包装（主