CN116637236B 一种具有ros响应性聚多巴胺-柚皮素涂层的钛基材料及其制备方法和应用 （重庆大学）

(19)国家知识产权局(12)发明专利(45)授权公告日2025.07.01(21)申请号202310603137.5(22)申请日2023.05.25(43)申请公布日2023.08.25(72)发明人胡燕陈茂华蔡开勇罗忠限公司11275A61L31/02(2006.01)A61L31/10(2006.01)A61L31/08(2006.01)A61L31/14(2006.01)一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料及其制备方法和应用本发明涉及一种具有ROS响应性聚多巴胺/是在氨基化的钛片表面依次包覆络合Zn0的DNA巴胺/柚皮素涂层的钛基材料(Ti/DNFzn/PDA-Nar)能够在骨质疏松的高ROS环境中驱动内皮细21.一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料，其特征在于，所述钛基材料所述络合ZnO的DNF是由DNA纳米花和氨基功能化的Zn0量子点通过静定吸附作用得到，其中DNA纳米花是SEQIDNO.1的碱基序列经过n次循环扩增后与x个SEQIDNO.3的核酸适60～95℃下保持10～30min,使T4DNA连接酶失活，缓慢降温到10～30℃后加入三磷酸脱氧核苷和phi29DNA聚合酶，在10～30℃下反应6～12h后在80～95℃下加热10～20min使phi29DNA聚合酶失活，然后以8000～12000rpm的转速离心，用去离子水清洗沉淀两遍得到DNA纳米颗粒；最后将DNA纳米颗粒和具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体分散在去离子水其中所述DNA模板是在碱基序列为SEQIDNO.1的5端连接磷酸基团，所述RCA扩增的引物的碱基序列如SEQIDNO.2所述，所述DNA纳米颗粒是SEQIDNO.1的碱基序列经过n次循环扩增后形成，其中n为大于等于1的整数，所述具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所述。所述DNA纳米颗粒和具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体的摩尔比为1:20～1:50。4.根据权利要求1所述的钛基材料，其特征在于，所述氨基功能化的Zn0量子点按照如下方法制备：将二水合醋酸锌超声分散于甲醇中，边搅拌边滴加氢氧化钾的甲醇溶液，搅拌离心，收集沉淀，用甲醇溶液清洗颗粒两次即可得到Zn0量子点，继续将Zn0量子点分散在乙醇中，加入氨丙基三乙氧基硅烷溶液后进行回流反应，用乙醇清洗两次以后真空干燥即可得到氨基功能化的Zn0量子点。5.根据权利要求4所述的钛基材料，其特征在于，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.2～0.45M,所述二水合醋酸锌和氢氧化钾的甲醇溶液的质量体积比为0.9~所述搅拌离心中搅拌时间为1～3h、离心的转速为8000～12000rpm;所述氨丙基三乙氧基硅烷溶液中氨丙基三乙氧基硅烷的质量浓度为1～3%,所述Zn0量子点与氨丙基三乙氧基硅烷溶液中的氨丙基三乙氧基硅烷溶液的质量比为0.5～1:1~所述回流反应的温度为100～120℃、时间为6～10h。6.权利要求1～5任一项所述钛基材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)制备络合ZnO的DNF:将DNA纳米花和氨基功能化的Zn0量子点分散在去离子水中，振荡反应过夜，然后以8000～12000rpm的转速离心，收集沉淀即可得到络合Zn0的DNF;(2)制备Ti/DNFzn:将氨基化的钛片浸泡在含有络合ZnO的DNF的溶液中过夜，通过静电相互作用在氨基化的钛片表面吸附大量的DNFzn得到Ti/DNFzn;3(3)制备表面具有ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层的太极材料：将所述Ti/DNFzn润洗烘干后浸泡在含有ROS响应的多巴胺单体和柚皮素的Tris溶液中过夜，用去离子冲洗干净即可得到表面具有ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA纳米花和氨基功能化的Zn0量子点的质量比为1:100～1:600;步骤(2)中，所述含有络合Zn0的DNF的溶液的溶8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述润洗烘干具体为：用去离子水反复后用N₂烘干；所述Ti/DNFzn、ROS响应的多巴胺单体和柚皮素的摩尔比为1:2～1:5;9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述ROS响应的多巴胺单体的结构式10.权利要求1～5任一项所述钛基材料在制备骨植入材料中的应用。4一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于太极材料的制备技术领域，涉及一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料及其制备方法和应用。背景技术[0002]钛及其合金由于良好的生物相容性被广泛的用于外科手术。然而，由于一些骨退行性疾病引起的成骨能力降低，骨组织和植入材料之间的骨整合不足是导致骨科手术失败的主要原因。大量表面改性策略被用来增加骨组织和植入材料之间的骨整合(例如：等离子喷涂、磁控溅射以及层层自组装等),这些改性方式的目的主要是为了增加骨相关细胞的成骨分化。然而，这些简单的改性方式在骨质疏松病理条件下的应用非常有限，因为骨质疏松患者的成骨细胞活性低，破骨细胞活性强。因此，临床上急需开发出一种能提高骨质疏松患者骨整合的钛表面改性手段。[0003]骨骼系统中含有大量高度分化的H型血管，为骨骼中的所有细胞提供氧气、营养、激素和生长因子，同时移除细胞的代谢废物。更重要的是，H型血管可输送多种促成骨信号因子至损伤部位，调节血管周围成骨祖细胞的成骨分化，加速管数量以及成血管相关的HIF-1α、VEGF等因子表达显著减少。研究证实在骨折修复过程中增加H型血管的丰富度能有效促进骨折愈合，可能与H型内皮细胞和周围的前成骨细胞之间密切交流相关，这为骨质疏松性骨折相关疾病治疗提供了一个新的靶点。[0004]NO是内皮细胞一氧化氮合成酶产生的一种气体自由基，也是多种生理反应中普遍计了一种细胞状纳米颗粒缓释NO和分泌因子的系统，以达到协同促进血管形成的目的。Chai等人证明，STING信号通路的激活会持续刺激损伤位点的炎症反应，阻碍H型血管形成，从而进一步延缓骨愈合，由此提供了一个新的视角，抑制SITNG的表达来促进H型血管形成。最近几十年，DNA纳米技术飞速发展，目的基因转录后修饰为制备智能控释材料提供了新的(如Zn²+、Ca²+、Mg²+等离子)存在时精确清除目的基因或者模拟一些核酸酶的功能，根据的DNAzyme(dDNAzyme)、具有连接酶功能的DNAzyme、过氧化物酶活力的DNAzyme和修饰胸腺上的应用。受到DNA扩增技术的启发，滚环扩增可以围绕环状模板DNA扩增出一段长的具有该纳米花不仅能促进细胞内吞还能抵抗生理环境中核酸酶的降解。[0005]基于此，有必要结合RCA技术及静电组装作用研究在钛材表面构建DNAzyme纳米花结构，显著降低STING的蛋白表达，依次来解决骨质疏松性骨折部位H型血管丰度低的问题，5有效促进了植入体的骨整合效率。发明内容[0006]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料；本发明的目的之二在于提供一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料在制备骨植入材料中的应用。[0007]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：[0008]1.一种具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料，所述钛基材料从内到外依次包括氨基化的钛片、络合Zn0的DNF(DNFzn)以及ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层[0009]所述络合ZnO的DNF(DNFzn)是由DNA纳米花(DNF)和氨基功能化的Zn0量子点通过静定吸附作用得到，其中DNA纳米花(DNF)是SEQIDNO.1的碱基序列经过n次循环扩增后与x个SEQIDN0.3的核酸适配体络合形成，其中n、x[0010]优选的，所述DNA纳米花(DNF)按照如下方法制备：将5'端磷酸化的DNA模板、T4DNA连接酶和RCA扩增的引物置于10～30℃下反应过夜；然后在60～95℃下保持10～30min,使T4DNA连接酶失活，缓慢降温到10～30℃后加入三磷酸脱氧核苷(dNTP)和phi29DNA聚合酶，在10～30℃下反应6～12h后在80～95℃下加热10～20min使phi29DNA聚合酶失活，然后以8000～12000rpm的转速离心，用去离子水清洗沉淀两遍得到DNA纳米颗粒；最后将DNA纳米颗粒和具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体(Apt)分散在去离子水中，在55～65℃下加热10～30min后缓慢降至室温，得到DNA纳米花(DNF[0011]其中所述DNA模板是在碱基序列为SEQIDNO.1的5端连接磷酸基团，所述RCA扩增的引物的碱基序列如SEQIDNO.2所述，所述DNA纳米颗粒是SE次循环扩增后形成，其中n为大于等于1的整数，所述具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体(Apt)的核苷酸序列如SEQIDN0.3所述。酸脱氧核苷、phi29DNA聚合酶的比例为5～10:20～40:10～20:1～5:1～5,μM:U/μL:μM:[0014]优选的，所述氨基功能化的Zn0量子点按照如下方法制备：将二水合醋酸锌超声分散于甲醇中，边搅拌边滴加氢氧化钾的甲醇溶液，搅拌离心，收集沉淀，用甲醇溶液清洗颗粒两次即可得到Zn0量子点，继续将Zn0量子点分散在乙醇中，加入氨丙基三乙氧基硅烷溶液(APTES)后进行回流反应，用乙醇清洗两次以后真空干燥即可得到氨基功能化的Zn0量子[0015]进一步优选的，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.2～0.45M,所述二水合醋酸锌和氢氧化钾的甲醇溶液的质量体积比为0.9～2.0:10～20,g:mL;[0016]所述搅拌离心中搅拌时间为1～3h、离心的转速为8000～12000rpm;[0017]所述氨丙基三乙氧基硅烷溶液中氨丙基三乙氧基硅烷的质量浓度为1～3%,所述6Zn0量子点与氨丙基三乙氧基硅烷溶液中的氨丙基三乙氧基硅烷溶液的质量比为0.5～1:1~3g:mL;[0018]所述回流反应的温度为100～120℃、时间为6～10h。[0019]2.上述钛基材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：[0020](1)制备络合Zn0的DNF(DNFzn):将DNA纳米花(DNF)和氨基功能化的Zn0量子点分散在去离子水中，振荡反应过夜，然后以8000～12000rpm的转速离心，收集沉淀即可得到络[0021](2)制备Ti/DNFzn:将氨基化的钛片浸泡在含有络合ZnO的DNF(DNFzn)的溶液中过夜，通过静电相互作用在氨基化的钛片表面吸附大量的DNFzn得到Ti/DNFzn;[0022](3)制备表面具有ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层(PDA-Nar)的太极材料(Ti/DNFzn/PDA-Nar):将所述Ti/DNFzn润洗烘干后浸泡在含有ROS响应的多巴胺单体(TK-DA)和柚皮素的Tris溶液中过夜，用去离子冲洗干净即可得到表面具有ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层(PDA-Nar)的钛基材料(Ti/DNFzn/PDA-Nar)。[0023]优选的，步骤(1)中，所述DNA纳米花(DNF)和氨基功能化的Zn0量子点的质量比为[0024]步骤(2)中，所述含有络合ZnO的DNF(DNFzn)的溶液的溶剂为去离子水，所述含有[0026]所述Ti/DNFzn、ROS响应的多巴胺单体(TK-DA)和柚皮素的摩尔比为1[0027]所述Tris溶液中ROS响应的多巴胺单体的浓度为2.5～5mM、柚皮素的浓度为3.5~[0030]3上述钛基材料在制备骨植入材料中的应用。[0031]本发明的有益效果在于：本发明公开了一种表面具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料，主要是在氨基化的钛片表面依次包覆络合ZnO的DNF(DNFzn)和ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层(PDA-Nar)。本发明的钛基材料具有以下有点：(1)多巴胺单体和柚皮素中均含有苯环，可以与DNFzn的脱氧核糖通过π-π键堆积在DNFzn周围形成紧密的PDA-Nar涂层，该涂层可以使DNFzn和钛表面的结合更加牢固，延长DNFzn从钛表面释放的时间；(2)在骨质疏松性高ROS环境中，随着ROS响应性聚多巴胺(TK-PDA)涂层被破坏，柚皮素率先从涂层中释放出来刺激内皮细胞的的eNOS表达，增加NO产生，加强植入体周围的血管形成；(3)DNFzn从钛基材料上释放被内皮细胞吞噬，在溶酶体内被DNFzn中的dDNAzyme自我催化降低材料的表面电位，形成负电荷界面，这种带负电的骨材料植入损伤位点，可以跟周围的正常组织之间形成一个内源电场，驱动内皮细胞向材料表面迁移。总之，本发明表面具有7ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料(Ti/DNFzn/PDA-Nar)能够在骨质疏松的高ROS环境中驱动内皮细胞迁移，增加H型血管形成，通过H型内皮细胞和骨相关细胞的分子交流促进植入体周围的新骨形成。[0032]本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。附图说明[0033]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优[0034]图1为不同材料的透射电镜图，其中A为Zn0量子点的TEM图、B为Zn0量子点的选定区域电子衍射图、C为Zn0量子点的高分辨率TEM图像、D为DNF和DNFzn的TEM图像、E为DNFzn分析结果；[0035]图2为具有ROS响应性的连接小分子-两端氨基的缩硫酮(H₂N-TK-NH₂)(A)和含有ROS响应的多巴胺单体(TK-DA)(B)的400MHz核磁共振谱仪检测结果；[0036]图3为不同材料表面的扫描电镜图，其中对照组中的各种材料未经任何方式进行处理、超声组的各种材料经过超声处理；[0037]图4为柚皮素和DNFzn从Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar材料表面的释放情况测试，为Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar材料浸泡在不含H₂O₂的PBS缓冲液中、E和F分别为Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar材料浸泡在含H₂O₂的PBS缓冲液中的吸光值、G和H分别为Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar材料浸泡在不含H₂O₂的PBS缓冲液中的吸光值、I为不同材料中柚皮素(Nar)的随孵育时间变化释放率变化情况、J为不同材料中的DNFzn随孵育时间变化释放率变化情况；[0038]图5中A为Ti/DNFzn/PDA-Nar对内皮细胞血管形成的影响、B为生长在不同材料表面的内皮的分泌因子对成骨分化的影响；[0039]图6为通过免疫荧光染色检测不同材料(Ti、Ti/PDA-Nar、Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar)作为植入体周围H型血管标志蛋白CD31和EMCN的表达；[0040]图7为通过micro-CT观察骨质疏松症大鼠的骨骺端不同钛材料(Ti、Ti/PDA-Nar、植入体周围新骨形成量的统计图、C为植入体周围骨小梁数量的统计图、D为植入体周围骨小梁厚度的统计图。具体实施方式[0041]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实8施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。[0042]下列实施例中DNA模板是在碱基序列为SEQIDNO.1的5端连接磷酸基团即acgtctaacggatagatagtggagggtttgcctcgaaccctccacta[0043]RCA扩增的引物的碱基序列为SEQIDN0.2:ataccagctggtatctagttgagctgtctaa[0044]DNA纳米颗粒是SEQIDNO.1的碱基序列经过n次循环扩增后形成(其中n为大于等于1的整数);[0045]具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体的核苷酸序列为SEQIDN0.3:gatgtgagtgtgtgacgagctacgacgtctggtgtatttataaagacactgtgtatatcaacaaca[0046]DNA纳米花(DNF)是SEQIDNO.1的碱基序列经过n次循环扩增后与x个SEQIDNO.3的核酸适配体络合形成，具体为[(aactagataccagctggtatccttcaacgtctaacggatagatgacgtctggtgtatttataaagacactgtgtatatcaacaacagaacaaggaaagg)(其中于1的整数)。[0048]一种表面具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料，具体包括如下步骤：[0050]a.将0.9g二水合醋酸锌超声分散于甲醇中，边搅拌边滴加20mL氢氧化钾的甲醇溶液(该溶液中氢氧化钾的浓度为0.45M),搅拌1h后以12000rpm的转速进行离心，收集沉淀，用甲醇溶液清洗颗粒两次即可得到Zn0量子点，继续将0.5gZn0量子点分散在乙醇中，加入5mL氨丙基三乙氧基硅烷的溶液(APTES,其中氨丙基三乙氧基硅烷的质量分数为2%)后在120℃下回流反应6h,用乙醇清洗两次以后真空干燥即可得到氨基功能化的Zn0量子M)置于16℃下反应过夜；然后在65℃下保持10min,使T4DNA连接酶失活，从而达到讲5'磷酸化的链状DNA连接成环状，形成环状模板，缓慢降温到30℃后加入三磷酸脱氧核苷(dNTP,1mM)、phi29DNA聚合酶(1U/μL)和phi29DNA聚合酶缓冲液使总体积为50μL,在30℃下反应6h后在95℃下加热10min使phi29DNA聚合酶失活，然后以8000rpm的转速离心，用去离子水清洗沉淀两遍得到DNA纳米颗粒；最后将DNA纳米颗粒(10μM)和具有内皮细胞靶向功能的核酸适配体(Apt,50μM)分散在100μL去离子水中，在55℃下加热10min后缓慢降至室温，得[0052]c.按照1:100的质量比将DNA纳米花(DNF)和氨基功能化的Zn0量子点分散在去离子水中，振荡反应过夜，然后以8000rpm的转速离心，收集沉淀即可得到络合Zn0的DNF(DNFzn)。[0053]上述以环状DNA为模板制备DNF,该模板包括dDNAzyme(切割模板中DNA基序)及9颗粒，并利用碱基互补配对在DNA纳米颗粒表面修饰了能够靶向内皮细胞的核酸适配体射结果表明它是一个多晶结构，最明显的晶格条纹间距为0.26nm,这是ZnO的002晶面(如图生焦磷酸，它可以立即与缓冲液中的镁离子结合形成焦磷酸镁(Mg₂PPi)从而将长链的DNA用P元素作为DNFzn的标定，发现DNFzn被包裹在ROS响应性聚多巴胺(TK-PDA)中(如图1中H[0055]a.合成具有ROS响洗沉淀两次；接下来，将沉淀溶于甲醇中，然后在冰上加入过量的乙醚进行重结晶，以蒸发掉溶剂得到产物具有ROS响应性的连接小分子-两端氨基的缩硫酮(H₂N-TK-NH₂),其[0056]b.合成含有ROS响应的多巴胺单体(TK-DA):首先，取左旋多巴(13.9mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSC1,42.3mmol)溶解于20mL乙腈中，在0℃的条件下逐滴加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU,40mmol),室温搅拌24h后过滤，滤渣用甲醇/乙腈重结晶得到化合物1(反应效率为81%);其次，将化合物1加入10mL含有浓度为15.5mg/mL的基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC,1.2mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,1.2mmol)室温搅拌2h后加入上述制备的具有ROS响应性的连接小分子-两端氨基的缩硫酮(H₂N-TK-NH₂)烷萃取后用硅胶柱分离纯化，旋干得到化合物3(产率大约是57%);最后，取化合物3丁基氟化铵(TBAF),在0℃下反应4h,然后用硅胶柱分离纯化得到最终产物即为含有ROS响应的多巴胺单体(TK-DA),其400MHz核磁共振谱仪检测结果如图2中B所示。化合物1化合物2[0058]c.制备表面具有ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层(PDA-Nar)的钛基材料：首先，将干净钛片浸泡于HNO₃溶液中，60℃下水浴处理40min后用双蒸水充分冲洗表面残留的HNO₃,再将处理过的钛片用沸水煮1h使其表面的羟基充分活化得到羟基活化的钛片；其次，将羟基活化的钛片用N₂烘干后，浸泡于质量分数为1%的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液中，室温过夜后分别用无水乙醇和双蒸水超声清洗钛片，并用N₂吹干，得到氨基化的钛片；然后将氨基化的钛片(上表面的面积为2cm²)浸泡在含有络合Zn0的DNF(DNFzn)的溶液 (800μg/mL)中过夜，即可通过静电相互作用在氨基化的钛片表面吸附大量的DNFzn得到Ti/DNFzn,然后用去离子水润洗三次、N₂烘干后浸泡在含有ROS响应的多巴胺单体(TK-DA) (2.5mM)和柚皮素(3.5mM)的Tris溶液中过夜，用去离子冲洗干净即可得到表面具有ROS响应性的聚多巴胺/柚皮素涂层(PDA-Nar)的钛基材料(Ti/DNFzn/PDA-Nar)。[0059]图3为不同材料表面的扫描电镜图，其中对照组中的各种材料未经任何方式进行处理、超声组的各种材料经过超声处理。从图3可以看出，没经过任何处理的钛表面能看到很多明显的划痕，这是纯钛的加工打磨引起的。Ti/DNFzn组的钛表面观察到大量的DNFzn,均匀地分布在材料表面。DNFzn通过静电作用吸附在氨基化钛表面，但此时DNFzn和钛表面之间的结合还不太牢固。TK-PDA处理以后，钛材表面DNFzn周围观察到大量的小颗粒涂层。裹起来并进一步加强了DNFzn和钛表面之间结合的稳定性。用400W的超声波处理不同的钛材一个小时以后，通过SEM观察材料表面的形貌，结果表明超声处理对纯钛的表面结构没有任何影响，但Ti/DNFzn组材料表面的DNFzSEM图片可以看出超声波处理对材料表面的TK-PDA涂层没有显著影响，Ti/DNFzn/PDA-Nar组的DNFzn没有因为超声波的处理而从材料表面脱落，这可能是因为多巴胺可以在任何材料表面形成牢固的聚多巴胺涂层，从而阻止了DNFzn的脱落。11[0060]性能测试[0062]不同的钛基材料浸泡在含H₂O₂的PBS缓冲液或不含H₂O₂的PBS缓冲液中，分别在7、[0063]上清液被收集以后通过2%的琼脂糖凝胶电泳表征颗粒的降解情况，其结果如图4凝胶电泳的结果表明孵育液中的DNFzn没有明显的降解条带，在上样孔那里有大量没有移动的DNA,说明孵育液中的DNFzn仍然保持了完整的纳米花状结构。[0064]用Nanodrop定量检测释放的DNF含量，其结果如图4中E～H所示，其中E和F分别为Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar材料浸泡在含H₂O₂的PBS缓冲液中的吸光值，G和H分别为Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar材料浸泡在不含H₂O₂的PBS缓冲液中的吸光值。图4中J为不同材料中的DNFzn随孵育时间变化释放率变化情况，结合其中的定量分析的结果，将相应的吸光DNFzn大量从材料表面释放，累积释放量大约是1.53μg和1.48μg,浸泡14～28天的释放PBS缓冲液不能降解TK-PDA涂层，导致DNFzn一直被固定在钛材料表面，不能被释放到孵育[0065]通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和高效液相色谱(HPLC)检测从不同样品中释放出的Zn²+和柚皮素。柚皮素检测的流动相为甲醇和0.05%的磷酸(比例为45:55),检测波长为288nm,流速为1mL/min,柱温为30℃,检测结果如图4中I所示，从中可以看出柚皮素(Nar)的释放率随着孵育时间稳定增加，7天的时候累积释放量达到大约65μg。[0066]2、钛功能化界面调控内皮细胞的血管形成和干细胞的成骨分化[0067]选取实施例1中制备得到的样本，考察不同钛材料表面对内皮细胞血管形成的影响。将干净钛片(Ti)、Ti/PDA-Nar(该材料是将制备Ti/DNFzn/PDA-Nar时采用的Ti/DNFzn替[0068]人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接种在基质胶上，接种密度为5000个细胞/cm²,用前面收集的培养基培养细胞6h以后拍照记录，然后用ImageJ分析HUVECs的血管形成趋势细胞其结果如图5中A(图5中A的上排是原始图片；下排是用ImageJ做分管分析以后的图片，其中深蓝色圆点表示节点，深蓝色圆点周围的红圈表示连接，浅蓝色环代表血管网络，黄色环代表主节段，蓝色线代表不完整的血管片段，绿色线表示分支)所示生长在基质胶上的HUVECs提供Ti/DNFzn/PDA-Nar组的浸提液时，其管状网络形成能力最表明生长在基质胶上的HUVECs用Ti/DNFzn/PDA-Nar组的浸提液培养时，其形成的血管长度和节点数量也是最多。然而，Ti/PDA-Nar和Ti/DNFzn组的血管长度和节点数量没有明显区培养21天后检测MSCs的矿化结节形成情况，其结果如图5中B所示。从中可以看出，Ti/Ti/DNFzn和Ti/DNFzn/PDA-Nar)植入体周围新骨生成状况，其结果如图7所示，其中A为计图、D为植入体周围骨小梁厚度的统计图Ti/DNFzn/PDA-Nar材料的新生骨明显多于Ti、[0073]研究表明，本发明制备的表面具有ROS响应性聚多巴胺/柚皮素涂层的钛基材料[0074]H型血管在骨形成过程中具有重要作