多组学数据质控服务规范

多组学数据质控服务规范一、样本采集与处理质控标准1.1样本采集通用规范样本采集需遵循"时空一致性"原则，针对不同组学类型制定差异化标准。基因组DNA样本要求采集新鲜组织或血液，使用EDTA抗凝管（紫帽），避免肝素污染；转录组样本需在采集后30分钟内完成RNA稳定化处理，采用RNAlater试剂或干冰速冻；代谢组样本需使用预冷的甲醇-水混合液（体积比8:2）淬灭酶活性，全程保持4℃以下低温操作。样本量需满足最低检测需求：人类全血样本≥2mL，动物组织样本≥100mg，植物叶片样本≥500mg，微生物样本OD600值≥1.0。1.2耗材质量控制所有接触样本的耗材需通过三重质控检测：原始抽检（每批次随机抽取3个样本，检测邻苯二甲酸酯、双酚A等有机物溶出量＜0.1ng/mL）、现场操作模拟（使用双蒸水替代样本按标准流程处理，检测无机物污染如钙＜0.5ppm、铅＜0.01ppm）、存储稳定性验证（-80℃条件下储存3个月后复测溶出物水平）。合格耗材需具备批次追溯码，使用前需在2-8℃条件下平衡30分钟，避免温度骤变导致管盖开裂。1.3样本前处理标准操作程序血液样本处理需在生物安全柜内进行，4℃、3000×g离心15分钟分离血浆/血清，按每管500μL分装；组织样本采用冷冻研磨仪（频率30Hz，时间2分钟）匀浆，避免交叉污染；微生物样本需通过0.22μm滤膜过滤富集。处理后样本需在1小时内完成分装，使用带O型圈的螺口冻存管，标记信息需包含样本ID、采集时间、处理人员等要素，采用激光打码技术确保-196℃液氮环境下标签清晰可辨。二、测序与检测平台质控体系2.1高通量测序平台性能要求基因组测序推荐使用IlluminaNovaSeq6000平台，PE150模式下Q30≥90%，测序深度满足：全基因组≥30×，外显子组≥100×，靶向Panel≥500×；转录组测序采用HiSeqXTen平台，mRNA测序数据量≥6G，链特异性文库比对率≥85%，基因融合检测限≤5%；单细胞测序需使用10xGenomicsChromiumX系统，细胞捕获率≥90%，双细胞率＜5%，UMI重复率＜15%。2.2质谱检测系统参数标准代谢组检测采用超高效液相色谱-串联质谱联用系统（UHPLC-MS/MS），色谱柱选用C18反相柱（100mm×2.1mm，1.7μm），流动相A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱速率0.3mL/min；质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式下喷雾电压3.5kV，负离子模式2.8kV，离子传输管温度320℃，扫描范围m/z50-1200。脂质组检测需配备大气压化学电离源（APCI），源温度400℃，corona电流5μA。2.3仪器日常维护规范测序仪每日开机需进行Flowcell质控，激光强度波动范围≤5%，PH值监测6.5±0.1；每周进行光学模块校准，确保各通道信号强度偏差＜10%；每月更换液路系统密封圈，预防交叉污染。质谱仪每日需检测调谐液（利血平m/z609.2812）信噪比≥10000:1，每周进行柱效测试（甲苯保留时间RSD＜0.5%），每季度更换离子源灯丝，保证检测灵敏度稳定。三、数据产生过程质量控制3.1文库构建质控指标基因组文库插入片段长度需通过Agilent2100Bioanalyzer检测，主峰分布在350-500bp，峰型对称无拖尾；文库浓度采用Qubit4.0荧光定量，260/280比值1.8-2.0，260/230比值≥2.0；每个样本需构建3个重复文库，文库间浓度差异＜10%。转录组文库需检测RIN值≥8.0，核糖体RNA去除率＞95%；甲基化文库需通过亚硫酸氢盐转化率验证（≥99%），未转化片段＜0.5%。3.2测序过程实时监控高通量测序运行时需实时监测：簇密度维持在1000-1200K/mm²，簇通过率＞90%，每循环信号强度波动＜15%。设置阳性对照（PhiX文库，占比5%）和阴性对照（无模板文库），阳性对照Q30≥95%，阴性对照reads数＜1000。当出现以下情况需立即终止运行：单循环信号下降＞30%，异常簇比例＞5%，索引跳变率＞2%。3.3质谱检测质量控制每批样本检测需包含：系统适用性标准品（混合代谢物标样，浓度梯度1、10、100ng/mL），保留时间RSD＜0.5%，峰面积RSD＜10%；基质效应评估（基质加标与纯溶剂标样峰面积比80%-120%）；携带污染检测（连续进样3针空白，无目标物检出）。采用随机化进样顺序，每10个样本插入1个质控样本，质控样本CV值要求：定性离子对＞95%，定量离子对＜15%。四、数据分析标准化流程4.1原始数据预处理规范基因组数据采用FastQC（v0.11.9）进行质量评估，过滤标准：去除接头序列（Adapter含量＞0.1%），修剪5'端质量值＜20的碱基，过滤N含量＞5%的reads，保留长度＞50bp的序列。转录组数据使用TrimGalore（v0.6.6）处理，采用-stringency3参数控制错配率，rRNA序列去除率需＞98%。代谢组原始数据通过XCMS（v3.14.0）进行峰提取，保留信噪比＞10、峰宽＞5的特征峰。4.2组学数据质控指标体系基因组学：比对率（≥95%），覆盖均一度（≥0.9），平均测序深度（全基因组≥30×，外显子≥100×），SNP检出率（≥99%），INDEL检出率（≥95%），杂合子不平衡率＜0.05；转录组学：基因检出数（人类样本≥15000），比对到外显子区域比例（≥70%），生物学重复样本相关系数（≥0.92），可变剪切事件检出数（≥5000）；代谢组学：特征峰匹配率（≥85%），同位素峰比例（符合理论分布±10%），内标回收率（80%-120%），QC样本主成分分析第一主成分解释率＜30%。4.3多组学数据整合质控跨组学数据需满足"三一致性"：样本来源一致性（同一生物个体或同一实验单元），时间点一致性（动态实验时间偏差＜5%），技术重复一致性（组内相关系数≥0.85）。整合前需进行批次效应校正，基因组数据采用ComBat（v3.42.0）算法，代谢组数据使用QC-RLSC方法。建立多组学关联矩阵，要求基因-蛋白-代谢物调控关系符合KEGG通路注释（匹配度≥80%），关键节点分子（如代谢通路限速酶）需通过平行反应监测（PRM）验证。五、质量保证与质量控制体系5.1室内质量控制建立三级质控样本体系：标准品：中华家系1号DNA标准品（GSD-1001），SNV检测准确率≥99.99%；混合质控样本：每批次随机抽取20%样本混合，基因组数据CV值＜5%，代谢组数据CV值＜15%；过程质控样本：样本处理各环节留存对照（如RNA提取的阴性对照Ct值＞35）。每日绘制质控图，采用Westgard多规则判断失控：13s（单值超出±3SD），22s（连续2点超出±2SD），R4s（两点间差值＞4SD），出现失控需进行根本原因分析（鱼骨图法）并记录纠正措施。5.2室间质量评价每年参加至少2次国家卫健委临床检验中心组织的室间质评，基因组学项目变异检出符合率≥98%，转录组学差异表达基因验证率≥85%。建立实验室间比对方案，与3家以上通过ISO15189认证的实验室同步检测相同样本，组间相关系数要求：基因组数据≥0.98，代谢组数据≥0.90。对差异结果需进行系统偏差分析，使用Bland-Altman图评估95%一致性界限。5.3数据溯源与质量管理体系构建全流程追溯系统，每个样本分配唯一标识（包含项目编号、样本类型、时间戳等12位编码），记录从样本采集到数据分析的18个关键节点信息。实验记录需符合ALCOA+原则（可追溯性、清晰性、同步性、原始性、准确性、完整性），电子记录采用区块链技术存证，修改痕迹永久保留。每年进行2次内部审核，覆盖所有质量控制环节，不符合项整改完成率需达100%。六、特殊样本与前沿技术质控要求6.1微量样本处理规范单细胞样本需使用口吸管分离（直径10-15μm），活性检测采用台盼蓝染色（活细胞率≥85%），采用Smart-seq2方法扩增，cDNA产量需≥10ng/μL，片段分布在500-2000bp。FFPE样本处理需脱蜡（二甲苯浸泡3次，每次10分钟），抗原修复（柠檬酸盐缓冲液95℃加热20分钟），DNA提取浓度≥5ng/μL，片段长度≥100bp。6.2空间多组学质控标准空间转录组样本需满足：组织切片厚度（10μm±1μm），H&E染色信噪比≥30，捕获区域组织覆盖率≥90%。空间代谢组需进行基质辅助激光解吸电离（MALDI）点阵列质控，点直径（100μm±5μm），点间距（200μm±10μm），相邻点信号偏差＜15%。空间定位精度要求：x/y轴偏差＜5μm，组织区域与捕获区域匹配度＞95%。6.3长读长测序质量控制PacBioHiFi测序需达到：CCSreads数≥100万，平均读长≥15kb，QV≥20的碱基比例≥99.9%，基因组组装连续性（NG50≥10Mb）。OxfordNanopore测序质控标准：原始readN50≥50kb，通过Guppy（v6.1.7）碱基识别，Qscore≥10的比例≥90%，甲基化调用准确率≥95%。混合组装需评估：contig数量减少率≥50%，BUSCO完整性≥97%。七、质量控制文档管理7.1标准操作规程管理建立SOP三级文档体系：一级文件：质量手册（包含组织架构、质量方针、管理承诺）；二级文件：程序文件（25个核心程序，涵盖样本管理、仪器维护、数据安全等）；三级文件：作业指导书（128个操作细则，包含具体仪器参数设置、试剂配方等）。SOP文件需每2年评审修订，新版本发布前需经过3轮审核（技术主管、质量负责人、实验室主任），培训覆盖率需达100%，考核合格后方可上岗操作。7.2数据记录与报告规范实验记录需包含：样本信息（来源、采集时间、处理人员），仪器参数（型号、序列号、运行条件），试剂信息（批号、有效期、供应商），质控结果（原始数据、图表、判断结论）。报告模板需包含：数据质量摘要（关键质控指标达标情况），方法学说明（检测限、定量限、回收率），不确定度评估（扩展不确定度k=2），结果解释（与参考标准比对）。所有记录保存期限：科研项目≥5年，临床项目≥30年。7.3偏差与纠正措施管理建立偏差分级处理机制：轻微偏差（如单个质控样本超出2SD但在3SD内）：立即重测，记录偏差日志；中度偏差（如批次质控通过率＜90%）：启动根