一基因工程医学知识课件

又叫DNA重组技术，是按人们愿望，进行严格设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造更符合人们需要的新的生物类型与产品。基因工程（一）概念（一）基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达实质基因重组

基因工程的基本内容

基因操作基本步骤

基因操作的工具限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体2.基因表达载体的构建4.目的基因的检测与鉴定3.将目的基因导入受体细胞1.目的基因的获取（二）基因操作的工具１、分子手术刀─限制性核酸内切酶（限制酶）能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键指一类酶，非一种酶。

一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有4000多种。1、限制性核酸内切酶（3）.举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。（1）作用部位：磷酸二酯键（2）特点：专一性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。（4）来源：主要从原核生物中分离

原因：限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，对自己DNA无害，保护细胞原有遗传信息，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。而真核生物一般有其他保护措施。

（5）作用结果：形成DNA片段末端①平末端：平切（相同部位）②黏性末端：错位切（不同部位）重播DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子了。例题、限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是－G’GATC－，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是－’GATC－。在质粒上有酶Ⅰ的一个位点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性未端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性未端。（3）在DNA連接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性未端能否連接起来？为什么？（1）－G’GATC－－CTAG’G－用酶Ⅰ切割－GGATC－－CTAGG－（2）－’GATC－目的基因－’GATC－－CTAG’－目的基因－CTAG’－用酶Ⅱ切割－GATC－目的基因－GATC－－CTAG－目的基因－CTAG－（3）可以連接。因为由两种限制性内切酶切割后形成的黏性未端是相同的（或是可以互补的）重播２、基因的针线──DNA连接酶（1）连接的部位：DNA双链片段间的磷酸二酯键。（2）常用种类：①E.coliDNA连接酶：来源：大肠杆菌作用：连接黏性末端②T4DNA连接酶：来源：T4噬菌体作用：连接黏性末端、平末端（3）与DNA聚合酶的比较DNA聚合酶DNA连接酶化学本质作用部位模板蛋白质蛋白质磷酸二酯键（单个脱氧核苷酸+片段）磷酸二酯键（DNA双链片段+DNA双链片段）需要（DNA一条链）不需要3、基因的运输工具——运载体3.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。1.作用：①将外源基因送入受体细胞。②在宿主细胞内对目的基因进行大量复制2.条件：能在宿主细胞内复制并稳定地存在。具有一个至多个限制酶单一切点，使外源基因插入其中。具有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。对受体细胞无害，不影响其正常活动。运载体最常用的运载体------质粒注意在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的四个基本步骤：（三）基因操作的基本步骤1）目的基因的获取2）基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定目的基因（三）基因操作的基本步骤目的基因是编码蛋白质的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。获取目的基因的方法（三）基因操作的基本步骤直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法（从基因文库中获取）①基因文库：储存某种生物基因的菌群的总称，不是指生物基因。②基因组文库：某个含有某种生物所有基因的受体菌。③部分基因文库（cDNA文库）：某个含有某种生物部分基因的受体菌。④基因库：一个种群所有基因的总称，指基因。（三）基因操作的基本步骤步骤一：目的基因的提取1）鸟枪法（散弹射击法）：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定方法将目的基因的DNA片段分离出来。（三）基因操作的基本步骤步骤一：目的基因的提取2）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成cDNA合成过程

第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

（三）基因操作的基本步骤步骤一：目的基因的提取3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）基因操作的基本步骤上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因4）目的基因的扩增：PCR技术①原理：DNA复制②结果：目的基因成指数增长③步骤：变性（解旋为单链）+引物，退火，延伸（DNA聚合酶作用），多次重复④原料：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物、DNA聚合酶、ATP（2n）利用PCR技术扩增目的基因2、目的基因与运载体结合----核心步骤运载体和表达载体的区别：表达载体的组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因+复制原点运载体即质粒表达载体即重组质粒2、目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）质粒DNA分子同一种限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？三种情况：目的基因与目的基因结合质粒与质粒结合

目的基因与质粒结合39．（选修模块3：现代生物科技专题）

图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有

、

、

三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行

。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是

；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是

。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是

，其合成的产物是

。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是

。基因工程载体的构建需要考虑哪些因素

（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。（三）将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：①农杆菌转化法农杆菌介绍、原理及适用范围授粉前：将含目的基因的溶液滴加在柱头上，或用含目的基因的溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入目的基因。授粉：利用花粉管作为通道导入外源基因。②花粉管通道法利用植物的自然生殖过程，省去了组织培养阶段，既简单、经济，又快捷实用，原则上适用于任何开花植物。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。受体细胞：细菌细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制氯化钙②导入动物细胞---显微注射法，将目的基因注射到卵细胞中，受精后，胚胎移植。③导入微生物细胞----感受态细胞法（四）目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—④个体生物学水平的鉴定①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交知识延伸——DNA分子杂交技术该方法根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。分子杂交技术采用同位素标记的目的基因作为分子探针，与从转基因生物中提取的mRNA进行杂交，如果显示杂交带表明目的基因转录出了mRNA。4、目的基因的检测和表达无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。（2）表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。基因工程的成果与发展前景基因工程的成果在实际生产、生活中的应用有哪些？医药卫生利用转基因的工程菌等生产基因工程药品基因诊断：用同位素或荧光分子制备DNA探针，利用DNA分子杂交的原理检验被试样品的遗传信息基因治疗：用健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞农牧业培育优良品质的转基因作物或抗逆性转基因作物培育优良品质的转基因动物培育巨型的转基因动物，获得乳腺反应器食品工业：开发新的食品来源——单细胞蛋白环境保护生产可分解多种烃的转基因超级细菌等利用DNA分子探针检测环境中的细菌和病毒等。１、基因工程与医药卫生我国生产的部分基因

工程疫苗和药物⑴基因工程药品的生产淋巴因子：干扰素：抑制病毒增殖白细胞介素-2：增强有关免疫细胞杀伤能力干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产⑵