2025年高频纯化岗位面试题及答案

2025年高频纯化岗位面试题及答案请简要说明高效液相色谱（HPLC）与快速蛋白液相色谱（FPLC）在纯化应用中的核心差异，以及选择FPLC时通常需要重点关注的参数。HPLC与FPLC的核心差异体现在应用场景、压力范围和目标分子特性三方面。HPLC通常使用高压（>100bar）驱动流动相，适用于小分子（如药物中间体、多肽）的高分辨率分离，其填料粒径小（2-5μm），柱效高但对大分子（如蛋白质、抗体）易造成剪切损伤。FPLC（现多称AKTA系统）工作压力较低（<50bar），采用大粒径（10-30μm）软胶或刚性填料，专为生物大分子设计，可保持蛋白质构象稳定。选择FPLC时需重点关注：1.泵的流量精度（生物大分子纯化通常在0.1-10mL/min范围，需±1%以内的流量误差）；2.检测器灵敏度（UV检测波长需覆盖280nm/260nm双波长，基线噪声应<±0.001AU）；3.系统兼容性（是否支持多模式色谱柱切换，如亲和、离子交换、疏水相互作用色谱的在线联用）；4.自动化功能（梯度洗脱程序的编程灵活性，是否支持无人值守运行）。若在抗体纯化过程中，ProteinA亲和层析后洗脱峰出现拖尾，且目标蛋白回收率仅65%（正常应>85%），请列出可能的原因及排查步骤。可能原因及排查步骤如下：1.填料性能下降：ProteinA填料长期使用后配基脱落或污染，导致结合容量降低。需检查填料使用次数（常规ProteinA填料寿命约100-200次），通过空白运行（仅缓冲液过柱）观察柱压是否异常升高（正常<0.5MPa），或取少量填料进行结合容量测试（如用已知浓度的抗体溶液上样，检测未结合部分的浓度计算结合量）。2.上样条件不当：上样缓冲液pH或离子强度偏离最佳范围（通常pH7.0-8.0，电导率<10mS/cm），导致抗体与ProteinA结合不充分。需复测上样液pH（误差应<0.1）和电导率（误差<0.5mS/cm），并与工艺验证时的条件对比。3.洗脱条件不合适：洗脱液pH过低（如<2.5）可能导致抗体部分变性，在柱内聚集；或洗脱时间不足（接触时间<3min）导致洗脱不彻底。需检查洗脱液pH（推荐pH2.8-3.2），并通过分段收集洗脱液（每1CV收集1管）分析蛋白浓度分布，确认洗脱峰是否完全洗脱。4.柱床装填问题：层析柱装填不匀（如存在沟流或塌陷）导致流动相分布不均。可通过柱效测试（如用丙酮作为示踪剂测理论塔板数，正常应>2000/m）判断，若塔板数下降>30%需重新装柱。5.样品预处理不足：样品中存在颗粒杂质（如细胞碎片）堵塞填料孔道，影响传质。需检查上样前的澄清步骤（如离心转速是否≥8000g，或深层过滤膜孔径是否≤0.45μm），并通过显微镜观察样品是否有可见颗粒。连续色谱技术（如多柱捕获系统MCS）相较于传统批次色谱，在单抗纯化中具有哪些优势？实际应用时需重点控制哪些参数以保证工艺稳定性？连续色谱的优势体现在三方面：1.生产效率提升：通过多柱交替上样、洗脱，设备利用率从批次色谱的~30%提升至>80%，相同产能下设备体积可缩小50%以上；2.缓冲液消耗降低：连续模式下洗脱峰重叠部分少，缓冲液用量减少30%-40%；3.工艺一致性增强：恒定的上样负荷和洗脱条件可减少批次间差异。实际应用时需重点控制：1.柱间一致性：多根色谱柱的填料装填密度（误差需<2%）、柱效（理论塔板数偏差<5%）需高度一致，否则会导致各柱结合容量不均；2.切换时间精度：上样-洗脱-再生的切换时间需精确到秒级（误差<2s），否则可能导致目标蛋白穿透或洗脱峰重叠；3.在线监测灵敏度：需配置高精度UV检测器（基线噪声<±0.0005AU）和电导率传感器（响应时间<0.5s），实时监控各柱的结合饱和点（通常以UV280nm达到上样液浓度的5%作为穿透点）；4.压力波动控制：多柱切换时系统压力波动需<0.1MPa，否则可能导致填料压缩或柱床塌陷；5.清洗验证：连续模式下各柱交替使用，需验证再生后填料的结合容量恢复率（应>95%），避免污染物累积影响后续批次。在重组蛋白纯化工艺开发中，如何通过实验设计（DOE）优化离子交换色谱的洗脱条件？请描述具体的实验因素、响应变量及关键分析方法。基于DOE优化离子交换色谱（IEX）洗脱条件的步骤如下：实验因素选择：根据IEX类型（阳离子/阴离子）确定关键参数，通常包括洗脱盐浓度（NaCl，范围0.1-1.0M）、洗脱pH（范围±1.0单位，如目标蛋白pI为7.0则pH6.0-8.0）、洗脱流速（0.5-3.0CV/h）、梯度斜率（线性梯度时间10-40CV）。若为疏水电荷诱导色谱（HCIC），还需考虑洗脱剂（如精氨酸）浓度（0.2-1.0M）。响应变量设定：核心指标为目标蛋白回收率（%）、纯度（HPLC-SEC或SDS检测）、宿主细胞蛋白（HCP）残留量（ELISA）、宿主DNA残留量（qPCR）。次要指标包括洗脱峰体积（影响后续浓缩步骤）、柱压（反映填料耐受性）。实验设计与实施：采用Box-Behnken设计或中心复合设计，设置3水平（低、中、高），总实验次数约15-20次。例如，对于4因素（盐浓度、pH、流速、梯度时间），选择中心复合设计（CCD），包含8个角点、6个轴向点和6个中心点。每次实验需严格控制上样量（固定为填料结合容量的80%）、平衡缓冲液（pH与上样液一致，电导率<5mS/cm）。数据分析方法：通过统计软件（如JMP、MODDE）拟合二次多项式模型，计算各因素对响应变量的主效应、交互效应及曲率效应。例如，若模型显示盐浓度与pH的交互作用对HCP残留有显著影响（p<0.05），则需重点分析两者的协同作用。通过响应面分析确定最优区域（如回收率>90%、纯度>98%、HCP<100ppm的重叠区域），并进行验证实验（3次重复）确认模型预测的准确性。最终确定的洗脱条件需满足工艺鲁棒性（±10%参数波动下，关键质量属性偏差<5%）。请说明在疫苗佐剂（如铝佐剂）纯化过程中，如何通过超滤-渗滤（UFDF）工艺去除游离铝离子？需重点监控哪些参数以避免佐剂颗粒聚集？超滤-渗滤去除游离铝离子的关键在于利用膜截留分子量（MWCO）与铝佐剂颗粒尺寸的匹配性。铝佐剂通常为纳米级颗粒（50-200nm），需选择MWCO远小于颗粒尺寸的膜（如陶瓷膜，截留孔径50nm），确保佐剂被截留，而游离铝离子（以Al³+或Al(OH)₂+形式存在，尺寸<1nm）随透过液排出。具体步骤：1.预处理：调整料液pH至佐剂稳定范围（通常pH5.5-7.0，避免pH<4.0导致颗粒溶解），添加0.01-0.1%吐温-20防止颗粒吸附膜表面；2.浓缩：通过超滤将料液体积浓缩至初始体积的1/5-1/10，降低后续渗滤体积；3.渗滤：用无铝缓冲液（如PBS，pH6.8）进行diafiltration，渗滤体积为5-10倍浓缩体积，确保游离铝离子充分洗出；4.清洗：用0.1MNaOH溶液循环清洗膜组件（30min），去除膜表面吸附的佐剂颗粒。重点监控参数：1.跨膜压（TMP）：控制在0.5-1.5bar，TMP过高会导致颗粒在膜表面堆积（浓差极化），加剧聚集；2.错流速度（CFV）：保持2-4m/s，通过剪切力减少颗粒在膜面的沉积；3.颗粒尺寸分布（PSD）：在线用动态光散射（DLS）监测，若平均粒径增大>20%（如从100nm增至120nm），需降低TMP或提高CFV；4.铝离子浓度：透过液中Al³+浓度需<10ppm（通过电感耦合等离子体光谱ICP-OES检测），若连续3次检测>10ppm，需延长渗滤体积；5.佐剂活性：渗滤后检测佐剂的蛋白吸附能力（如与模型蛋白BSA孵育后，离心取上清测蛋白浓度，吸附率应>90%），若吸附率下降，可能因颗粒表面电荷改变（需调整缓冲液离子强度）。若纯化车间的超纯水系统（UPW）电阻率突然从18.2MΩ·cm降至15MΩ·cm，且TOC（总有机碳）从<5ppb升至50ppb，可能的原因有哪些？作为纯化工程师应如何快速排查并恢复系统？可能原因及排查步骤：1.预处理单元失效：活性炭过滤器吸附饱和（正常更换周期3-6个月），无法有效去除原水中的有机物（如腐殖酸），导致后续RO膜负荷过高。需检查活性炭过滤器的压差（正常<0.1MPa，若>0.2MPa需更换），并取活性炭层出水测余氯（应<0.1ppm，若>0.5ppm说明吸附饱和）。2.反渗透（RO）膜污染：RO膜被微生物（如假单胞菌）或无机盐（如碳酸钙）污染，脱盐率下降。需检测RO膜进水与产水的电导率，计算脱盐率（正常>98%，若<95%需清洗）；取RO膜产水测微生物总数（应<10CFU/mL，若>100CFU/mL提示生物污染）。3.电去离子（EDI）模块故障：EDI的离子交换树脂失效或电极结垢，导致除盐能力下降。需检查EDI的工作电压（正常100-200V）和电流（正常1-3A），若电压升高但电流降低，可能是树脂失效；取EDI产水测硅含量（应<1ppb，若>5ppb说明树脂无法去除硅酸根）。4.循环管路污染：超纯水储存罐或分配管路内壁滋生生物膜（常见于死角或流速<1m/s的区域），释放有机物。需检查循环泵的流速（应>1.5m/s），取储罐排水口、使用点（如纯化设备进水口）的水样测TOC，若使用点TOC显著高于储罐出水，说明管路污染。快速恢复措施：1.立即切换至备用超纯水系统（若有），保证生产连续性；2.对预处理单元：更换活性炭过滤器，并用1%次氯酸钠溶液浸泡30min消毒；3.对RO膜：若为生物污染，用0.1%氢氧化钠+0.05%十二烷基硫酸钠溶液循环清洗（35℃，2h）；若为无机盐污染，用1%柠檬酸溶液清洗（pH3.0，25℃，1h）；4.对EDI模块：若树脂失效，需再生（用5%盐酸和5%氢氧化钠溶液分别冲洗阴阳极室）；若电极结垢，用1%草酸溶液浸泡2h去除钙镁沉积；5.对循环管路：用80℃热水循环消毒（60min），或用0.3%过氧化氢溶液浸泡4h，之后冲洗至TOC<5ppb；6.恢复后连续监测3天，每2h记录电阻率、TOC、微生物指标，确认系统稳定性。在基因治疗载体（如AAV）纯化中，空壳与完整病毒颗粒的分离是关键难点。请说明常用的分离技术（至少3种）及其原理，并分析各自的适用场景。AAV空壳（无基因组）与完整颗粒（含基因组）的分离技术及适用场景：1.离子交换色谱（IEX）：基于两者表面电荷差异。完整颗粒因包裹负电荷的基因组（~4.7kbDNA），表面负电荷密度高于空壳（仅衣壳蛋白）。使用阴离子交换色谱（如QSepharose），在低离子强度（电导率<5mS/cm）下上样，完整颗粒与填料结合更强，需更高盐浓度（0.3-0.5MNaCl）洗脱，空壳则在0.1-0.3MNaCl洗脱。适用于小规模工艺（<10L收获液），但需优化pH（通常pH7.5-8.5）以放大电荷差异，且对AAV血清型（如AAV2vsAAV9）的电荷异质性敏感。2.密度梯度离心（DGC）：利用两者密度差异（完整颗粒密度1.33-1.35g/cm³，空壳1.29-1.31g/cm³）。常用碘克沙醇（OptiPrep）梯度（15%-40%w/v），在150,000g下离心2-4h，完整颗粒沉降至高密度区（~35%碘克沙醇），空壳在低密度区（~25%）。适用于高纯度制备（如临床样品），但设备成本高（需超速离心机），处理量小（单次<10mL），且碘克沙醇残留需后续去除。3.亲和色谱（AC）：利用配基与完整颗粒的特异性结合。例如，单链抗体（scFv）可识别衣壳蛋白与基因组结合后的构象表位，仅结合完整颗粒；或使用肝素亲和填料（AAV2等血清型通过肝素硫酸盐受体感染细胞），完整颗粒因基因组导致衣壳构象变化，与肝素的结合力更强。适用于大规模工艺（>100L收获液），但需开发高特异性配基（避免与空壳交叉反应），且洗脱条件（如低pH或高盐）需确保病毒活性（感染滴度保留>80%）。4.尺寸排阻色谱（SEC）：基于两者hydrodynamicsize差异（完整颗粒直径~25nm，空壳~23nm）。使用高分辨率SEC填料（如Superose6Increase），在低流速（0.1-0.3mL/min）下分离，完整颗粒因体积大先流出。适用于分析级分离（如质量控制），但制备级SEC处理量极低（<1%柱体积），难以用于生产。实际选择时，临床级生产多采用IEX与AC联用（如亲和捕获后IEX精纯），兼顾收率（>70%）与纯度（完整颗粒占比>95%）；研发阶段常用DGC作为金标准验证分离效果；SEC主要用于放行检测（如HPLC-SEC检测空壳/完整颗粒比例）。若纯化后的重组酶制剂在储存2周后酶活下降30%（初始活为5000U/mg），可能的降解机制有哪些？请设计实验验证主要原因并提出改进措施。可能的降解机制及验证实验：1.蛋白酶污染：纯化过程中残留宿主细胞蛋白酶（如大肠杆菌的Lon蛋白酶），在储存条件下（4℃）缓慢降解目标酶。验证实验：取降解后的样品进行SDS，观察是否出现目标条带（如60kDa）的断裂条带（如40kDa+20kDa）；用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（含PMSF、EDTA、E-64）处理样品，储存2周后测酶活，若抑制后酶活仅下降5%，则确认蛋白酶污染。2.氧化失活：酶分子中的巯基（-SH）或甲硫氨酸残基被氧化，导致构象改变。验证实验：用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）检测巯基含量（正常酶含2个游离巯基，若降至0.5个提示氧化）；用高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）分析甲硫氨酸氧化产物（分子量增加16Da）。3.聚集沉淀：酶分子在高浓度（如>10mg/mL）下发生不可逆聚集，形成无活性的沉淀。验证实验：用动态光散射（DLS）检测粒径分布（正常单峰~10nm，若出现>100nm的峰提示聚集）；离心样品（10,000g，10min）取上清测酶活，若上清酶活仅为原样品的60%，说明沉淀导致活性损失。4.缓冲液不匹配：储存缓冲液的pH偏离酶的稳定范围（如酶最适pH7.0，储存液pH6.0），导致构象不稳定。验证实验：用圆二色谱（CD）检测二级结构（α-螺旋含量从50%降至35%提示构象变化）；更换不同pH缓冲液（6.5-7.5）储存，2周后比较酶活保留率。改进措施（以蛋白酶污染为例）：1.优化纯化工艺：在亲和色谱后增加阴离子交换色谱（如DEAESepharose），利用蛋白酶（通常pI<5.0）与目标酶（pI7.0）的电荷差异去除残留蛋白酶；2.添加抑制剂：在储存缓冲液中加入0.1mMPMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）和1mMEDTA（金属蛋白酶抑制剂），抑制残留蛋白酶活性；3.降低储存温度：将储存温度从4℃降至-20℃（添加10%甘油防冻结），减缓酶促反应速率；4.缩短储存时间：验证酶在4℃的半衰期（如从2周延长至4周），制定有效期（如2周内使用）。若需将实验室规模（50mL柱体积）的阳离子交换色谱工艺放大至生产规模（5L柱体积），需遵循哪些放大原则？关键工艺参数（如线速度、停留时间）应如何转换？放大原则及参数转换方法：放大需遵循“几何相似性”和“动力学相似性”原则，确保小规模与生产规模的传质、流体分布一致。关键步骤如下：1.柱尺寸比例放大：保持柱高（H）与直径（D）的比例（H/D）一致（实验室柱H=20cm，D=5cm，H/D=4；生产柱D=20cm，则H=80cm），避免因柱高/直径比变化导致的沟流或壁效应。2.线速度（cm/h）保持恒定：线速度=体积流速（mL/h）/(π×(D/2)²)。实验室规模线速度通常为150-300cm/h（对应体积流速=150×π×(5/2)²≈2945mL/h），生产规模需维持相同线速度（150cm/h），则体积流速=150×π×(20/2)²≈47,124mL/h（47L/h）。3.停留时间（min）保持恒定：停留时间=柱体积（CV）/体积流速×60。实验室柱体积50mL，体积流速2945mL/h，停留时间=50/2945×60≈1.02min；生产柱体