第18章-基因诊断与基因治疗

第十八章基因诊断与基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy南方医科大学基因工程研究所生物化学与分子生物学教研室周珏宇zhoujueyu@126.com1主要内容基因诊断1基因治疗22教学要求【教学课时】

2学时【掌握内容】基因诊断的含义、特点；基因治疗的概念。【熟悉内容】基因诊断的各种常用技术方法；基因治疗的载体系统与导入方法。【了解内容】基因诊断、基因治疗在医学中的应用3基因变异致病类型内源基因的变异基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵4第一节

基因诊断

GeneDiagnosis5

一、基因诊断的概念和特点定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。6

特点1.特异性高，针对性强2.灵敏度高:3.早期诊断4.取样方便5.安全高效6.适应范围广一、基因诊断的概念和特点7二、基因诊断常用技术方法（一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链反应(PCR)（三）基因测序（四）生物芯片8（一）核酸分子杂交技术概念

核酸分子杂交技术是依据DNA双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列。910分类固相杂交：将待检测核酸样本先行结合到某种固相支持物上，再与杂交液中的特异性标记探针进行杂交反应，然后漂洗去除未参加反应的核酸探针。液相杂交：待测的核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行反应。11杂交分离、变性、转移、固化DNA片段标记核酸探针制备待测核酸样品制备核酸探针分子杂交操作程序预杂交加入标记核酸探针漂洗除去未参与杂交的标记探针检测杂交信号12核酸探针是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。探针标记物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。13常用的固相核酸杂交方法Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、菌落杂交、斑点杂交（狭缝杂交）、原位杂交、夹心杂交等。14Southern印迹由英国人Southern(1975)发明，将琼脂糖中的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上进行DNA分子杂交分析的方法。

15是经典的RNA分析法，用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。过程类似于Southernblotting。

Northern印迹16放射自显影照片17Western印迹

用于蛋白质的分析聚偏二氟乙烯

辣根过氧化物酶

18三种印迹技术的比较19菌落杂交（colonyhybridization）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。20硝酸纤维膜复制培养溶菌、中和蛋白酶处理漂洗、烘干

1、32P探针

2、放射自显影

鉴定克隆（含感兴趣DNA）菌落杂交硝酸纤维膜菌落琼脂培养板21夹心杂交法(sandwichhybridization)

A

B

A

B

A

B

RE

RE

片段B捕获探针固相支持物

片段A检测探针(标记)22原位杂交（insituhybridization）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。23小鼠大脑皮层mRNA原位杂交细胞原位杂交241988Saiki1988Keohanog1985Mullis1971Korana耐热DNA聚合酶T4DNA聚合酶聚合酶链式反应(Klenow片段)核酸体外扩增设想（二）聚合酶链反应技术1.发展简史

25PCR技术让Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。262.PCR基本原理

利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因的大量扩增。

在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的循环过程，实现对目的DNA的扩增。27变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链加热使模板DNA在高温下90-95℃变性，双链解链降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链3.PCR的基本反应步骤285

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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PCR技术原理示意图29Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。30

PCR技术原理示意图31

这样经过一个周期的变性—复性—延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，反复n个周期后，理论上就能扩增为2n倍，一般经过30~40周期就能扩增100万倍以上。

324.PCR的特点特异性强灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10-12级的起始待测模板扩增到微克(

g=10-6)水平简便、快速PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应对标本的纯度要求低

DNA粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测33模板(DNA/RNA)耐热DNA聚合酶特异性引物缓冲液与Mg2+

dNTP浓度、比例参数5.PCR各要素及其作用34模板：PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，起始量一般为102～105个拷贝；模板量合适可以减少PCR多次循环所致的碱基错配的发生率。耐热DNA聚合酶：最重要因素之一，主要有TaqDNA聚合酶等。是从耐热菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30

min。35缓冲液与Mg2＋：10～50mmol/LTris-HCl（pH8.3～8.8，20˚C）；Mg2＋过低，酶活力明显降低；Mg2＋浓度过高时，使反应特异性降低。dNTP：原料。高浓度易产生错误掺入，而浓度过低，则降低反应产物的产量。常用浓度为50～200

mol/L36引物：是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。371.引物的长度一般为15~30bp2.G＋C含量一般为40~60％3.引物的碱基成分应尽量随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积的现象4.引物不应有自身互补序列5.两个引物之间不应有多于4个的互补6.引物的延伸是在3'端开始，3'端不能进行任何修饰7.引物5'端可修饰8.引物与非特异结合区之间的同源性不要超过70％引物设计的基本要求38PCR反应参数

变性温度与时间

退火温度与时间

退火温度决定PCR的特异性；Tm-5˚C

延伸温度与时间

TaqDNA聚合酶活性最高温度；35-100bp/min

循环次数

主要取决于模板DNA的浓度；平台期39凝胶电泳分析法6.PCR产物分析点杂交分析法40（三）生物芯片（biochip）

采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器（比如激光共聚焦扫描仪）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。41叠加图：绿色代表下调；红色代表上调；黄色无差异。正常样品Cy3标记待测样品Cy5标记叠加石奕武，胡维新等：多发性骨髓瘤的基因表达谱分析，湖南医科大学学报，2003，28（3）：201－205421.芯片的制备

Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer43ExtractRNAorDNA2)RTorPCRamplification3)FluorescentlabelingReferencecellscombineLabeledRNAorDNA(Reference)

2)1)3)1)2)3)2.基因表达谱双色标记443.分子杂交1)hybridize2)rinse454.检测分析Laser1Laser2Detector1Detector2Scanner芯片的扫描465.图像处理Detector1Detector2False-colordifferentialimage476.图像分析484950（四）基因测序是最直接、最确切的基因诊断方法。Maxam-Gilbert法（化学裂解法）Sanger法（双脱氧末端终止法）

DNA自动测序法弗雷德里克桑格51化学裂解法(Maxam-Gilbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。52Sanger法（双脱氧末端终止法）①以待测DNA单链为模板，在DNA聚合酶作用下，加入4种dNTP和4种ddNTP（双脱氧核糖核酸）②dNTP和ddNTP竞争参与DNA互补链的合成③当ddNTP取代dNTP的位置后，DNA链的合成终止④电泳图谱分析，确定碱基顺序⑤图谱中读出的顺序是待测链的互补碱基顺序53双脱氧核苷酸结构54Sanger法（双脱氧末端终止法）

读出模板互补序列dNTP

凝胶电泳

较大片段

较小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反应混合物Klenow酶

未知序列的单链DNA

读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5´3´

放射性标记的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3´5´CTGACTTCGACAA5´3´55DNA自动测序法

设计原理：Sanger法为基础

荧光标记物：不同颜色的荧光分

别代表A、G、C、T

电泳→电信号→显示5657三、基因诊断的应用遗传病

产前诊断、优生优育肿瘤

了解恶性肿瘤的分子机制，对肿瘤分类分型及预后有指导意义。

感染性疾病

具有快速、灵敏、特异等优点。法医学中个体识别、亲子鉴定

有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定，如DNA指纹分析、短串联重复（STR）多态性分析等。58×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰刀状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析bA

CCTGAGGAGbA

CCTGTGGAGb-珠蛋白基因第六密码子GAG(Glu)→GTG(Val)59+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者60杜氏肌营养不良症(DMD)的基因检测DMD是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者。致病基因DMD的全长为250kb，有79个外显子。DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。61DMD基因外显子缺失的检测621.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇

1.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇4.胎儿

5.阴性对照

4.胎儿

5.阴性对照采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子63Southernblot应用DNA指纹分析血迹中的DNA64第二节

基因治疗

GeneTherapy65一、基因治疗的概念经典概念(狭义概念)：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念：将某些遗传物质转移至患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法，均称之为基因治疗。66腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的

严重联合免疫缺陷(SCID)杰西·吉尔辛67腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)686970二、基因治疗的总体策略基因矫正基因置换基因增补基因失活自杀基因的应用免疫基因治疗耐药基因治疗71基因矫正(genecorrection)

是指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。基因置换(genereplacement)指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。72基因增补(geneaugmentation)是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。基因失活(geneinactivation)是将特定的反义核酸（反义RNA、反义DNA）和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的表达，而实现治疗的目的。多用于抗肿瘤和抗病毒感染的治疗。73“自杀基因”的应用：HSV-TK自杀基因又称前体药物酶转化基因，这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原来无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒性物质，将细胞本身杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。74免疫基因治疗：是把产生抗病毒或者肿瘤免疫力对应的抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子基因治疗、免疫增强基因疗法、肿瘤DNA疫苗疗法等。耐药基因治疗：在肿瘤治疗中，为提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞。如将多药耐药基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。75基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：1.直接体内疗法（invivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（exvivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。

76基因治疗的两种途径载体目的基因invivoexvivo靶细胞77三、基因治疗的基本程序治疗性基因的获得基因载体的选择靶细胞的选择基因转移方法转导细胞的选择鉴定

利用载体中的标记基因回输体内病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞化学法、物理法、病毒载体系统、膜融合法等78（一）治疗性基因的获得

导入的治疗基因应是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关但有治疗意义的基因。79（二）基因载体的选择基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。病毒载体：逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关的病毒(AAV)等。非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体。80（三）靶细胞的选择----间接体内疗法中使用----分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只