（正式版）DB54∕T 0574-2026 《细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a》

ICS65.020.30CCSB4354IDB54/T0574—2026 2规范性引用文件 3术语和定义 4仪器材料与试剂 5操作方法 2附录A（资料性）目标扩增序列 4附录B（资料性）引物及浓度 5附录C（规范性）PCR反应体系配置 6附录D（资料性）颜色检测结果判定 7附录E（资料性）荧光值检测结果判定 8DB54/T0574—2026本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、佛山大学。本文件主要起草人：唐文强、黄福强、石斌、赵霞玲、马弘财、罗润波、孙建春、张明珠。DB54/T0574—20261细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a本文件规定了细粒棘球绦虫CRISPR-Cas12a检测的仪器耗材与试剂、操作方法及结果判定等要求。本文件适用于实验室对细粒棘球绦虫的快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。CRISPR-Cas12aCRISPR全称为ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，中文翻译为“成簇的规律间隔短回文重复序列”，是细菌的适应性免疫系统。Cas全称为CRISPRassociatednuclease，指CRISPR相关核酸酶，Cas12a效应蛋白又称为Cpf1效应蛋白，是一种由可编程RNA引导的DNA核酸酶，属于Ⅱ类V型CRISPR/Cas系统。细粒棘球绦虫一种在世界范围内流行的人畜共患慢性寄生虫，属圆叶目（Cyclophyllidea）带科（Taeniidae）棘球属（Echinococcus）绦虫，可引起囊型棘球蚴病（cysticechinococcosis,CE）。4仪器材料与试剂仪器以下仪器用于细粒棘球绦虫样本的保存、灭活和试验处理。a)实时荧光恒温扩增仪、恒温培养箱等任意一种可以恒温在37℃的仪器；）；c)掌上离心机：最高转速不小于8000rpm；d)冷冻式离心机：最高转速不小于15000rpm；e)涡旋震荡仪；f)-80°超低温冰箱；2b)离心管(1.5mL);4.3试剂RPA试剂盒，阴性质控：ddH₂O,阳性质控：含有目标核酸片段的质粒制品，见附录A;crRNA及RPA引物a)采集含细粒棘球绦虫组织的病料、细粒棘球绦虫组织/虫卵污染的环境样本或新鲜犬粪200mg~d)提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。37℃,扩增时间为30min,且每分钟读取一次荧光。DB54/T0574—202635.5.1判定方法法检测细粒棘球绦虫核酸的结果，采用如下方法进行检测。a)可视法检测：同批反应的阳性对照在蓝/紫光灯照射下能观察到反应溶液变为黄绿色，且阴性对照溶液为无色透明；b)荧光法检测：使用实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪读取结果，同批反应的阴性对照荧光值处于稳定状态，而阳性对照荧光值呈明显上升趋势且荧光值明显大于阴性对照。5.5.2结果判断CRISPR-Cas12a法检测细粒棘球绦虫核酸的结果，采用如下方法判定。a)可视法检测：反应30min后在蓝/紫光下观察，试管溶液颜色由无色透明变为黄绿色的样本判定为细粒棘球绦虫核酸阳性；反之，仍为无色透明的样本判定为阴性；若颜色为淡绿色、浅绿色则判定为可疑，见附录D。b)荧光法检测：使用实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪读取结果，30min内荧光值呈明显上升趋势的样本判定为细粒棘球绦虫核酸阳性；反之，30min无任何上升趋势的样本判定为阴性；若上升趋势不明显，仅略高于阴性荧光值的样品判定为可疑，见附录E。c)可疑样本再次取样进行检测，若再次检测为阴性，应重复扩增检测1次，2次阴性判定为阴性；若再次检测仍为可疑或阳性，则判定为阳性。DB54/T0574—20264（资料性）目标扩增序列>NC_044548.1:3424-4005Echinococcusgranulosusmitochondrion,COX2gene（此序列来源于NCBI的RefSeq数据库中细粒棘球绦虫参考线粒体基因组的COX2基因序列）GTGAAATTGTCGTTGTTATATTATGATATTGTGTGTTATATTGTGGCGGTTTGTGTATTTATTGTTTGTTTTGTGTATGTTTTGTTGTGTTGGAATGTGGTGTTTGGCGTTGGTACTGTTAAATTTGGTAGTGAGAATCAGATTATAGAGTTGGTATGAACTGTTATTCCTACTGTGGTTGTGTTAGTTTTGTGTGCCTTGAAAGTTAAATTTATTACTAGTGATTTAGATTGTTTTTCTTCTGAGACTATTAAGGTGGTTGGTCATCAGTGATATTGGACTTACGAGTATTTTGGCGGTGGCTATGATTCGTTTCCGATTGGGGATTATTTTGTGGTAGATAAGCCTTTGCGGATGGTTTATGGTGTACCATATCATTTGGTTGTAACTTCAAGTGATGTAATTCATTCGTTTTCTGTTCCTTCATTGAATTTGAAGATGGATGCTGTTCCTGGCCGTCTTAATCATTTGTTTTTTTGTCCTTCTCAACATGGGTCTTTTGTTGGTTATTGTGCTGAATTGTGTGGTGTTAATCATAGAGTTATGCCTATTGTTGTGGAGGTTGTTGGGGGTTGTTGTTAGDB54/T0574—20265引物及浓度5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAGACUAUUAAGGUGGUUG-3’15’-CCTACTGTGGT