2026年高考生物模拟试卷必刷题-基因工程

第1页（共1页）2026年高考生物模拟试卷必刷题——基因工程一．选择题（共7小题）1．粪便无创DNA检测技术通过分析粪便中脱落肠道细胞的DNA来评估肠癌发病风险，具有无创便捷、灵敏度高等优点。该检测需采集粪便样本，进行DNA提取、扩增等过程。下列叙述正确的是（）A．提取DNA时，研磨液经过滤、离心后取上清液，再加入冷酒精 B．随着PCR反应进行，DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸数量逐步减少 C．因粪便中的DNA均源于肠壁脱落细胞，因此该技术的灵敏度高 D．若检测发现原癌基因并未突变，则可判断该检测者未得肠癌2．某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验。操作流程如下：①组织捣碎后加入研磨液充分研磨；②过滤取滤液，置于4℃冰箱静置分层；③取上清液加入等体积预冷的95%酒精；④离心后收集白色絮状沉淀物；⑤取部分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是（）A．步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶，所以冷酒精可使DNA快速析出 B．步骤⑤鉴定时，直接取白色絮状物与二苯胺混合，室温下放置观察颜色变化 C．若对提取物进行琼脂糖凝胶电泳，迁移距离越大的DNA片段分子量越大 D．步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中，需用高浓度NaCl溶液重新溶解3．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（）A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计 B．据图可知，最后大量获得的ssDNA、与图中甲链的碱基序列相同 C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离4．如图甲、乙、丙分别是目的基因、质粒载体、重组DNA（重组质粒）的三个示意图，限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ．要获得理想的可表达目的基因的重组DNA，最佳的限制酶组合方式是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体5．科学家利用蛋白质工程技术将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了10～12℃。下列说法正确的是（）A．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 B．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 C．蛋白质工程在设计蛋白质结构时的依据是现有基因的脱氧核苷酸序列 D．蛋白质工程只能改造现有的蛋白质而不能制造新的蛋白质6．如图为培育转基因山羊生产人β﹣酪蛋白的流程图，下列叙述错误的是（）A．过程①所用的人β﹣酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得 B．过程①所用载体应具备复制原点、标记基因、启动子、终止子等 C．过程④得到的人β﹣酪蛋白可从山羊的乳汁中提取 D．过程④人β﹣酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译7．关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段扩增产物的实验，下列叙述错误的是（）A．在一定的pH下DNA带上电荷，在电场中向着与它所带电荷相反的电极移动 B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关 C．为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来二．多选题（共1小题）（多选）8．基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述错误的是（）A．导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞 B．利用农杆菌转化法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上 C．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′﹣端进行子链合成 D．若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列三．解答题（共7小题）9．科研人员开发微生物细胞作为全细胞生物传感器，可以高效检测环境中的重金属污染程度。（1）为构建全细胞生物传感器，需先构建基因表达载体，需要用到的酶有。图1为基因表达载体的部分结构，除启动子和目的基因外，表达载体还需具备的元件有、、复制原点。（2）要判断Gfp基因是否正确连接到质粒上，应对待测质粒进行PCR扩增及电泳鉴定，选择的引物是。据图判断，Gfp基因的转录模板链是链。（3）图2为重金属全细胞微生物传感器的生物识别与信号传输过程。据图分析重金属全细胞微生物传感器检测的原理是：结合重金属后与启动子上游序列结合，并促进启动子与结合，驱动目的基因的转录，最后检测以衡量环境中的重金属含量。10．绿色荧光蛋白（GFP）是由238个氨基酸组成的单体蛋白，在蓝光诱导下会发光，可用于直接观察细胞中的活动。实验小组以质粒pMUTIN﹣gfp+为模板扩增gfp+基因，将其与质粒pMV24构建了重组质粒pMV24﹣gfp+，并在木葡糖酸醋杆菌中进行表达，证明其可作为选择标记用于今后的研究，重组质粒的构建过程如图所示。请回答下列问题：注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ、XbaⅠ、PvuⅡ表示三种限制酶。（1）利用PCR扩增目的基因时，每个循环依次经过三个阶段，扩增过程中需在缓冲液中添加一定浓度的Mg2+，Mg2+的作用是。（2）以质粒pMUTIN﹣gfp+为模板扩增gfp+基因时，应当在引物的（填“5′”或“3′”）端添加两种限制酶的识别序列。用不同的限制酶切割目的基因和载体的原因是（答出两点）。（3）重组质粒上的AmpR基因是一种标记基因，其作用是，AmpR基因能作为标记基因的前提条件是木葡糖酸醋杆菌中（填“含有”或“不含”）AmpR基因。若要进一步检测重组质粒是否构建成功，可以用限制酶切割重组质粒，并用法分离不同的DNA片段。11．马铃薯块茎在储存中极易受损褐变发黑，导致其外观、味道、安全性下降。多酚氧化酶PPO可催化酚类物质形成褐色物质，是导致褐变的关键酶。为培育抗褐化能力强，并符合基因安全的新品种，研究者构建了目的基因StPPOi，表达产生与PPO基因转录产物互补的RNAi。将目的基因搭载在Gene—Deletor载体上（重组载体如图1所示），通过农杆菌介导，获得PPO基因沉默的马铃薯植株。经检测鉴定，发现褐变指数下降了80.78%。提取马铃薯器官中的外源基因，经PCR扩增后电泳分离（结果如图2所示）。请回答下列问题。（1）在构建的重组载体中，FLP基因的表达产物与酶的作用相似，均可以对DNA进行切割；抗卡那霉素基因的作用是。（2）转基因马铃薯植株块茎在25℃、3天处理条件下，启动子可以启动基因的转录，表达的产物可阻断PPO基因的（填“转录”或“翻译”），从而抑制PPO的合成。（3）转基因食品相对于传统食品，其有成本较低，农药使用量小，生产效率高等显著优势，但是转基因食品的安全性始终受到人们的质疑。上述研究中可采用2℃、3天处理此新品种，获得符合转基因安全的马铃薯，理由是。12．为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。（1）将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用处理大肠杆菌。（2）PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，推测M蛋白，PE表达产物可使E蛋白重新磷酸化。②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理。③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。（3）在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pec，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“﹣”表示相应蛋白脱离。条件Pc中c蛋白的结合序列M蛋白的结合序列无葡萄糖++低浓度葡萄糖ⅰ．ⅱ．高浓度葡萄糖ⅲ．ⅳ．13．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，科研人员对其进行了一系列改造。（1）Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图1）。复合体中的sgRNA与目的基因按照原则特异性结合。复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发。（2）将编码Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，与Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但与sgRNA结合等功能不变。构建能够表达dCas9的质粒A，设计一系列与红色荧光蛋白基因（RFP基因）上游不同部位结合的sgRNA序列（如图2），并以此为依据构建能表达sgRNA的质粒B，将质粒A、B共同导入含有RFP基因的大肠杆菌，测定大肠杆菌红色荧光强度，实验结果如图3所示。实验结果显示，对照组的红色荧光强度约为sgRNA3组的倍。由实验结果可以得出：。（3）VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段。科研人员欲利用上述系统和VP64蛋白促进特定基因表达，请设计促进细胞中已存在的基因X表达的方案。14．花青素是一种水溶性色素，属于黄酮类化合物，具有多种养生功效。如图是花青素合成酶基因（S）的cDNA（某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA）和Ti质粒图，科学家欲利用二者构建基因表达载体，培育出花青素含量更高的蓝莓。回答下列问题：（1）利用PCR技术扩增S基因时，需要引物，引物是指，设计引物时引物的长度需要比计算出的长度长一些，原因是。（2）根据图1和图2分析，上述基因表达载体的构建中应选择限制酶切割S基因的cDNA和Ti质粒，其目的是。图2Ti质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于。15．将含纳豆激酶原基因的表达组件Pnis﹣aprN整合到乳酸菌的基因组上，即可构建出食品级的基因工程菌，过程如图。XhoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SphⅠ为限制酶，origin表示复制原点，amp为氨苄抗性基因，cm为氯霉素抗性基因。请回答下列问题：（1）图1为载体pFY006的构建过程：首先利用限制酶获得质粒pFY005上的HisH基因，为保证载体pFY004与HisH基因正确连接，扩增HisH基因时，需在引物的（填3'或5'）端添加限制酶的识别序列。（2）图2为载体pFY007，研究团队利用限制酶SphⅠ对载体pFYO06和pFY007进行同源重组，将纳豆激酶原基因的表达组件Pnis﹣aprN整合到载体pFYO006上，构建出长度为4791bp的基因表达载体pFY008。为验证重组载体pFY008是否构建成功，需利用限制酶，通过技术检测酶切产物，得到大约bp的条带，若此条带大小与目的基因Pnis﹣aprN序列大小相符，则表明构建成功。（3）当pH值＜5.0时，纳豆激酶迅速失活，乳酸菌发酵后培养基pH值往往为3～4，分泌到细胞外的纳豆激酶可能失活。某科研团队欲利用蛋白质工程来解决此问题，应从出发，设计，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的或合成新的基因，从而获得所需要的纳豆激酶。

2026年高考生物模拟试卷必刷题——一．选择题（共7小题）题号1234567答案AACDADC二．多选题（共1小题）题号8答案AB一．选择题（共7小题）1．粪便无创DNA检测技术通过分析粪便中脱落肠道细胞的DNA来评估肠癌发病风险，具有无创便捷、灵敏度高等优点。该检测需采集粪便样本，进行DNA提取、扩增等过程。下列叙述正确的是（）A．提取DNA时，研磨液经过滤、离心后取上清液，再加入冷酒精 B．随着PCR反应进行，DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸数量逐步减少 C．因粪便中的DNA均源于肠壁脱落细胞，因此该技术的灵敏度高 D．若检测发现原癌基因并未突变，则可判断该检测者未得肠癌【考点】DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增与电泳鉴定．【专题】正推法；PCR技术；理解能力．【答案】A【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。【解答】解：A、提取DNA时，需裂解细胞释放DNA，离心后，除去细胞碎片等杂质沉淀，DNA存在于上清液中，DNA不溶于酒精，加入冷酒精可使DNA析出，A正确；B、PCR反应中，脱氧核苷酸和引物会被消耗而减少，但耐高温的DNA聚合酶在反应中不会被分解，数量不会“逐步减少”，B错误；C、粪便中的DNA不仅来自肠壁脱落细胞，还可能包含肠道微生物或食物残留的DNA，C错误；D、癌症发生是多个基因突变（如原癌基因和抑癌基因）共同作用的结果，仅原癌基因未突变不能排除癌症可能，D错误。故选：A。【点评】本题考查了DNA的提取好和PCR反应的相关内容，考查考生的理解和判断能力，难度适中。2．某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验。操作流程如下：①组织捣碎后加入研磨液充分研磨；②过滤取滤液，置于4℃冰箱静置分层；③取上清液加入等体积预冷的95%酒精；④离心后收集白色絮状沉淀物；⑤取部分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是（）A．步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶，所以冷酒精可使DNA快速析出 B．步骤⑤鉴定时，直接取白色絮状物与二苯胺混合，室温下放置观察颜色变化 C．若对提取物进行琼脂糖凝胶电泳，迁移距离越大的DNA片段分子量越大 D．步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中，需用高浓度NaCl溶液重新溶解【考点】DNA的粗提取与鉴定．【专题】正推法；基因工程；理解能力．【答案】A【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色。【解答】解：A、DNA不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，步骤③中使用预冷的95%酒精，可降低DNA的溶解度，同时抑制核酸酶活性以减少DNA降解，从而使DNA快速析出，A正确；B、鉴定DNA时，不能直接取白色絮状沉淀物与二苯胺试剂混合，DNA需先溶解在2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂并沸水浴加热，才能呈现蓝色，B错误；C、DNA分子在电场中向正极移动，分子量越大的DNA片段，迁移速度越慢，迁移距离越小，C错误；D、DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度较高，会溶解于滤液中，步骤②中滤液经4℃静置分层后，DNA主要存在于上清液中，而非沉淀，无需用高浓度NaCl溶液重新溶解，D错误。故选：A。【点评】本题主要考查DNA的粗提取与鉴定等知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。3．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（）A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计 B．据图可知，最后大量获得的ssDNA、与图中甲链的碱基序列相同 C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．【专题】模式图；PCR技术；理解能力．【答案】C【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。【解答】解：A、PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；B、非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B正确；C、扩增时耐高温DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3'端，C错误；D、因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离，因为电泳的原理是根据DNA相对分子量的大小设计的，D正确。故选：C。【点评】本题考查DNA片段的扩增与电泳鉴定等相关知识，旨在考查考生的理解能力和获取信息的能力，以及生命观念、科学思维的核心素养。4．如图甲、乙、丙分别是目的基因、质粒载体、重组DNA（重组质粒）的三个示意图，限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ．要获得理想的可表达目的基因的重组DNA，最佳的限制酶组合方式是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】模式图；基因工程．【答案】D【分析】1、用一种限制酶切割可能会导致目的基因与运载体反向连接以及目的基因自身环化。2、解答本题时应该根据图中RNA聚合酶的移动方向进行判断。【解答】解：A、只用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体可能会导致目的基因与运载体反向连接以及目的基因自身环化，A错误；B、根据重组DNA中RNA聚合酶的移动方向可知，用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体会导致目的基因与运载体连接后无法表达，B错误；C、根据重组DNA中RNA聚合酶的移动方向可知，用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体会导致目的基因与运载体连接后无法表达，C错误；D、用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体可得到丙图所示重组DNA，且能正常表达，D正确。故选：D。【点评】本题结合图解，考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的操作工具，解答本题的关键是根据图中限制酶切割位点及箭头方向判断。5．科学家利用蛋白质工程技术将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了10～12℃。下列说法正确的是（）A．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 B．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异 C．蛋白质工程在设计蛋白质结构时的依据是现有基因的脱氧核苷酸序列 D．蛋白质工程只能改造现有的蛋白质而不能制造新的蛋白质【考点】蛋白质工程基本原理．【专题】正推法；基因工程．【答案】A【分析】1、蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。2、蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。【解答】解：A、蛋白质工程的实质是定向改造或生产人类所需蛋白质，故蛋白质工程可以获得满足人类生产和生活需求的蛋白质，A正确；B、蛋白质工程和基因工程都要对基因进行操作，其操作对象相同，B错误；C、蛋白质工程在设计蛋白质结构时的依据是预期的蛋白质功能，C错误；D、蛋白质工程可以产生自然界中不存在的蛋白质，能制造新的蛋白质，D错误。故选：A。【点评】本题主要考查蛋白质工程的内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。6．如图为培育转基因山羊生产人β﹣酪蛋白的流程图，下列叙述错误的是（）A．过程①所用的人β﹣酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得 B．过程①所用载体应具备复制原点、标记基因、启动子、终止子等 C．过程④得到的人β﹣酪蛋白可从山羊的乳汁中提取 D．过程④人β﹣酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】模式图；基因工程．【答案】D【分析】根据题意和图示分析可知：①过程表示基因表达载体的构建，②表示胚胎移植，③表示胚胎分割移植，④表示人β﹣酪蛋白基因表达。【解答】解：A、过程①表示基因表达载体的构建，所用的人β﹣酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得，A正确；B、过程①所用载体应具备复制原点、标记基因、启动子、终止子等，B正确；C、过程④得到的人β﹣酪蛋白可从山羊的乳汁中提取，C正确；D、过程④人β﹣酪蛋白基因在细胞核内进行转录、在细胞质内进行翻译，D错误。故选：D。【点评】本题考查基因工程、动物细胞培养、胚胎移植等相关知识，意在考查学生识图能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题和解决问题的能力。7．关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段扩增产物的实验，下列叙述错误的是（）A．在一定的pH下DNA带上电荷，在电场中向着与它所带电荷相反的电极移动 B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关 C．为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．【专题】正推法；PCR技术；理解能力．【答案】C【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。【解答】解：A、DNA分子在pH高于其等电点的溶液中会带上负电荷，在电场中向正极移动。此描述符合电泳原理，A正确；B、DNA在凝胶中的迁移速率与其分子量（大小）成反比，且构象（如线状、环状、超螺旋）也会影响迁移速度，B正确；C、为避免外源DNA污染，实验中使用的微量离心管和枪头需进行灭菌处理（如高压蒸汽灭菌），而非仅消毒。消毒无法彻底灭活所有微生物，C错误；D、电泳后需用溴化乙锭（EB）等染色剂对DNA进行染色，紫外灯下可观察到荧光条带，D正确；故选：C。【点评】本题考查琼脂糖凝胶电泳的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。二．多选题（共1小题）（多选）8．基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述错误的是（）A．导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞 B．利用农杆菌转化法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上 C．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′﹣端进行子链合成 D．若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】正推法；基因工程；理解能力．【答案】AB【分析】将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T﹣DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。【解答】解：A、导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞，而是受精卵或早期胚胎细胞，A错误；B、农杆菌中的Ti质粒上的T﹣DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因插入Ti质粒的T﹣DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因的T﹣DNA整合到植物细胞中染色体的DNA上，B错误；C、引物的延伸方向为3'端，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'﹣端进行子链合成，C正确；D、启动子是位于DNA上RNA聚合酶的结合部位，mRNA是由基因启动子后面的序列编码而来的，若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，D正确。故选：AB。【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求考生能根据所学知识正确作答。三．解答题（共7小题）9．科研人员开发微生物细胞作为全细胞生物传感器，可以高效检测环境中的重金属污染程度。（1）为构建全细胞生物传感器，需先构建基因表达载体，需要用到的酶有限制酶和DNA连接酶。图1为基因表达载体的部分结构，除启动子和目的基因外，表达载体还需具备的元件有终止子、标记基因、复制原点。（2）要判断Gfp基因是否正确连接到质粒上，应对待测质粒进行PCR扩增及电泳鉴定，选择的引物是引物1和引物3。据图判断，Gfp基因的转录模板链是b链。（3）图2为重金属全细胞微生物传感器的生物识别与信号传输过程。据图分析重金属全细胞微生物传感器检测的原理是：转录因子结合重金属后与启动子上游序列结合，并促进启动子与RNA聚合酶结合，驱动目的基因的转录，最后检测绿色荧光蛋白的荧光强度以衡量环境中的重金属含量。【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】图文信息类简答题；正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）限制酶和DNA连接酶；终止子；标记基因（2）引物1和引物3；b（3）转录因子；RNA聚合酶；绿色荧光蛋白的荧光强度【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。（5）过程：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。【解答】解：（1）构建基因表达载体时，需先用限制酶切割目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端或平末端，再用DNA连接酶将两者连接，因此所需酶为限制酶和DNA连接酶。基因表达载体的组成包括启动子、目的基因、复制原点、终止子和标记基因。（2）为判断Gfp基因是否正确连接到质粒上，进行PCR扩增时，引物应分别结合在目的基因（Gfp基因）的两侧。由图1可知，引物1和引物3分别位于Gfp基因的两侧，故选择的引物为引物1和引物3。转录时，RNA聚合酶沿DNA模板链的3′→5′方向移动，合成mRNA的方向为5′→3′。根据图1中启动子方向和引物位置，Gfp基因的转录模板链为b链。（3）根据图2，重金属全细胞微生物传感器的检测原理是：转录因子结合重金属后，与启动子上游序列结合，进而促进RNA聚合酶与启动子结合，驱动Gfp基因的转录，最终通过检测绿色荧光蛋白的荧光强度来衡量环境中的重金属含量，因为重金属浓度影响转录因子与重金属的结合，从而影响绿色荧光蛋白的合成量及荧光强度。故答案为：（1）限制酶和DNA连接酶；终止子；标记基因（2）引物1和引物3；b（3）转录因子；RNA聚合酶；绿色荧光蛋白的荧光强度【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求学生能运用所学的知识正确作答。10．绿色荧光蛋白（GFP）是由238个氨基酸组成的单体蛋白，在蓝光诱导下会发光，可用于直接观察细胞中的活动。实验小组以质粒pMUTIN﹣gfp+为模板扩增gfp+基因，将其与质粒pMV24构建了重组质粒pMV24﹣gfp+，并在木葡糖酸醋杆菌中进行表达，证明其可作为选择标记用于今后的研究，重组质粒的构建过程如图所示。请回答下列问题：注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ、XbaⅠ、PvuⅡ表示三种限制酶。（1）利用PCR扩增目的基因时，每个循环依次经过变性、复性、延伸三个阶段，扩增过程中需在缓冲液中添加一定浓度的Mg2+，Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶。（2）以质粒pMUTIN﹣gfp+为模板扩增gfp+基因时，应当在引物的5′（填“5′”或“3′”）端添加EcoRⅠ、XbaⅠ两种限制酶的识别序列。用不同的限制酶切割目的基因和载体的原因是防止目的基因和质粒的自身环化；防止目的基因反向连接到质粒上（答出两点）。（3）重组质粒上的AmpR基因是一种标记基因，其作用是便于重组DNA分子的筛选，AmpR基因能作为标记基因的前提条件是木葡糖酸醋杆菌中不含（填“含有”或“不含”）AmpR基因。若要进一步检测重组质粒是否构建成功，可以用限制酶切割重组质粒，并用琼脂糖凝胶电泳法分离不同的DNA片段。【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；基因表达载体的构建．【专题】图文信息类简答题；正推法；PCR技术；基因工程；解决问题能力．【答案】（1）变性、复性、延伸激活耐高温的DNA聚合酶（2）5′EcoRⅠ、XbaⅠ防止目的基因和质粒的自身环化；防止目的基因反向连接到质粒上（3）便于重组DNA分子的筛选不含琼脂糖凝胶电泳【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的获取。第二步：基因表达载体的构建。第三步：将目的基因导入受体细胞。第四步：目的基因的检测和表达。【解答】解：（1）PCR技术扩增目的基因的一次循环要经过变性、复性和延伸三个阶段，扩增过程中需在缓冲液中添加一定浓度的Mg2+，Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶。（2）gfp+基因的两侧没有相应的限制酶切点，而DNA延伸的方向是5′端→3′端，因此要在5′端添加限制酶的识别序列。限制酶PruⅡ会破坏标记基因，因此应加入限制酶EcoRl和XbuI的识别序列。用不同的限制酶切割目的基因和质粒的原因是防止目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因反向连接到质粒上。（3）根据图示可知，标记基因的作用是筛选含重组质粒的受体细胞，故受体细胞应不含标记基因，不具有相应的抗性；实验室分离DNA片段的方法是琼脂糖凝胶电泳。故答案为：（1）变性、复性、延伸激活耐高温的DNA聚合酶（2）5′EcoRⅠ、XbaⅠ防止目的基因和质粒的自身环化；防止目的基因反向连接到质粒上（3）便于重组DNA分子的筛选不含琼脂糖凝胶电泳【点评】本题考查了基因工程的相关知识，考查了学生对相关知识的掌握程度和问题分析解答能力，难度中等。11．马铃薯块茎在储存中极易受损褐变发黑，导致其外观、味道、安全性下降。多酚氧化酶PPO可催化酚类物质形成褐色物质，是导致褐变的关键酶。为培育抗褐化能力强，并符合基因安全的新品种，研究者构建了目的基因StPPOi，表达产生与PPO基因转录产物互补的RNAi。将目的基因搭载在Gene—Deletor载体上（重组载体如图1所示），通过农杆菌介导，获得PPO基因沉默的马铃薯植株。经检测鉴定，发现褐变指数下降了80.78%。提取马铃薯器官中的外源基因，经PCR扩增后电泳分离（结果如图2所示）。请回答下列问题。（1）在构建的重组载体中，FLP基因的表达产物与限制酶的作用相似，均可以对DNA进行切割；抗卡那霉素基因的作用是便于重组DNA分子的筛选。（2）转基因马铃薯植株块茎在25℃、3天处理条件下，启动子Patatin可以启动基因的转录，表达的产物可阻断PPO基因的翻译（填“转录”或“翻译”），从而抑制PPO的合成。（3）转基因食品相对于传统食品，其有成本较低，农药使用量小，生产效率高等显著优势，但是转基因食品的安全性始终受到人们的质疑。上述研究中可采用2℃、3天处理此新品种，获得符合转基因安全的马铃薯，理由是低温使冷诱导启动子PCL启动FLP基因的表达，产生重组酶FLP，FLP特异性识别切除两个LF序列之间的外源基因。【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）限制便于重组DNA分子的筛选（2）Patatin翻译（3）低温使冷诱导启动子PCL启动FLP基因的表达，产生重组酶FLP，FLP特异性识别切除两个LF序列之间的外源基因【分析】基因工程：按照人们的意愿，把一种一种生物的某个基因提取出来，加以修饰，然后导入到另外一种生物的细胞中，定向的改造生物的遗传性状。【解答】解：（1）限制酶能够识别特定的DNA序列并在特定部位切割DNA，FLP基因的表达产物可以对DNA进行切割，所以其作用与限制酶相似。抗卡那霉素基因作为标记基因，在基因工程中便于重组DNA分子的筛选，含有该基因的受体细胞能在含卡那霉素的培养基上生长，从而筛选出含有重组载体的细胞。（2）从图中可知，在25℃、3天处理条件下，启动子Patatin可以启动基因的转录。因为目的基因SepPO表达产生与P﹣PPO基因转录产物互补的RNA，所以表达的产物可阻断PPO基因的翻译过程，使PPO基因不能合成相应蛋白质。（3）低温（2℃、3天处理）时，冷诱导启动子PCL启动FLP基因的表达，产生重组酶FLP，FLP能特异性识别并切除两个FLP序列之间的外源基因，这样就去除了转基因过程中导入的外源基因，从而获得符合转基因安全的马铃薯。故答案为：（1）限制便于重组DNA分子的筛选（2）Patatin翻译（3）低温使冷诱导启动子PCL启动FLP基因的表达，产生重组酶FLP，FLP特异性识别切除两个LF序列之间的外源基因【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。12．为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。（1）将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用Ca2+处理大肠杆菌。（2）PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，推测M蛋白脱离启动子P，PE表达产物可使E蛋白重新磷酸化。②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理存在葡萄糖时，葡萄糖进入细胞使M蛋白脱离启动子P，PE基因表达，产生荧光；无葡萄糖时，M蛋白结合启动子P，PE基因不表达，无荧光。③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测葡萄糖摄取量和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。（3）在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pec，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“﹣”表示相应蛋白脱离。条件Pc中c蛋白的结合序列M蛋白的结合序列无葡萄糖++低浓度葡萄糖ⅰ．+ⅱ．﹣高浓度葡萄糖ⅲ．﹣ⅳ．﹣【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】图文信息类简答题；基因工程；解决问题能力．【答案】（1）Ca2+（2）脱离启动子P；存在葡萄糖时，葡萄糖进入细胞使M蛋白脱离启动子P，PE基因表达，产生荧光；无葡萄糖时，M蛋白结合启动子P，PE基因不表达，无荧光；葡萄糖摄取量（3）+；﹣；﹣；﹣【分析】基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取：从基因组文库或cDNA文库筛选、PCR扩增：设计引物扩增特定基因片段、人工合成：已知序列的短基因（如胰岛素基因）。2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体用限制酶切割后，通过DNA连接酶连接。3、将重组DNA导入受体细胞原核细胞（如大肠杆菌）：用Ca2+处理使其成为感受态细胞，吸收重组质粒。真核细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法。4、筛选与鉴定：抗性筛选、PCR鉴定、核酸杂交、表达产物检测。【解答】解：（1）将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌时，应先用Ca2+处理大肠杆菌。（2）①推测M蛋白的作用：当存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，此时M蛋白与启动子P脱离。这是因为葡萄糖的代谢产物可能改变了M蛋白的构象或磷酸化状态，使其失去对启动子的亲和力，从而解除对PE基因和GFP基因的转录抑制。②生物传感器的工作原理：无葡萄糖时M蛋白结合在启动子P上，抑制PE基因和GFP基因的转录，因此细胞不产生GFP，无荧光信号。有葡萄糖时葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，导致M蛋白脱离启动子P。此时启动子P启动PE基因和GFP基因的转录，PE酶使E蛋白重新磷酸化以维持葡萄糖摄取，同时GFP表达产生荧光。荧光强度与葡萄糖摄取量正相关，从而实现对葡萄糖摄取状态的监测。③验证生物传感器可靠性的检测指标：在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测葡萄糖消耗量和荧光强度。若二者呈正相关，则证明荧光信号可可靠反映葡萄糖摄取量。（3）调控机制解释：低浓度葡萄糖时C蛋白仍能结合Pc（+），启动子Pc被激活；同时，葡萄糖的存在使M蛋白脱离启动子（﹣），PE基因和GFP基因高效表达，促进葡萄糖摄取。高浓度葡萄糖抑制C蛋白与Pc的结合（﹣），启动子Pc活性降低；同时，M蛋白仍保持脱离状态（﹣），但由于Pc失活，PE基因和GFP基因表达量下降，从而减少葡萄糖摄取，避免浪费。这种双调控机制使生物传感器能根据葡萄糖浓度动态调整基因表达，优化目标产物的生产过程。故答案为：（1）Ca2+（2）脱离启动子P；存在葡萄糖时，葡萄糖进入细胞使M蛋白脱离启动子P，PE基因表达，产生荧光；无葡萄糖时，M蛋白结合启动子P，PE基因不表达，无荧光；葡萄糖摄取量（3）+；﹣；﹣；﹣【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。13．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，科研人员对其进行了一系列改造。（1）Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图1）。复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合。复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发基因突变。（2）将编码Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，与Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但与sgRNA结合等功能不变。构建能够表达dCas9的质粒A，设计一系列与红色荧光蛋白基因（RFP基因）上游不同部位结合的sgRNA序列（如图2），并以此为依据构建能表达sgRNA的质粒B，将质粒A、B共同导入含有RFP基因的大肠杆菌，测定大肠杆菌红色荧光强度，实验结果如图3所示。实验结果显示，对照组的红色荧光强度约为sgRNA3组的100倍。由实验结果可以得出：dCas9能抑制基因表达，sgRNA的结合位置距RNA聚合酶结合位点越近，对基因表达的抑制作用越强。（3）VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段。科研人员欲利用上述系统和VP64蛋白促进特定基因表达，请设计促进细胞中已存在的基因X表达的方案。根据X基因的RNA聚合酶结合位点上游序列设计sgRNA，合成相应基因并构建基因表达载体；构建dCas9﹣VP64的融合蛋白表达载体；将上述表达载体导入受体细胞。【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】图文信息类简答题；正推法；基因工程；解决问题能力．【答案】（1）碱基互补配对基因突变（2）100dCas9能抑制基因表达，sgRNA的结合位置距RNA聚合酶结合位点越近，对基因表达的抑制作用越强（3）根据X基因的RNA聚合酶结合位点上游序列设计sgRNA，合成相应基因并构建基因表达载体；构建dCas9﹣VP64的融合蛋白表达载体；将上述表达载体导入受体细胞【分析】1、CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）sCRISPR/Cas9系统基因编辑技术中的gRNA可通过碱基互补配对原则与目的基因特异性结合，进而特异性的识别目的基因；然后随机插入、删除或替换部分碱基将导致基因结构的改变，因此属于基因突变。（2）由图3柱形图可知，对照组的红色荧光强度相对值为1000，sgRNA3组的荧光强度相对值约为10，故对照组的红色荧光强度约为sgRNA3组的1000÷10＝100倍。由实验结果可知，sgRNA1组和对照组的荧光强度相对值相同，sgRNA2组和sgRNA3组的荧光强度降低，说明sgRNA距离转录起始点越近，抑制目的基因表达作用越强。（3）VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因的转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段，而sgRNA具有识别作用，因此可根据基因X的序列设计sgRNA，使其能识别X基因的RNA聚合酶识别序列，让VP64蛋白与该sgRNA结合形成复合体。故答案为：（1）碱基互补配对基因突变（2）100dCas9能抑制基因表达，sgRNA的结合位置距RNA聚合酶结合位点越近，对基因表达的抑制作用越强（3）根据X基因的RNA聚合酶结合位点上游序列设计sgRNA，合成相应基因并构建基因表达载体；构建dCas9﹣VP64的融合蛋白表达载体；将上述表达载体导入受体细胞【点评】本题主要考查基因工程的相关知识，意在考查考生识图能力和理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。14．花青素是一种水溶性色素，属于黄酮类化合物，具有多种养生功效。如图是花青素合成酶基因（S）的cDNA（某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA）和Ti质粒图，科学家欲利用二者构建基因表达载体，培育出花青素含量更高的蓝莓。回答下列问题：（1）利用PCR技术扩增S基因时，需要引物，引物是指一小段能与DNA母链的部分碱基序列互补配对的短单链核酸，设计引物时引物的长度需要比计算出的长度长一些，原因是为了降低非特异性结合。（2）根据图1和图2分析，上述基因表达载体的构建中应选择限制酶XbaⅠ、HindⅢ切割S基因的cDNA和Ti质粒，其目的是保证目的基因（S基因）与载体正向连接，从而提高重组效率。图2Ti质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞。【考点】基因工程的操作过程综合．【专题】图文信息类简答题；正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）一小段能与DNA母链的部分碱基序列互补配对的短单链核酸为了降低非特异性结合（2）XbaⅠ、HindⅢ保证目的基因（S基因）与载体正向连接，从而提高重组效率筛选含有基因表达载体的受体细胞【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）DNA复制时需要引物才能进行子链的延伸，引物是一段能与DNA母链的部分碱基序列互补配对的短单链核酸。设计引物时引物的长度要比计算出的长一些，是为了降低非特异性结合，因为引物过短，特异性差，容易与其他部位结合。（2）花青素合成酶基因（基因S）为目的基因，构建基因表达载体时选择限制酶，要保证不破坏目的基因和标记基因，所以图中应选择限制酶XhoⅠ、HindⅢ，目的是保证目的基因与运载体正确连接，从而提高重组效率。Ti质粒中的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含基因表达载体的受体细胞，通过在含有相应抗生素的培养基上培养受体细胞，能存活的就是含有重组质粒（含标记基因）的细胞。故答案为：（1）一小段能与DNA母链的部分碱基序列互补配对的短单链核酸为了降低非特异性结合（2）XbaⅠ、HindⅢ保证目的基因（S基因）与载体正向连接，从而提高重组效率筛选含有基因表达载体的受体细胞【点评】本题考查基因工程的相关知识，难度适中，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，能够结合题中信息灵活运用所学知识分析作答。15．将含纳豆激酶原基因的表达组件Pnis﹣aprN整合到乳酸菌的基因组上，即可构建出食品级的基因工程菌，过程如图。XhoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SphⅠ为限制酶，origin表示复制原点，amp为氨苄抗性基因，cm为氯霉素抗性基因。请回答下列问题：（1）图1为载体pFY006的构建过程：首先利用限制酶BamHⅠ获得质粒pFY005上的HisH基因，为保证载体pFY004与HisH基因正确连接，扩增HisH基因时，需在引物的5'（填3'或5'）端添加限制酶HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列。（2）图2为载体pFY007，研究团队利用限制酶SphⅠ对载体pFYO06和pFY007进行同源重组，将纳豆激酶原基因的表达组件Pnis﹣aprN整合到载体pFYO006上，构建出长度为4791bp的基因表达载体pFY008。为验证重组载体pFY008是否构建成功，需利用限制酶SphⅠ，通过琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切产物，得到大约1484bp的条带，若此条带大小与目的基因Pnis﹣aprN序列大小相符，则表明构建成功。（3）当pH值＜5.0时，纳豆激酶迅速失活，乳酸菌发酵后培养基pH值往往为3～4，分泌到细胞外的纳豆激酶可能失活。某科研团队欲利用蛋白质工程来解决此问题，应从预期的纳豆激酶的功能出发，设计预期的纳豆激酶的结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因，从而获得所需要的纳豆激酶。【考点】蛋白质工程基本原理；基因工程的操作过程综合．【专题】正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）BamHⅠ；5'；HindⅢ和EcoRⅠ（2）SphⅠ；琼脂糖凝胶电泳；1484（3）预期的纳豆激酶的功能；预期的纳豆激酶的结构；脱氧核苷酸序列【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【解答】解：（1）据图可知，质粒pFY005上的HisH基因的上游和下游均有BamHⅠ的酶切位点，因此，要获得质粒pFY005上的HisH基因需用限制酶BamHⅠ切割。分析图1中重组质粒，HisH基因的上游、下游分别有EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，而SphⅠ的酶切位点位于基因内部，因此，为保证载体pFY004与HisH基因正确连接，需在扩增HisH基因的引物对的5'端加上限制酶HindⅢ和EcoRⅠ的序列。（2）利用限制酶SphⅠ对载体pFYO06和pFY007进行同源重组，构建出长度为4791bp的基因表达载体pFY008，验证重组载体pFY008是否构建成功，可用限制酶SphⅠ切割。通过琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切产物，基因表达载体pFY008长度是4791bp，pFY006的长度是3307bp，二者之间的差值即目的基因的大小，4791﹣3307＝1484bp；因此，若得到1484bp左右的条带，条带大小与目的基因Pnis﹣aprN基本相符，则表明构建成功。（3）根据蛋白质工程的一般技术流程，要利用蛋白质工程解决题述问题，需从预期的纳豆激酶功能出发，设计预期的纳豆激酶的结构，并推测应有的氨基酸序列，再找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（或合成新基因），从而获得所需的纳豆激酶。故答案为：（1）BamHⅠ；5'；HindⅢ和EcoRⅠ（2）SphⅠ；琼脂糖凝胶电泳；1484（3）预期的纳豆激酶的功能；预期的纳豆激酶的结构；脱氧核苷酸序列【点评】本题结合实际应用情境考查基因工程的相关知识，难度适中，要求学生掌握相关的基础知识，并能够灵活运用所学知识分析、解决实际问题。

考点卡片1．DNA的粗提取与鉴定【知识点的认识】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。【命题方向】下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（）A．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水涨破，释放DNAB．在新鲜猪血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心取血细胞液C．在含有DNA的2mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水，搅拌出现丝状物后停止加水D．鉴定DNA时，将丝状物溶解于2mol/L的氯化钠溶液中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴分析：DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。解答：A、植物材料需先用洗涤剂破坏细胞膜，再吸水涨破，释放DNA，A错误；B、哺乳动物（猪血）成熟的红细胞没有DNA，不能用于提取DNA，在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，目的是防止血液凝固，混合均匀后离心，取血细胞的沉淀物，B错误；C、在含有DNA的2mol/L的氯化钠溶液中加入蒸馏水，NaCl的浓度逐渐降低，DNA析出，待丝状物不再增加后停止加水，C错误；D、鉴定DNA时，将丝状物溶解于水中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴，出现蓝色，D正确。故选：D。点评：本题主要考查的是DNA的粗提取与鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。【解题思路点拨】掌握DNA的粗提取与鉴定的相关知识是解题的关键。2．基因表达载体的构建【知识点的认识】构建基因表达载体的过程：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。【命题方向】构建基因表达载体的过程是基因