核心考点 DAY 08-基因工程-2核酸和PCR（填空版）

核心考点DAY08《基因工程》-2（核酸和PCR）专题01.遗传物质（做题时注意：对象）（1）生物界（所有生物）：因为绝大多数生物的遗传物质是DNA,所以说。（2）具体生物：其遗传物质是。(只能是一种)原核生物（如细菌）的遗传物质是______，真核生物的遗传物质是_____，T2噬菌体的遗传物质是。烟草花叶病毒的遗传物质是______。HIV病毒的遗传物质是________。02.基因：通常是。（1）以DNA为遗传物质的生物，基因是。（2）以RNA为遗传物质的生物，基因是。03.DNA的结构：（1）一个双链DNA分子(链状)具有个游离的磷酸基团，而环状DNA分子具有个游离的磷酸基团。1个脱氧核糖与个磷酸基团连接。（2）氢键的形成不需要酶，但断裂需或处理。（3）G-C碱基对比例越大，DNA热稳定性越。（4）相邻的碱基在DNA分子的一条单链中通过—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—相连接，互补的碱基在DNA的双链之间通过相连接。（5）下图表示DNA双螺旋结构的简化形式，其中①是，②是。解旋酶作用于部位，限制性内切核酸酶和DNA连接酶作用于部位。（6）核苷酸04.DNA的复制和PCR技术DNA复制PCR技术原理解旋场所（真核）主要在，也在、。细胞外（在PCR仪中）酶、普通的合成子链在引物基础上，一条链连续合成；另一条链合成，再由连接。分别从两条链的端开始延伸，都是（连续/不连续）合成。过程边边→→产物完整DNA温度细胞内温和条件需控制，在较（高/低）温度下引物原料脱氧核苷酸（或dNTP）dNTPdNTP焦磷酸焦磷酸子链子链模板链DNA复制模板链DNA复制DNA复制：半保留复制、双向复制、多起点复制、DNA复制：半保留复制、双向复制、多起点复制、半不连续复制、边解旋边复制（1）引物：（选择性必修3P77）（2）自然界中的DNA复制和PCR为什么都需要引物？原因是：DNA聚合酶：能够从的（3′/5′）端开始连接脱氧核苷酸，子链的延伸方向为→。【DNA聚合酶只能将单个的dNTP连接到已有片段（引物）的3′端。】（3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加。（4）在PCR过程中实际加入的为(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的，又可为DNA的合成提供。（故PCR过程中不用另外加入能量）（5）PCR（可以/不可以）扩增mRNA吗？原因是：。（选择性必修3P79）（6）PCR技术的关键点：PCR技术是扩增的DNA片段。需将人工构建的限制酶识别序列添加到引物的端（填:”5′”、”3′”）例1.（2022，山东，节选）(2)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（）例2（2025届高三调研卷·广州零模卷，T21节选）（3）采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出现正向连接（图中箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选用引物（填序号）进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是。（7）PCR过程中，延伸时需要加入两种引物，原因是:。05.PCR技术专题Ⅰ.PCR技术“引物”归类分析（1）引物的设计：两种引物的要求：①引物自身不能。②两种引物之间不能。③引物长度不宜过短，防止引物。例3.(经典高考题节选)设计引物时需要避免引物之间发生_____________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且____________的引物需要设定更高的复性温度。例4.(2020·山东，25节选)（1）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________。(2)科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是_____________________________________________。若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是_____________________________。例5.(2024·山东，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有()A.①②B.②③C.①④D.③④（2）引物的修饰例6.(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是____________________________________________________________________________________________。（3）引物的结合方向例7.如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：扩增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________；__________________________。（4）引物的选择例8.（2023·山东）科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________________________(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。例9.（2025•浙江，1月）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：

(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要。(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的（A．P1和P2

B．P3和P4C．P1和P4D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有功能。(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的进行比对。将Gpd基因的编码区与连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。çç（5）引物的数量计算çççç①已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNAçç的结合位点如右图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。选择性必修3P78,图3-5②已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如右图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。③已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如下图所示，在第_____轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。一个DNA分子n次扩增，A.子代DNA分子中等长链的DNA分子数为________个；B.子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为_____个；C.子代DNA分子中含模板链DNA分子数为_____个；D.子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为________个；E.复制过程中共需引物________个；F.第n次复制需要引物______个。Ⅱ.PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上电荷或电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的和等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的下被检测出来。(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是()琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置琼脂糖在同一电场作用下，DNA片段越长，琼脂糖Lane1:DL2000DNAMarkerLane2:gfp基因PCR对照Lane1:DL2000DNAMarkerLane2:gfp基因PCR对照Lane3-6:各组PCR样品绿色荧光蛋白(gfp)基因相对分子质量量为750bp左右D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来Ⅲ.PCR技术的应用(1)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式例10.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是__________________。(2)利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变例11.如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。下列说法不正确的是()A.PCR1所用引物应为引物A和BB.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板C.PCR3无需额外加入引物D.PCR4的作用是大量扩增突变基因(3)利用重叠延伸PCR技术构造融合基因例12.融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧)，叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题：(1)图1第一阶段中PCR至少进行______次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_____种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有____种。(3)图2中需使用______________(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。(4)利用反向PCR技术扩增未知基因序列例13.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)。请据图回答问题：(1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。(2)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′例14.（2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（）A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子(5)实时荧光定量PCR例15.实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是()A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1种引物和1种Taqman探针C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小(6)“双脱氧法”基因测序双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延伸便终止。(2)每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。例16.(双选)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（）A.上述PCR反应体系中只加入一种引物B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G(7)不对称PCR例17.(2025·广州市三模)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列