川芎嗪通过ROS转逆人肝癌多药耐药细胞耐药的研究

川芎嗪通过ROS转逆人肝癌多药耐药细胞耐药的研究摘要本研究旨在探究川芎嗪逆转人肝癌多药耐药细胞耐药的作用及与活性氧（ROS）的关系。通过建立人肝癌多药耐药细胞模型，运用多种实验技术，分析川芎嗪对耐药细胞的影响。结果表明，川芎嗪能够有效逆转人肝癌多药耐药细胞的耐药性，其机制与调节ROS水平相关，为肝癌多药耐药的治疗提供了新的思路和理论依据。关键词川芎嗪；人肝癌多药耐药细胞；活性氧（ROS）；耐药逆转一、引言肝癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。多药耐药（MultidrugResistance，MDR）现象是导致肝癌化疗失败的主要原因，极大地限制了化疗药物的疗效。MDR指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时，对其他结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药。目前，克服肝癌多药耐药已成为肿瘤治疗领域亟待解决的关键问题。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是中药川芎的主要生物碱有效成分，具有多种药理活性。近年来研究发现，川芎嗪在肿瘤治疗方面展现出一定潜力，能够部分逆转肿瘤细胞的耐药性，但其具体作用机制尚未完全明确。活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）作为细胞内一类具有高度活性的氧分子，在肿瘤细胞的耐药过程中发挥着重要作用。已有研究表明，调节细胞内ROS水平可能是逆转肿瘤多药耐药的潜在途径。因此，深入研究川芎嗪通过ROS转逆人肝癌多药耐药细胞耐药的作用机制，具有重要的理论意义和临床应用价值。二、材料与方法2.1实验材料人肝癌细胞株HepG2及其多药耐药细胞株HepG2/ADM购自中国典型培养物保藏中心。川芎嗪标准品购自Sigma公司，阿霉素（Doxorubicin，DOX）、罗丹明-123（Rhodamine-123，Rho123）、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐（2′,7′-DichlorofluorescinDiacetate，DCFH-DA）等试剂均购自美国Invitrogen公司。胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、RPMI1640培养基购自Gibco公司。蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Westernblot相关抗体购自碧云天生物技术有限公司。2.2细胞培养HepG2细胞和HepG2/ADM细胞均培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。定期更换培养基，待细胞融合度达到80%-90%时进行传代。HepG2/ADM细胞培养过程中需加入终浓度为0.5μg/mL的阿霉素以维持其耐药性。2.3细胞增殖抑制实验（MTT法）将对数生长期的HepG2细胞和HepG2/ADM细胞分别接种于96孔板，每孔接种5×10³个细胞，培养24h后，加入不同浓度的川芎嗪（0、50、100、200、400、800μmol/L）和阿霉素（0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L），每组设置6个复孔。继续培养48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，弃去上清液，加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处检测各孔吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。根据抑制率计算半数抑制浓度（IC50），并计算耐药指数（ResistanceIndex，RI），RI=HepG2/ADM细胞IC50/HepG2细胞IC50。2.4细胞内药物蓄积实验取对数生长期的HepG2/ADM细胞，接种于6孔板，每孔接种2×10⁵个细胞，培养24h后，分为对照组、川芎嗪组（200μmol/L）、阿霉素组（1μmol/L）和川芎嗪+阿霉素组（川芎嗪200μmol/L+阿霉素1μmol/L）。各组分别处理24h后，弃去培养基，PBS洗涤3次，加入含1μmol/LRho123的无血清培养基，37℃孵育30min，PBS洗涤3次。使用流式细胞仪检测细胞内Rho123的荧光强度，以反映细胞内药物蓄积情况。2.5ROS水平检测采用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平。将对数生长期的HepG2/ADM细胞接种于6孔板，每孔接种2×10⁵个细胞，培养24h后，分为对照组、川芎嗪组（不同浓度：50、100、200μmol/L）。各组分别处理24h后，弃去培养基，PBS洗涤3次，加入含10μmol/LDCFH-DA的无血清培养基，37℃孵育20min，PBS洗涤3次。使用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光强度，同时使用流式细胞仪检测荧光强度的平均值，以评估细胞内ROS水平。2.6Westernblot检测相关蛋白表达收集不同处理组的HepG2/ADM细胞，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS电泳，转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，加入相应的一抗（P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP-1）、谷胱甘肽S-转移酶π（GST-π）、NADPH氧化酶4（NOX4）、超氧化物歧化酶2（SOD2）等抗体），4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min。使用化学发光试剂显影，ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。2.7统计学分析实验数据采用SPSS22.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异具有统计学意义。三、实验结果3.1川芎嗪对HepG2和HepG2/ADM细胞增殖的影响MTT实验结果显示，川芎嗪对HepG2细胞和HepG2/ADM细胞的增殖均有一定的抑制作用，且呈浓度依赖性。随着川芎嗪浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高。HepG2/ADM细胞对阿霉素的IC50值为（12.56±1.32）μmol/L，显著高于HepG2细胞的（0.14±0.03）μmol/L，RI为89.71，表明HepG2/ADM细胞具有明显的多药耐药性。当加入不同浓度的川芎嗪后，HepG2/ADM细胞对阿霉素的敏感性显著提高，IC50值降低。其中，200μmol/L川芎嗪处理组，HepG2/ADM细胞对阿霉素的IC50值降至（3.15±0.45）μmol/L，与未加川芎嗪的阿霉素组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），提示川芎嗪能够有效逆转HepG2/ADM细胞对阿霉素的耐药性。3.2川芎嗪对HepG2/ADM细胞内药物蓄积的影响流式细胞仪检测结果显示，对照组HepG2/ADM细胞内Rho123荧光强度较低，表明细胞对药物外排能力较强，药物蓄积较少。阿霉素组细胞内Rho123荧光强度略有升高，但不明显。川芎嗪组（200μmol/L）细胞内Rho123荧光强度较对照组有所升高，而川芎嗪+阿霉素组细胞内Rho123荧光强度显著高于对照组和阿霉素组（P<0.05），表明川芎嗪能够抑制HepG2/ADM细胞的药物外排功能，增加细胞内药物蓄积，从而提高细胞对阿霉素的敏感性。3.3川芎嗪对HepG2/ADM细胞内ROS水平的影响荧光显微镜观察结果显示，对照组HepG2/ADM细胞内绿色荧光较弱，表明细胞内ROS水平较低。随着川芎嗪浓度的增加，细胞内绿色荧光强度逐渐增强。流式细胞仪检测结果进一步证实，与对照组相比，50、100、200μmol/L川芎嗪处理组细胞内ROS荧光强度平均值显著升高（P<0.05），且呈浓度依赖性，说明川芎嗪能够诱导HepG2/ADM细胞内ROS水平升高。3.4川芎嗪对HepG2/ADM细胞耐药相关蛋白表达的影响Westernblot结果显示，与对照组相比，HepG2/ADM细胞中P-gp、MRP-1和GST-π蛋白表达水平显著升高（P<0.05），表明这些蛋白在HepG2/ADM细胞耐药过程中发挥重要作用。经过200μmol/L川芎嗪处理后，P-gp、MRP-1和GST-π蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。同时，检测ROS相关蛋白发现，NOX4蛋白表达水平在川芎嗪处理后显著升高（P<0.05），而SOD2蛋白表达水平显著降低（P<0.05），提示川芎嗪可能通过调节NOX4和SOD2的表达，影响细胞内ROS水平，进而逆转HepG2/ADM细胞的耐药性。四、讨论肝癌多药耐药是一个复杂的生物学过程，涉及多种机制。其中，药物外排泵的过度表达是导致肿瘤细胞多药耐药的重要原因之一。P-gp、MRP-1等药物外排泵能够将进入细胞内的化疗药物泵出细胞外，降低细胞内药物浓度，从而使肿瘤细胞产生耐药性。本研究中，成功建立了人肝癌多药耐药细胞株HepG2/ADM，该细胞对阿霉素的耐药指数高达89.71，且对多种化疗药物存在交叉耐药。通过MTT实验和细胞内药物蓄积实验证实，川芎嗪能够显著提高HepG2/ADM细胞对阿霉素的敏感性，抑制细胞的药物外排功能，增加细胞内药物蓄积，表明川芎嗪具有逆转人肝癌多药耐药细胞耐药的作用。ROS是细胞有氧代谢过程中产生的一类具有高度活性的氧分子，包括超氧阴离子（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、羟自由基（・OH）等。正常情况下，细胞内ROS的产生和清除处于动态平衡状态。然而，在肿瘤细胞中，ROS水平往往发生改变，并且与肿瘤细胞的耐药性密切相关。一方面，过高的ROS水平可导致细胞损伤和凋亡；另一方面，肿瘤细胞也可通过上调抗氧化防御系统，增强对ROS的耐受性，从而产生耐药。本研究结果表明，川芎嗪能够诱导HepG2/ADM细胞内ROS水平升高，且呈浓度依赖性。同时，发现川芎嗪处理后，细胞内NOX4蛋白表达增加，SOD2蛋白表达减少。NOX4是一种重要的ROS生成酶，其表达增加可促进ROS的产生；而SOD2是一种抗氧化酶，能够催化超氧阴离子转化为过氧化氢，其表达减少则削弱了细胞的抗氧化能力，进一步导致ROS水平升高。因此，推测川芎嗪可能通过调节NOX4和SOD2的表达，打破细胞内ROS的平衡，使ROS水平升高，从而发挥逆转耐药的作用。此外，研究还发现川芎嗪能够降低HepG2/ADM细胞中P-gp、MRP-1和GST-π等耐药相关蛋白的表达。P-gp、MRP-1作为药物外排泵，其表达降低可减少药物外排，增加细胞内药物浓度；GST-π是一种参与细胞解毒过程的酶，其表达降低可减弱细胞对化疗药物的解毒能力，从而提高细胞对化疗药物的敏感性。已有研究表明，ROS水平的改变可影响耐药相关蛋白的表达。例如，ROS可通过激活某些信号通路，调节P-gp等蛋白的转录和翻译过程。因此，川芎嗪通过升高ROS水平，可能间接影响了P-gp、MRP-1和GST-π等耐药相关蛋白的表达，从而逆转人肝