TUNEL染色操作及结果判读

TUNEL染色操作及结果判读细胞凋亡作为细胞程序性死亡的核心过程，在胚胎发育、组织稳态维持及肿瘤、神经退行性疾病等病理进程中发挥关键作用。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）是检测细胞凋亡的经典技术，通过识别凋亡细胞DNA断裂产生的3’-羟基末端，实现凋亡事件的可视化与定量分析。本文结合实践经验，系统阐述TUNEL染色的操作流程、结果判读要点及优化策略，为科研工作者提供实用参考。一、实验原理凋亡细胞的基因组DNA会发生特征性断裂（如核小体间DNA片段化），产生大量带有3’-OH游离末端的DNA链。TUNEL技术利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化活性，将标记的dUTP（如荧光素、地高辛或生物素标记）连接到这些3’-OH末端；通过荧光显微镜（荧光标记）或酶联显色（如HRP-抗地高辛抗体+DAB显色），即可在细胞或组织水平定位并定量凋亡细胞。二、操作流程（以荧光标记TUNEL为例）1.样本制备与预处理细胞样本（爬片/悬液）：对数生长期细胞接种于爬片，密度达50%~70%时，用4%多聚甲醛（PFA）室温固定20~30分钟（固定时间过长会降低细胞膜通透性）；PBS洗涤3次（每次5分钟）后，用0.1%TritonX-100（PBS配制）室温通透10分钟（悬浮细胞可缩短至5分钟），再次PBS洗涤。组织切片（石蜡/冰冻切片）：石蜡切片需先脱蜡（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟）、梯度乙醇复水（100%→95%→75%→水，各5分钟）；冰冻切片直接用4%PFA固定20分钟。后续通透步骤同细胞样本，若为石蜡切片，可在通透前用蛋白酶K（20μg/mL，37℃）消化15分钟以增强通透性。2.试剂准备与染色体系构建TUNEL反应液配制：按试剂盒说明书比例混合TdT酶与dUTP标记液（如荧光素-dUTP），现配现用（TdT酶需冰上保存，避免反复冻融）。封闭处理：滴加5%BSA（PBS配制）室温封闭30分钟，减少非特异性结合（若样本自发荧光强，可延长封闭至1小时）。3.TUNEL染色与复染吸去封闭液，滴加TUNEL反应液覆盖样本，37℃湿盒避光孵育60分钟（低凋亡样本可延长至90分钟）。PBS洗涤3次（每次5分钟）后，滴加DAPI染液（1:1000稀释）室温复染10分钟，标记所有细胞核。抗荧光淬灭封片剂封片，避光保存待镜检。三、结果判读要点1.阳性细胞识别荧光成像：凋亡细胞的细胞核呈现TUNEL标记的荧光信号（如绿色），DAPI复染的细胞核为蓝色。典型凋亡细胞的荧光信号多呈“碎裂状”或“环状”（核固缩、碎裂特征），而正常细胞仅显示DAPI的蓝色核。酶联显色：凋亡细胞的细胞核被DAB染成棕色，苏木精复染的细胞核为蓝色，需结合形态学特征（核浓缩、碎裂）判断。2.阴性与阳性对照设置阴性对照：不加TdT酶，仅用dUTP标记液孵育，应无明显荧光/棕色信号（若出现背景，提示非特异性结合）。阳性对照：用DNaseⅠ（10U/mL，37℃处理10分钟）预处理样本，人为诱导DNA断裂，阳性细胞比例应显著升高（通常>50%）。3.定量分析策略视野选择：随机选取5~10个不重叠的高倍视野（×200或×400），避免边缘或折片区域。计数方法：统计每个视野中TUNEL阳性细胞数（荧光/棕色核）与总细胞数（DAPI/苏木精核），计算凋亡率=（阳性细胞数/总细胞数）×100%。注意事项：若样本存在自发荧光（如脂肪组织、某些肿瘤组织），需在相同曝光条件下拍摄阴性对照，用“阳性信号强度-背景强度”校正后再计数。四、关键注意事项1.样本处理时效性：细胞凋亡是动态过程，样本应在处理后24小时内完成染色，避免凋亡信号衰减。2.试剂稳定性：TdT酶对温度敏感，需分装后-20℃保存；dUTP标记液避免光照，使用前平衡至室温。3.洗涤充分性：每步洗涤需用新鲜PBS，且振荡轻柔，防止细胞脱落（爬片样本需特别注意）。五、常见问题及优化方案问题现象可能原因解决策略-------------------------------------------------------------------------------背景荧光/染色过高封闭不充分、洗涤不足延长封闭时间（至1小时）、增加洗涤次数（4次×5分钟）阳性信号微弱TdT酶失活、孵育时间短更换新鲜酶液、延长孵育至90分钟非特异性染色通透剂浓度过高降低TritonX-100浓度（如0.05%）或缩短通透时间细胞脱落爬片处理不当增加多聚赖氨酸包被爬片的时间（≥30分钟）结语TUNEL染色的准确性依赖标准化操作与严谨的结果判读。通过优化样本处理、严格对