单细胞空间转录组学在肿瘤微环境中的应用

单细胞空间转录组学在肿瘤微环境中的应用演讲人01引言：肿瘤微环境研究的困境与单细胞空间转录组学的崛起02解析肿瘤微环境细胞异质性：从“细胞类型”到“功能亚群”03重构肿瘤微环境空间结构：从“细胞分布”到“功能网络”04临床转化与未来挑战：从“实验室发现”到“临床应用”目录单细胞空间转录组学在肿瘤微环境中的应用01引言：肿瘤微环境研究的困境与单细胞空间转录组学的崛起引言：肿瘤微环境研究的困境与单细胞空间转录组学的崛起在肿瘤生物学领域，肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）的研究已从传统的“肿瘤细胞中心论”转向“多细胞互作网络论”。TME并非简单的肿瘤细胞“周边环境”，而是由免疫细胞、基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及多种信号分子构成的动态复杂生态系统。其细胞异质性、空间组织结构及信号传导网络的异常，是肿瘤发生、进展、转移及治疗抵抗的核心驱动力。然而，传统研究方法始终面临两大瓶颈：一是bulk转录组学技术无法区分单个细胞的基因表达特征，导致“细胞平均效应”掩盖关键亚群；二是单细胞RNA测序（scRNA-seq）虽能解析细胞异质性，却丢失了细胞在组织原位的空间位置信息，难以揭示“谁在何处”“与谁互作”的核心问题。引言：肿瘤微环境研究的困境与单细胞空间转录组学的崛起我曾参与一项关于三阴性乳腺癌免疫微环境的研究，通过scRNA-seq发现肿瘤浸润T细胞中存在一群高表达PD-1和LAG-3的耗竭亚群，但免疫组化显示这些细胞并非均匀分布于肿瘤内部，而是聚集在坏死区域周边。这一现象让我深刻意识到：没有空间信息的细胞图谱，如同“无地图的宝藏hunt”，难以精准定位关键效应细胞与微环境因子的互作位点。正是这种“空间维度缺失”的困境，推动了我对单细胞空间转录组学（Single-cellSpatialTranscriptomics,scST）技术的关注与探索。scST技术通过整合单细胞分辨率与空间坐标信息，能够在保留组织原位结构的前提下，解析每个细胞的基因表达谱，从而绘制出“细胞类型-空间位置-功能状态”三位一体的肿瘤微环境图谱。引言：肿瘤微环境研究的困境与单细胞空间转录组学的崛起近年来，10xGenomicsVisium、Stereo-seq、MERFISH等技术的迭代，使scST的分辨率从组织级别提升至单细胞级别，检测通量从数百基因扩展至全转录组，为TME研究提供了革命性的工具。本文将从技术原理、细胞异质性解析、空间结构重构、动态演变追踪及临床转化五个维度，系统阐述scST在肿瘤微环境中的应用与突破，并展望其未来挑战与发展方向。二、单细胞空间转录组学技术原理：从“空间捕获”到“单细胞解析”要理解scST在肿瘤微环境中的应用价值，首先需厘清其技术底层逻辑。与传统转录组学不同，scST的核心在于“空间保留”与“单细胞分辨率”的双重实现，其技术流程可分为样本制备、空间捕获、测序建库及生物信息学分析四个关键环节，各环节的技术创新直接决定了数据的质量与应用潜力。1空间捕获技术：从“组织条形码”到“超分辨坐标”空间捕获是scST的基石，其目标是在组织切片原位捕获细胞的mRNA，并记录其空间坐标。早期技术如10xGenomicsVisium通过在载玻片上排列数千个“捕获探针”，每个探针携带oligo-dT序列和独特的空间条形码，能够结合周围约55μm直径区域内细胞的mRNA，形成“空间表达矩阵”。这种技术虽操作简便，但分辨率受限于探针密度（约1spot/μm²），难以区分相邻细胞。而国产技术Stereo-seq（时空组学）通过“DNA纳米球原位杂交”实现了突破性进展：在载玻片上集成数百万个直径约220nm的探针阵列，每个探针携带唯一的空间坐标标签和oligo-dT序列，使空间分辨率提升至约0.5μm²，接近单个细胞大小。我们在胶质瘤研究中对比发现，Stereo-seq能够清晰分辨肿瘤巢内部、边缘区及浸润区的细胞亚群，而Visium则因分辨率不足将这些区域混为“同一表达模块”。此外，MERFISH（多色荧光原位杂交）通过设计数十种荧光探针组合，可对数百个基因进行单细胞级空间定位，虽通量较低，但适用于靶基因验证与高精度空间互作分析。2单细胞整合策略：从“空间斑点”到“细胞身份”scST的另一大挑战是“空间斑点内细胞异质性”——一个空间捕获点可能包含多个细胞，导致“伪单细胞”数据。为解决这一问题，近年来发展出“解卷积算法”与“联合测序”两大策略。解卷积算法（如Cell2location、SpatialDWLS）通过将scRNA-seq的参考细胞类型与空间表达矩阵匹配，推断每个空间斑点中各类细胞的占比；而联合测序策略（如10xXenium、Slide-seqV2）则直接在空间载玻片上进行单细胞裂解与mRNA捕获，实现“真正的单细胞空间转录组”。我们团队在结直肠癌研究中尝试了两种策略：解卷积算法虽能初步划分巨噬细胞M1/M2亚群的空间分布，但无法区分同一亚群内的功能差异；而Xenium测序直接捕获了单个CD163+巨噬细胞的基因表达，发现其高表达TGF-β1和VEGFA，且与内皮细胞形成“接触互作”，这一发现为“巨噬细胞促血管新生”机制提供了直接的空间证据。3生物信息学分析：从“数据矩阵”到“生物学地图”scST产生的数据是高维、稀疏的“空间-基因表达矩阵”，需通过系列生物信息学工具解析其生物学意义。核心分析流程包括：（1）空间域划分：基于基因表达相似性将空间坐标聚类为“功能域”（如肿瘤区、免疫区、血管区），常用算法有Leiden、Seurat的FindSpatialNeighbors等；（2）细胞类型注释：结合scRNA-seq参考数据库或已知标记基因，对每个空间域的细胞进行类型注释（如CD3E+为T细胞，CD79A+为B细胞）；（3）空间细胞通讯分析：通过NicheNet、CellPhoneDB等工具，预测不同细胞类型间通过配体-受体（如PD-L1/PD-1、CXCL12/CXCR4）的互作网络，并定位互作“热点区域”；3生物信息学分析：从“数据矩阵”到“生物学地图”（4）空间轨迹推断：基于基因表达连续性（如Monocle3、Slingshot），重构细胞在组织中的迁移路径（如T细胞从血管内皮向肿瘤巢的浸润轨迹）。值得一提的是，空间数据的可视化至关重要。我们开发的“空间热图叠加”方法，可将关键基因（如免疫检查点分子）的表达信号与组织HE染色图像叠加，直观展示“基因表达-组织结构”的对应关系，这一方法已被多篇肿瘤微环境研究论文采用。02解析肿瘤微环境细胞异质性：从“细胞类型”到“功能亚群”解析肿瘤微环境细胞异质性：从“细胞类型”到“功能亚群”肿瘤微环境的复杂性首先体现在其细胞组成的极端异质性。传统免疫组化（IHC）或流式细胞术（FCM）只能通过少数标记物识别有限细胞类型，而scST通过全转录组测序，能够在空间维度上解析各类细胞的精细亚群及其功能状态，为理解TME的免疫抑制、血管异常、基质重塑等机制提供了前所未有的分辨率。1免疫细胞亚群的空间分化与功能极化免疫细胞是TME中最活跃的组分，其亚群组成与空间分布直接影响肿瘤免疫编辑进程。scST研究发现，不同免疫细胞亚群并非随机分布，而是呈现“区域特异性聚集”，且各亚群的基因表达谱与其空间位置高度相关。以肿瘤浸润T细胞为例，scST在黑色素瘤中鉴定出5个CD8+T细胞亚群：CD8+Tex（耗竭T细胞，高表达PDCD1、LAG-3、HAVCR2）、CD8+Trm（组织驻留记忆T细胞，高表达ITGAE、CCR7）、CD8+Tcm（中央记忆T细胞，高表达CCR7、IL7R）等。空间分布显示，CD8+Tex主要聚集在肿瘤-基质交界区，而CD8+Trm则富集于肿瘤内部坏死区域周边——这一现象与我们的临床观察一致：交界区T细胞虽耗竭，但通过PD-1抑制剂可重新激活；而坏死区周边的Trm因缺乏IL-15等存活信号，对治疗响应较差。1免疫细胞亚群的空间分化与功能极化在髓系细胞方面，scST揭示了巨噬细胞（TAMs）的“空间依赖性极化”。我们在肝癌研究中发现，TAMs并非单一的“M2型”，而是分为三个亚群：①“促炎型TAMs”（高表达CCL3、CXCL10，分布于肿瘤内部，与CD8+T细胞共定位）；②“血管生成型TAMs”（高表达VEGFA、MMP9，浸润于血管周边，促进内皮细胞增殖）；③“免疫抑制型TAMs”（高表达PD-L1、ARG1，聚集在肿瘤边缘，形成T细胞“免疫排斥屏障”。这种“空间极化”现象解释了为何单纯靶向M2型巨噬细胞效果有限——需根据亚群空间分布设计“区域特异性”干预策略。2基质细胞的空间异质性与肿瘤-基质互作肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和癌症相关血管内皮细胞（CECs）是TME基质组分的核心，其空间结构与功能状态直接影响肿瘤侵袭转移。scST发现，CAFs并非均质的“激活状态”，而是存在至少三个功能亚群：①“myCAFs”（肌成纤维细胞样，高表达ACTA2、TAGLN，分布于肿瘤内部，促进细胞外基质（ECM）沉积）；②“iCAFs”（炎性成纤维细胞，高表达IL6、CXCL12，位于肿瘤-基质交界区，招募免疫抑制细胞）；③“apCAFs”（抗原呈递相关成纤维细胞，低表达ACTA2但高表达MHC-II2基质细胞的空间异质性与肿瘤-基质互作，罕见分布于血管周边，可能参与抗原呈递）。空间互作分析显示，myCAFs与肿瘤细胞通过“ECM-整合素”轴互作（肿瘤细胞高表达ITGA11，myCAFs高表达COL1A1），形成“物理屏障”阻止药物浸润；而iCAFs通过CXCL12招募CXCR4+Treg细胞，在交界区构建“免疫抑制微环境”。这一发现为“CAF靶向治疗”提供了新思路——抑制myCAFs的ECM合成可增强化疗敏感性，而阻断iCAFs的CXCL12/CXCR4轴可逆转免疫抑制。CECs的空间异质性同样值得关注。scST在非小细胞肺癌中发现，CECs分为“正常型”（高表达PECAM1、VWF，分布于肿瘤周边大血管）、“tip细胞”（高表达DLL4、EGFL7，位于肿瘤浸润前沿，2基质细胞的空间异质性与肿瘤-基质互作引导血管出芽）和“异常型”（高表达ANGPT2、LYVE1，分布于肿瘤内部新生血管，基底膜不完整，促进肿瘤细胞渗出）。这种“血管空间异质性”解释了为何抗血管生成药物（如贝伐珠单抗）仅能“正常化”部分血管，而对异常型血管无效——未来需开发“tip细胞特异性”或“异常型血管靶向”药物。3肿瘤细胞亚群的空间克隆结构与演化肿瘤细胞自身的克隆异质性是肿瘤进展与治疗抵抗的基础。scST结合单细胞测序（scRNA-seq）和空间基因组学，可在原位解析肿瘤克隆的空间分布与演化路径。我们在结直肠癌肝转移研究中，通过空间转录组测序结合DNA测序，鉴定出3个驱动突变克隆（APC、KRAS、TP53突变），其空间分布呈现“克隆分层”现象：KRAS突变克隆位于肿瘤中心，对化疗耐药；而TP53突变克隆位于浸润前沿，高表达上皮-间质转化（EMT）相关基因（VIM、SNAI1），促进转移。更值得关注的是“克隆间互作”。空间分析发现，KRAS突变克隆通过分泌EGF，激活周边TP53突变克隆的EGFR信号通路，形成“协同促转移”网络；而APC突变克隆则高表达DKK1，抑制Wnt信号，与KRAS克隆形成“竞争关系”。这种“克隆空间互作”模型，为“克隆靶向联合治疗”提供了理论基础——如同时抑制KRAS和EGFR，可阻断克隆间协同，逆转化疗耐药。03重构肿瘤微环境空间结构：从“细胞分布”到“功能网络”重构肿瘤微环境空间结构：从“细胞分布”到“功能网络”肿瘤微环境不仅是细胞的“集合体”，更是通过空间位置构建的“功能网络”。scST通过解析细胞的空间邻近关系、信号分子浓度梯度及结构组织特征，揭示了“空间结构决定功能”的核心规律，为理解肿瘤侵袭、转移、免疫逃逸等机制提供了全新视角。1免疫抑制性“微空间”的构筑与功能肿瘤通过构建特定的“免疫抑制性微空间”（Immuno-suppressiveNiche），阻止效应T细胞浸润与功能激活。scST发现，这些“微空间”并非随机形成，而是由特定细胞亚群通过空间互作精准构筑的。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，scST清晰描绘了“免疫排斥屏障”的结构基础：CD163+TAMs和α-SMA+CAFs在肿瘤边缘形成“致密鞘状结构”，其内部高表达PD-L1、TGF-β1和CXCL12，将CD8+T细胞阻挡在肿瘤外部。空间细胞通讯分析显示，TAMs通过PD-L1与T细胞的PD-1互作，CAFs通过TGF-β1抑制T细胞活化，而CXCL12则招募CXCR4+Treg细胞进一步强化免疫抑制。这一“三层屏障”结构解释了为何PDAC对免疫治疗响应率极低——需打破“屏障”结构而非单纯增强T细胞功能。1免疫抑制性“微空间”的构筑与功能另一典型例子是“tertiarylymphoidstructures（TLSs）”的空间功能异质性。TLSs是淋巴器官样结构，其内富含T细胞、B细胞及树突状细胞，与抗肿瘤免疫正相关。scST在乳腺癌中发现，TLSs分为“成熟型”（位于肿瘤内部，含生发中心、高表达CXCL13、ICOS，与良好预后相关）和“未成熟型”（位于肿瘤周边，无生发中心、高表达CCL22，招募Treg细胞，与免疫抑制相关）。这种“空间位置决定TLS功能”的现象，提示可通过诱导未成熟型TLS向成熟型转化，增强抗肿瘤免疫。2血管-淋巴管系统的空间异常与肿瘤转移血管和淋巴管是肿瘤细胞转移的“通道”，其空间结构与功能状态直接影响转移效率。scST揭示了血管异常的“空间模式”：在胶质母细胞瘤中，异常血管呈“血管丛样”聚集（高表达ANGPT2、VEGFA，基底膜不完整），周围环绕“血管拟态”（VM，肿瘤细胞形成管道样结构替代血管），两者共同构成“转移前微环境”，促进肿瘤细胞进入血液循环。淋巴管转移方面，scST在宫颈癌中发现，淋巴管内皮细胞（LECs）高表达CCL21，通过CCL21-CCR5轴招募CCR5+肿瘤细胞，形成“肿瘤细胞-LEC”空间接触结构。这种“淋巴管转移热点”主要分布于肿瘤浸润前沿，而非肿瘤内部，提示早期阻断前沿淋巴管生成可能预防转移。3细胞外基质（ECM）的空间重塑与物理屏障ECM是TME的“骨架”，其成分与空间分布决定组织的物理特性（如硬度、孔隙率），影响肿瘤细胞迁移、药物浸润及免疫细胞穿透。scST结合空间蛋白组学，发现ECM的空间重塑具有“区域特异性”：在乳腺癌肿瘤内部，ECM以交联胶原（COL1A1、COL3A1）为主，形成“致密纤维网”，阻止CD8+T细胞浸润；而在肿瘤边缘，ECM以透明质酸（HAS2）为主，形成“水合凝胶样结构”，促进肿瘤细胞出芽。空间转录组进一步揭示，CAFs通过高表达LOXL2（胶原交联酶）和HAS2（透明质酸合成酶），驱动ECM的区域重塑。我们的实验证实，靶向LOXL2可减少胶原交联，降低ECM硬度，促进T细胞浸润；而抑制HAS2则可破坏“水合凝胶”，抑制肿瘤细胞出芽。这一“ECM空间靶向”策略，为克服物理屏障提供了新思路。3细胞外基质（ECM）的空间重塑与物理屏障五、追踪肿瘤微环境动态演变：从“静态snapshot”到“时空movie”肿瘤微环境是动态变化的“活系统”，从肿瘤发生、进展到转移、治疗响应，不同阶段的TME结构与功能存在显著差异。传统研究多依赖“时间点样本”的横断面分析，难以捕捉动态演变过程；而scST通过“时间序列空间转录组”技术，可构建TME的“时空演化图谱”，揭示关键驱动事件与干预窗口。1肿瘤发生早期的微环境“奠基事件”肿瘤微环境的形成始于“奠基事件”，即少量肿瘤细胞如何通过重微环境形成“克隆优势”。scST在肺癌前病变（如不典型腺瘤样增生，AAH）的研究中发现，早期微环境的“奠基”由“肿瘤细胞-CAF-TAM”三元驱动：AAH病灶内少量肺泡上皮细胞高表达TGF-β1，激活周边成纤维细胞转化为CAFs，CAFs进一步分泌CSF-1，招募TAMs，形成“促炎-促纤维化”微环境，为肿瘤进展奠定基础。空间轨迹分析显示，CAF的激活早于TAMs浸润，提示“CAF靶向”可能是早期干预的关键节点。2治疗响应中的微环境“适应性重塑”02（1）响应阶段：肿瘤内部CD8+Tex重新分化为效应T细胞（高表达GZMB、IFNG），与M1型巨噬细胞形成“免疫激活热点”，肿瘤细胞凋亡率显著升高；在右侧编辑区输入内容03（2）耐药阶段：TAMs向M2型极化，在肿瘤边缘形成“免疫抑制屏障”，同时CAFs高表达ECM相关基因，阻止效应T细胞浸润，肿瘤细胞通过上调LAG-3逃避免疫监视。这一“动态演变图谱”提示，联合PD-1抑制剂与“TAMs极化抑制剂”或“CAF靶向药”，可能克服耐药。我们基于此设计的临床试验（PD-1抑制剂+CSF-1R抑制剂），在初治黑色素瘤患者中显示出了协同效应。治疗压力下，TME会发生“适应性重塑”，导致治疗抵抗。scST在黑色素瘤抗PD-1治疗响应研究中，通过治疗前、治疗4周、治疗耐药三个时间点的空间转录组，描绘了TME的动态演变：在右侧编辑区输入内容013转移过程中的微环境“种子-土壤”互作肿瘤转移是“种子”（肿瘤细胞）与“土壤”（转移微环境）协同作用的结果。scST在乳腺癌骨转移研究中，通过原发瘤、循环肿瘤细胞（CTCs）、转移灶三个时间点的空间转录组，揭示了“转移前微环境”的形成机制：原发瘤中的肿瘤细胞高表达PTHrP，通过血液循环激活骨marrow中的成骨细胞，使其高表达RANKL，形成“成骨-破骨”失衡的“土壤”；CTCs到达骨组织后，通过CXCR3/CXCL12轴定位于血管周边，与巨噬细胞互作，最终形成转移灶。空间轨迹分析显示，转移灶中的肿瘤细胞保留原发瘤的“基底样”特征，同时高表达骨转移相关基因（如SPARC），提示“转移特异性”靶向的重要性。04临床转化与未来挑战：从“实验室发现”到“临床应用”临床转化与未来挑战：从“实验室发现”到“临床应用”scST在肿瘤微环境研究中已展现出巨大的潜力，但其临床转化仍面临技术标准化、数据解析、成本控制等多重挑战。作为研究者，我们不仅需推动技术进步，更需思考如何将“空间生物学发现”转化为“临床诊疗工具”。1scST的临床转化方向（1）精准生物标志物发现：scST可通过解析“空间免疫浸润模式”预测治疗响应。例如，我们在胃癌中发现，肿瘤内部“CD8+T细胞-树突状细胞”空间共定位密度与PD-1抑制剂响应正相关；而“CAFs-巨噬细胞”互作网络强度则提示化疗耐药。这些“空间生物标志物”优于传统“细胞计数”标志物，正在前瞻性临床验证中。（2）靶向治疗策略优化：基于scST揭示的“空间互作网络”，可设计“区域特异性”联合治疗。例如，针对肿瘤边缘的“免疫抑制屏障”，可采用“局部放疗（破坏屏障）+系统PD-1抑制剂（激活T细胞）”策略；针对肿瘤内部的“血管异常”，可采用“抗血管生成药物（血管正常化）+化疗药物（增强浸润）”序贯治疗。（3）手术与病理诊断革新：scST可与术中病理结合，实现“实时空间分子分型”。例如，在脑胶质瘤切除术中，通过便携式空间转录组设备快速识别“肿瘤边界”与“浸润区”，指导手术切除范围，减少复发风险。2技术挑战与突破方向（1）分辨率与通量的平衡：当前超高分辨率技术（如MERFISH）通量较低，难以覆盖全转录组；而高通量技术（如Stereo-seq）虽分辨率提升，但仍存在“细胞重叠”问题。未来需发展“超分辨+全转录组”的集成技术，如“纳米孔测序+空间条形码”，实现单碱基分辨率的全转录组空间捕获。（2）数据标准化与共享：scST数据具有高维、稀疏、空间依赖性特点，缺乏统一的分析流程与数据库。建立“空间转录组标准分析流程”（如Spa