左金丸干预PI3K-Akt-NF-κB信号通路逆转大肠癌多药耐药的机制探究

左金丸干预PI3K/Akt/NF-κB信号通路逆转大肠癌多药耐药的机制探究一、引言1.1研究背景与意义大肠癌作为常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内均呈上升趋势。在我国，大肠癌同样严重威胁着人们的健康，发病率已跃居恶性肿瘤前列。手术切除是大肠癌的主要治疗手段，但对于中晚期、术后复发或转移性大肠癌患者，化疗则成为重要的治疗方式，然而，肿瘤细胞的多药耐药（MultidrugResistance，MDR）现象是阻碍化疗成功的关键因素。多药耐药是指肿瘤细胞在接触一种化疗药物后，不仅对该药物产生耐药性，同时对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物也产生交叉耐药。大肠癌细胞的多药耐药尤为突出，存在原发性高表达及继发性高表达，使得其多药耐药性明显高于许多其他肿瘤，导致化疗效果大打折扣，患者的生存率和生活质量严重下降。据相关研究统计，因多药耐药导致大肠癌化疗失败的比例相当高，这使得寻找有效的多药耐药逆转方法成为大肠癌治疗领域亟待解决的问题。目前，针对大肠癌多药耐药的机制研究众多，涉及多个方面。其中，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）介导的药物外排机制备受关注。P-gp是一种由MDR1基因编码的跨膜蛋白，能够利用ATP水解产生的能量将进入细胞内的化疗药物泵出细胞外，从而降低细胞内药物浓度，使肿瘤细胞产生耐药性。蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）活性增强在MDR发生中也起着关键作用，PKC可能通过MDR1基因和P-gp发生作用。除此之外，谷胱甘肽S-转移酶（GlutathioneS-transferase，GST）、拓扑异构酶Ⅱ（TopoisomeraseⅡ，TOPOⅡ）、多药耐药相关蛋白基因（MultidrugResistance-associatedProteinGene，MRP）等机制也参与了大肠癌的多药耐药过程，这些复杂的机制相互交织，进一步增加了克服大肠癌多药耐药的难度。中药在肿瘤治疗领域逐渐崭露头角，其多靶点、低毒性等优势为解决肿瘤多药耐药问题提供了新的思路和方法。左金丸作为中医经典方剂，由黄连和吴茱萸按6:1的比例配伍而成，具有清肝泻火、和胃止痛等功效，常用于治疗消化系统疾病。近年来，研究发现左金丸在抗肿瘤方面也展现出一定的潜力。有研究表明左金丸具有抑制肠癌细胞增殖、促进肠癌细胞凋亡和逆转化疗药物多药耐药的作用。其主要活性成分如小檗碱、吴茱萸碱等被证实具有多种药理活性，小檗碱能够通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长和转移，诱导细胞凋亡；吴茱萸碱也具有抗肿瘤、抗炎等作用。然而，左金丸介导PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控大肠癌多药耐药的具体机制尚未完全明确，深入研究这一作用机制，对于揭示左金丸逆转大肠癌多药耐药的科学内涵，开发基于左金丸的新型抗多药耐药药物，提高大肠癌的化疗疗效具有重要的理论和实践意义。1.2研究目的本研究旨在深入探究左金丸介导PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控大肠癌多药耐药的分子机制，具体目标如下：明确左金丸对大肠癌细胞多药耐药的逆转作用：通过体外实验，运用细胞增殖实验、细胞凋亡实验、药物蓄积实验等方法，观察左金丸对耐药大肠癌细胞株的作用，确定左金丸是否能够有效逆转大肠癌细胞的多药耐药表型，提高化疗药物对耐药细胞的杀伤作用，为后续机制研究奠定基础。揭示PI3K/Akt/NF-κB信号通路在左金丸逆转多药耐药中的作用：采用分子生物学技术，如Westernblot、RT-qPCR等，检测左金丸处理前后耐药大肠癌细胞中PI3K/Akt/NF-κB信号通路关键分子的表达和活性变化，明确该信号通路在左金丸逆转多药耐药过程中的激活或抑制状态，以及其与多药耐药相关蛋白表达的关联。验证左金丸通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控多药耐药的机制：利用信号通路抑制剂或激动剂，干预PI3K/Akt/NF-κB信号通路的活性，观察其对左金丸逆转多药耐药效果的影响。同时，通过基因沉默或过表达技术，调控信号通路关键基因的表达，进一步验证该信号通路在左金丸调控大肠癌多药耐药中的关键作用及具体机制。为临床应用提供理论依据：基于上述研究结果，为左金丸在大肠癌化疗中的临床应用提供科学的理论依据和潜在的治疗靶点，为开发新型、有效的大肠癌多药耐药逆转策略提供新思路。1.3国内外研究现状1.3.1左金丸的研究进展左金丸作为中医经典名方，有着悠久的应用历史。它由黄连与吴茱萸按6:1的比例配伍而成，出自元代朱丹溪的《丹溪心法》，传统上主要用于治疗肝火犯胃证，如胃脘疼痛、呕吐吞酸等消化系统症状。近年来，随着对左金丸研究的不断深入，其药理作用和临床应用范围也在逐渐拓展。在药理作用方面，研究表明左金丸具有多种活性。它能够抗炎镇痛，通过抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应，缓解疼痛症状。在抗菌方面，对多种胃肠道致病菌如幽门螺杆菌等具有抑制作用，这对于治疗因细菌感染引起的胃肠道疾病具有重要意义。同时，左金丸还能调节胃酸分泌，抑制胃蛋白酶的活性，从而保护胃黏膜，对消化性溃疡、胃炎等疾病有良好的治疗效果。在抗肿瘤研究领域，左金丸也展现出一定的潜力。有研究发现左金丸能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，包括肝癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等。对于大肠癌，相关研究表明左金丸可以抑制肠癌细胞的生长和迁移，促进肠癌细胞的凋亡。其主要活性成分小檗碱和吴茱萸碱发挥了关键作用。小檗碱能够通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡，如激活caspase家族蛋白，调控Bcl-2家族蛋白的表达等。吴茱萸碱则可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞，同时还具有抑制肿瘤血管生成的作用。然而，目前左金丸在大肠癌治疗中的应用仍处于基础研究和临床前研究阶段，其具体的作用机制和最佳的用药方案尚未完全明确，需要进一步深入研究。1.3.2PI3K/Akt/NF-κB信号通路的研究进展PI3K/Akt/NF-κB信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一，在细胞的增殖、存活、凋亡、炎症反应以及肿瘤的发生发展等过程中发挥着关键作用。PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶）是该信号通路的上游分子，当细胞受到生长因子、细胞因子等刺激时，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，能够招募并激活下游的Akt（蛋白激酶B）。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活后的Akt可以通过磷酸化多种底物，调节细胞的代谢、增殖、存活等生物学过程。例如，Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），从而促进细胞增殖；Akt还可以磷酸化Bcl-2家族蛋白中的Bad，使其失去促凋亡活性，进而抑制细胞凋亡。NF-κB（核因子-κB）是一种转录因子，在细胞静止状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到刺激时，Akt可以激活IκB激酶（IKK），IKK使IκB磷酸化，进而导致IκB降解，释放出NF-κB。NF-κB进入细胞核后，与靶基因的启动子区域结合，调控一系列基因的转录表达，这些基因包括细胞因子、趋化因子、黏附分子等，参与炎症反应、免疫调节以及肿瘤的发生发展等过程。在肿瘤细胞中，PI3K/Akt/NF-κB信号通路常常处于异常激活状态，导致肿瘤细胞的增殖失控、凋亡抵抗、侵袭和转移能力增强。因此，该信号通路成为肿瘤治疗的重要靶点之一，针对该信号通路的抑制剂研究也取得了一定的进展。1.3.3大肠癌多药耐药的研究进展大肠癌多药耐药是一个复杂的生物学现象，严重影响了化疗的疗效，其发生机制涉及多个方面。在药物外排机制方面，P-糖蛋白（P-gp）介导的药物外排是大肠癌多药耐药的重要机制之一。P-gp是一种由MDR1基因编码的跨膜蛋白，具有ATP依赖性药物外排泵的功能。它能够识别并结合进入细胞内的化疗药物，利用ATP水解产生的能量将药物泵出细胞外，从而降低细胞内药物浓度，使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。研究表明，大肠癌组织中MDR1基因和P-gp的表达水平与多药耐药的发生密切相关，高表达MDR1基因和P-gp的大肠癌细胞对多种化疗药物如阿霉素、长春新碱等具有明显的耐药性。除了P-gp，多药耐药相关蛋白（MRP）家族也参与了大肠癌的多药耐药过程。MRP家族包括MRP1-MRP9等多个成员，它们同样是跨膜转运蛋白，能够将细胞内的药物及其代谢产物排出细胞外。其中，MRP1在大肠癌多药耐药中的作用较为突出，它不仅可以转运化疗药物，还能与谷胱甘肽（GSH）结合，形成GSH-药物复合物，增强药物的外排作用。在细胞凋亡调控机制方面，肿瘤细胞凋亡受阻也是导致多药耐药的重要原因。正常情况下，化疗药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥治疗作用。然而，在多药耐药的大肠癌细胞中，凋亡相关信号通路常常发生异常。例如，Bcl-2家族蛋白的表达失衡，Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白表达上调，而Bax、Bak等促凋亡蛋白表达下调，使得肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡产生抵抗。此外，caspase家族蛋白的活性改变也会影响细胞凋亡的发生，caspase是细胞凋亡过程中的关键执行者，其活性受到抑制会导致细胞凋亡受阻，从而促进多药耐药的形成。近年来，针对大肠癌多药耐药的逆转研究取得了一定的进展。研究人员尝试通过多种方法来逆转多药耐药，如使用耐药逆转剂、基因治疗、中药治疗等。耐药逆转剂可以通过抑制P-gp等药物外排蛋白的功能，增加细胞内药物浓度，从而提高化疗药物的疗效。基因治疗则是通过干扰耐药相关基因的表达，如沉默MDR1基因，来逆转多药耐药。中药因其多靶点、低毒性等优势，在大肠癌多药耐药逆转研究中也受到了广泛关注，左金丸作为一种具有潜在抗肿瘤作用的中药方剂，其在逆转大肠癌多药耐药方面的研究具有重要的意义。二、相关理论基础2.1左金丸概述左金丸源自元代朱丹溪所著的《丹溪心法》，是中医方剂中的经典之作，由黄连和吴茱萸两味中药以6:1的独特比例配伍而成。这一精妙的配伍蕴含着深刻的中医理论内涵。黄连，性味苦寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，在左金丸中被用作君药，其大苦大寒之性，能直折肝火，使肝火得清，自不横逆犯胃。吴茱萸，性味辛热，归肝、脾、胃、肾经，有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之效，在方中作为佐药。吴茱萸虽性热，但与大量黄连配伍，既能制约黄连之苦寒，使泻火而无凉遏之弊；又能疏肝解郁，引热下行，降逆止呕。二者寒热并用，辛开苦降，相反相成，共奏清肝泻火、和胃止痛、降逆止呕之功。在传统应用方面，左金丸主要用于治疗肝火犯胃证。肝火犯胃是中医的一种病证概念，多由情志不遂，肝郁化火，或热邪内犯等因素引起。临床症状表现多样，常见胃脘部疼痛，疼痛性质多为胀痛或灼痛，且疼痛程度较为剧烈。患者常伴有呕吐苦水、嘈杂吞酸等症状，即感觉胃脘部不适，似饥非饥、似痛非痛，伴有泛吐酸水，严重者可出现呕吐酸水的情况。此外，还可见胁肋胀痛，因肝居胁下，肝气不舒，故胁肋部胀满疼痛。同时，患者可能出现烦躁易怒、口干口苦等全身症状，这是由于肝火上炎，扰乱心神，灼伤津液所致。左金丸针对这些症状，通过清肝泻火、和胃降逆的作用，使肝火得清，胃气得和，从而有效缓解上述不适。在古代医籍中，有诸多关于左金丸应用的记载。如《医方集解》中提到：“左金丸，治肝经火郁，胁痛，吞酸，嘈杂，呕吐，嗳气，口苦。”《古今名医方论》中也记载：“左金丸，治肝火肋痛，吞酸吐酸，疝瘕痞结等证。”这些记载充分表明左金丸在古代被广泛应用于治疗肝火犯胃相关的病症，且取得了良好的疗效。随着现代科学技术的发展，对左金丸的研究也从传统的临床应用逐渐深入到药理作用和作用机制等多个方面。现代药理学研究表明，左金丸具有广泛的药理活性。在抗炎镇痛方面，左金丸能够抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应，从而缓解疼痛。研究发现，左金丸可以降低炎症模型动物体内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的水平，抑制炎症细胞的浸润，减轻组织的炎症损伤。其抗炎作用机制可能与调节核因子-κB（NF-κB）等信号通路有关，通过抑制NF-κB的活化，减少炎症相关基因的转录和表达，从而发挥抗炎作用。在抗菌方面，左金丸对多种胃肠道致病菌具有抑制作用。例如，左金丸对幽门螺杆菌具有较强的抑制活性，幽门螺杆菌是导致慢性胃炎、消化性溃疡等胃肠道疾病的重要病原菌，左金丸的抗菌作用有助于治疗因幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病。其抗菌机制可能与黄连和吴茱萸中的有效成分破坏细菌的细胞膜结构、抑制细菌的蛋白质合成等有关。在调节胃酸分泌方面，左金丸能够抑制胃酸的过度分泌，同时保护胃黏膜。实验研究表明，左金丸可以降低胃酸的酸度和胃蛋白酶的活性，减少胃酸对胃黏膜的刺激和损伤。此外，左金丸还能促进胃黏膜细胞的增殖和修复，增强胃黏膜的屏障功能，从而对消化性溃疡、胃炎等疾病起到治疗作用。在抗肿瘤研究领域，左金丸也展现出了令人瞩目的潜力。越来越多的研究表明，左金丸及其主要活性成分对多种肿瘤细胞具有抑制作用。在体外实验中，左金丸能够抑制肝癌细胞、肺癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞等多种肿瘤细胞的增殖。例如，有研究发现左金丸含药血清可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制可能与上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。对于大肠癌细胞，左金丸同样具有抑制其生长和迁移的作用。研究表明，左金丸可以抑制肠癌细胞HT-29的增殖，通过阻滞细胞周期在G0/G1期，抑制细胞的分裂和生长。同时，左金丸还能降低肠癌细胞的迁移能力，减少细胞的侵袭和转移。在体内实验中，左金丸也能够抑制肿瘤的生长。将左金丸灌胃给予荷瘤小鼠，发现肿瘤体积明显减小，重量减轻，表明左金丸在体内具有一定的抗肿瘤活性。其主要活性成分小檗碱和吴茱萸碱在抗肿瘤过程中发挥了关键作用。小檗碱是黄连的主要活性成分之一，具有多种抗肿瘤作用机制。它可以通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡，如激活caspase家族蛋白，caspase是细胞凋亡过程中的关键执行者，小檗碱能够激活caspase-3、caspase-8等，使其活性增强，从而启动细胞凋亡的级联反应。同时，小檗碱还能调控Bcl-2家族蛋白的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，改变Bcl-2/Bax的比值，促进细胞凋亡。此外，小檗碱还可以抑制肿瘤细胞的增殖，通过抑制肿瘤细胞的DNA合成和细胞周期相关蛋白的表达，阻滞细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的生长。吴茱萸碱是吴茱萸的主要活性成分之一，也具有显著的抗肿瘤作用。它可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞，使肿瘤细胞停滞在G0/G1期或S期，从而抑制细胞的分裂和生长。吴茱萸碱还具有抑制肿瘤血管生成的作用，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，吴茱萸碱可以通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的表达和活性，减少血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移。此外，吴茱萸碱还能诱导肿瘤细胞自噬，自噬是细胞内的一种自我降解过程，适当的自噬可以促进肿瘤细胞的死亡，吴茱萸碱通过诱导肿瘤细胞自噬，发挥抗肿瘤作用。2.2PI3K/Akt/NF-κB信号通路解析2.2.1信号通路组成及激活机制PI3K/Akt/NF-κB信号通路是细胞内一条重要的信号传导途径，其组成复杂且精妙，各关键蛋白在其中发挥着独特而关键的作用，它们相互协作，共同完成信号的传递和细胞功能的调控。PI3K，即磷脂酰肌醇-3激酶，是该信号通路的上游关键分子。它是一种异源二聚体蛋白，由一个调节亚基（如p85）和一个催化亚基（如p110）组成。调节亚基含有多个结构域，如SH2结构域等，这些结构域能够识别并结合细胞内其他蛋白上的特定磷酸化位点，从而将PI3K招募到细胞膜附近。催化亚基则具有磷脂酰肌醇激酶的活性。当细胞受到多种细胞外刺激，如生长因子（如表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF等）、细胞因子（如白细胞介素IL-6等）与细胞膜上的相应受体结合后，受体发生二聚化和自身磷酸化，形成特定的磷酸化位点。调节亚基通过其SH2结构域与受体上的磷酸化位点结合，从而激活PI3K的催化活性。激活后的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）的肌醇环上的3'-OH位置磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为一种重要的第二信使，在细胞膜上大量积累，为后续信号传递奠定基础。Akt，又称蛋白激酶B（PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在PI3K/Akt/NF-κB信号通路中处于关键的中间位置。Akt蛋白包含多个结构域，如N端的PH结构域、中间的激酶结构域和C端的调节结构域。在细胞未受到刺激时，Akt主要以非活化形式存在于细胞质中。当PI3K被激活产生PIP3后，Akt的PH结构域对PIP3具有高度亲和力，能够特异性地与PIP3结合。这种结合导致Akt从细胞质转移到细胞膜上，使其空间构象发生改变，暴露出关键的磷酸化位点。在细胞膜上，Akt会被两种关键的激酶磷酸化激活，分别是3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）。PDK1可以磷酸化Akt的苏氨酸308位点（Thr308），而mTORC2则磷酸化Akt的丝氨酸473位点（Ser473）。只有当Akt的Thr308和Ser473位点同时被磷酸化时，Akt才被完全激活。激活后的Akt从细胞膜上解离下来，进入细胞质和细胞核，通过磷酸化一系列下游底物，调控细胞的多种生物学功能。例如，Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），使GSK-3β失去活性，从而解除对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）等蛋白的抑制作用，促进细胞从G1期进入S期，推动细胞增殖。Akt还能磷酸化Bcl-2家族蛋白中的Bad，使其与14-3-3蛋白结合，失去促凋亡活性，进而抑制细胞凋亡，增强细胞的存活能力。NF-κB，即核因子-κB，是一种重要的转录因子，在PI3K/Akt/NF-κB信号通路的下游发挥关键作用，调控基因转录。NF-κB家族在哺乳动物中主要包括5个成员：NF-κB1（p105/p50）、NF-κB2（p100/p52）、p65（RELA）、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物B（RELB）和c-REL。这些成员之间可以通过保守的Rel同源结构域（RHD）形成同源或异源二聚体，其中p65/p50异源二聚体是最为常见的形式。在细胞静止状态下，NF-κB二聚体与抑制蛋白IκB结合，以无活性的复合物形式存在于细胞质中。IκB蛋白家族主要包括IκBα、IκBβ等成员，它们通过其锚蛋白重复序列与NF-κB二聚体紧密结合，掩盖NF-κB的核定位信号（NLS），从而阻止NF-κB进入细胞核发挥转录调控作用。当细胞受到各种刺激，如炎症因子（如肿瘤坏死因子-αTNF-α、白细胞介素-1βIL-1β等）、病原体相关分子模式（PAMPs，如脂多糖LPS）、氧化应激等，激活了IκB激酶（IKK）复合物。IKK复合物是NF-κB激活的关键调节因子，由IKKα、IKKβ和NEMO（IKKγ）组成。其中，IKKα和IKKβ具有激酶活性，NEMO则起到调节作用。在刺激信号的作用下，IKK复合物被上游的信号分子（如肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF家族成员等）激活。激活后的IKKα和IKKβ催化IκB蛋白的丝氨酸残基磷酸化。例如，IκBα的Ser32和Ser36位点被IKK磷酸化后，会被泛素连接酶识别并进行泛素化修饰。泛素化修饰后的IκBα被26S蛋白酶体识别并降解。随着IκBα的降解，NF-κB二聚体被释放出来，暴露其核定位信号。NF-κB二聚体在核转运蛋白的帮助下，从细胞质转移到细胞核内。在细胞核中，NF-κB二聚体与靶基因启动子区域的κB位点特异性结合，招募转录共激活因子（如CREB结合蛋白CBP等）和RNA聚合酶Ⅱ等转录相关蛋白，启动靶基因的转录过程。这些靶基因包括细胞因子（如IL-6、IL-8等）、趋化因子（如CXCL12等）、黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1等）以及与细胞增殖、凋亡、存活相关的基因等，从而调控细胞的炎症反应、免疫应答、增殖、存活等多种生物学过程。2.2.2与肿瘤耐药相关性研究PI3K/Akt/NF-κB信号通路与肿瘤耐药之间存在着紧密而复杂的关联，该信号通路的异常激活在肿瘤细胞耐药性的产生和发展过程中发挥着关键作用。在肿瘤细胞中，PI3K/Akt/NF-κB信号通路常常处于异常激活状态。这一异常激活与肿瘤细胞耐药性的产生密切相关，其机制涉及多个方面。一方面，该信号通路的激活能够调控多药耐药相关蛋白的表达。例如，研究表明，PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活可以上调P-糖蛋白（P-gp）的表达。P-gp是一种由MDR1基因编码的跨膜转运蛋白，具有ATP依赖性药物外排泵的功能。当肿瘤细胞内PI3K被激活后，产生的PIP3激活Akt，激活的Akt可以通过多种途径激活NF-κB。活化的NF-κB进入细胞核后，与MDR1基因启动子区域的κB位点结合，促进MDR1基因的转录，从而增加P-gp的表达。高表达的P-gp能够识别并结合进入细胞内的化疗药物，如阿霉素、长春新碱等，利用ATP水解产生的能量将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低，使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。此外，PI3K/Akt/NF-κB信号通路还可以调控多药耐药相关蛋白（MRP）家族等其他耐药蛋白的表达。MRP家族成员同样是跨膜转运蛋白，能够将细胞内的药物及其代谢产物排出细胞外。该信号通路的激活可以通过影响MRP家族基因的转录和表达，增加其在肿瘤细胞表面的表达水平，从而增强肿瘤细胞的药物外排能力，导致耐药性的产生。另一方面，PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活可以抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤耐药。在正常生理状态下，化疗药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥治疗作用。然而，在肿瘤细胞中，PI3K/Akt/NF-κB信号通路的异常激活会干扰细胞凋亡信号通路的正常功能。Akt作为该信号通路的关键激酶，激活后可以磷酸化并抑制多种促凋亡蛋白，如Bad、Bax等。Bad被Akt磷酸化后，与14-3-3蛋白结合，失去促凋亡活性，无法正常发挥诱导细胞凋亡的作用。Bax的活性也受到Akt的抑制，其从细胞质转移到线粒体的过程受阻，从而减少了线粒体膜电位的破坏和细胞色素c的释放，抑制了下游caspase家族蛋白的激活，使细胞凋亡过程被阻断。同时，NF-κB激活后，会调控一系列抗凋亡基因的表达。例如，NF-κB可以上调Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表达，这些蛋白能够在线粒体外膜形成保护性屏障，阻止细胞色素c等凋亡因子的释放，进一步抑制细胞凋亡。此外，NF-κB还可以调控存活蛋白（Survivin）等基因的表达，Survivin是一种凋亡抑制蛋白，它可以抑制caspase-3、caspase-7等凋亡执行蛋白的活性，促进肿瘤细胞的存活和耐药。大量研究数据也充分证实了PI3K/Akt/NF-κB信号通路与肿瘤耐药之间的密切关系。在乳腺癌细胞的研究中发现，PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活与乳腺癌细胞对紫杉醇、多柔比星等化疗药物的耐药性显著相关。通过抑制PI3K的活性，使用PI3K特异性抑制剂LY294002处理乳腺癌耐药细胞，能够显著降低Akt和NF-κB的磷酸化水平，同时下调P-gp的表达，增加细胞内化疗药物的浓度，从而提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，逆转耐药表型。在肺癌的研究中，也观察到类似的现象。肺癌耐药细胞中PI3K/Akt/NF-κB信号通路高度激活，通过基因沉默技术抑制Akt或NF-κB的表达，能够增强肺癌细胞对顺铂等化疗药物的凋亡敏感性，降低耐药性。这些研究结果表明，PI3K/Akt/NF-κB信号通路在肿瘤耐药中起着关键的调控作用，阻断该信号通路有望成为逆转肿瘤耐药的有效策略。2.3大肠癌多药耐药机制大肠癌多药耐药（MultidrugResistance，MDR）的形成是一个极其复杂的过程，涉及多个方面的机制，这些机制相互交织，共同导致肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药性，严重影响化疗效果。药物外排机制是大肠癌多药耐药的重要原因之一。在这一机制中，P-糖蛋白（P-gp）起着关键作用。P-gp由MDR1基因编码，是一种跨膜糖蛋白，属于ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族。其结构包含两个跨膜结构域和两个ATP结合结构域。跨膜结构域形成药物结合位点和转运通道，ATP结合结构域则利用ATP水解产生的能量，驱动药物的外排过程。当大肠癌细胞内进入化疗药物时，P-gp能够识别并结合这些药物，然后通过ATP水解提供的能量，将药物逆浓度梯度泵出细胞外。这使得细胞内药物浓度难以达到有效杀伤肿瘤细胞的水平，从而导致耐药。研究表明，在大肠癌组织中，MDR1基因和P-gp的高表达与多药耐药密切相关。通过对大量临床大肠癌样本的检测发现，耐药组患者肿瘤组织中MDR1基因的mRNA表达水平显著高于敏感组，同时P-gp蛋白的表达也明显上调。在体外实验中，使用P-gp抑制剂如维拉帕米等，可以显著抑制P-gp的外排功能，增加耐药大肠癌细胞内化疗药物的浓度，提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。除了P-gp，多药耐药相关蛋白（MRP）家族也参与了药物外排过程。MRP家族包括MRP1-MRP9等多个成员，它们同样是ABC转运蛋白超家族的成员。以MRP1为例，其结构与P-gp有相似之处，也包含跨膜结构域和ATP结合结构域。MRP1不仅可以直接转运化疗药物，还能与谷胱甘肽（GSH）结合，形成GSH-药物复合物，增强药物的外排作用。在大肠癌细胞中，MRP1的高表达会导致细胞对依托泊苷、长春新碱等化疗药物的耐药性增加。研究发现，在某些耐药大肠癌细胞株中，MRP1基因的表达上调，通过RNA干扰技术沉默MRP1基因后，细胞内化疗药物的蓄积量增加，对化疗药物的敏感性提高。细胞凋亡抑制是大肠癌多药耐药的另一个重要机制。正常情况下，化疗药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥治疗作用。然而，在多药耐药的大肠癌细胞中，凋亡相关信号通路常常发生异常。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调控中起着关键作用。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。在多药耐药的大肠癌细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达上调，它们可以在线粒体外膜形成保护性屏障，阻止细胞色素c等凋亡因子的释放，从而抑制细胞凋亡。促凋亡蛋白Bax和Bak的表达则下调，或者其活性受到抑制。Bax通常以单体形式存在于细胞质中，当细胞受到凋亡刺激时，Bax会发生构象改变，形成同源二聚体并转移到线粒体膜上，导致线粒体膜电位的破坏和细胞色素c的释放，启动细胞凋亡。在耐药大肠癌细胞中，Bax的这种正常激活过程受阻，使得细胞对化疗药物诱导的凋亡产生抵抗。caspase家族蛋白也是细胞凋亡过程中的关键执行者。caspase家族包括启动型caspase（如caspase-8、caspase-9等）和执行型caspase（如caspase-3、caspase-7等）。在正常凋亡过程中，启动型caspase被激活后，会切割并激活执行型caspase，从而引发细胞凋亡的级联反应。在多药耐药的大肠癌细胞中，caspase家族蛋白的活性常常受到抑制。例如，一些凋亡抑制蛋白（IAPs）如Survivin、XIAP等的表达上调，它们可以直接抑制caspase-3、caspase-7等的活性，阻断细胞凋亡的发生。研究表明，在耐药大肠癌细胞中，Survivin的高表达与细胞凋亡抵抗和多药耐药密切相关。通过使用Survivin抑制剂处理耐药细胞，可以恢复caspase-3的活性，促进细胞凋亡，提高细胞对化疗药物的敏感性。此外，肿瘤干细胞（CancerStemCells，CSCs）在大肠癌多药耐药中也扮演着重要角色。肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化和肿瘤起始能力的一小部分细胞。它们具有独特的生物学特性，使得其对化疗药物具有更强的耐受性。肿瘤干细胞高表达ABC转运蛋白，如P-gp、ABCG2等，这些转运蛋白能够将化疗药物排出细胞外，降低细胞内药物浓度。肿瘤干细胞还具有较强的DNA损伤修复能力。化疗药物通常会导致肿瘤细胞的DNA损伤，从而诱导细胞凋亡。然而，肿瘤干细胞能够迅速启动DNA损伤修复机制，修复受损的DNA，避免细胞凋亡。肿瘤干细胞处于相对静止的细胞周期状态，即G0期。大多数化疗药物主要作用于增殖活跃的细胞，对处于G0期的肿瘤干细胞作用较弱。这使得肿瘤干细胞在化疗过程中得以存活，成为肿瘤复发和耐药的根源。研究发现，在大肠癌组织中，肿瘤干细胞标志物（如CD133、CD44等）的高表达与多药耐药和不良预后相关。通过富集和培养大肠癌肿瘤干细胞，发现这些细胞对多种化疗药物的IC50值明显高于普通大肠癌细胞，表明其具有更强的耐药性。三、左金丸对大肠癌多药耐药影响的实验研究3.1实验材料与方法3.1.1细胞系选用人结肠癌细胞株HCT-116和耐奥沙利铂的人结肠癌细胞株HCT-116/OXA，均购自中国典型培养物保藏中心。HCT-116细胞常规培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中；HCT-116/OXA细胞培养于上述培养基中，并添加5μmol/L奥沙利铂以维持其耐药性。培养条件为37℃、5%CO₂的恒温培养箱，细胞呈单层贴壁生长，待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。在实验前，对细胞进行复苏、传代和冻存操作，确保细胞状态良好，数量充足。复苏细胞时，迅速将冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速解冻，然后将细胞悬液转移至含有培养基的离心管中，离心后弃去上清液，加入新鲜培养基重悬细胞，接种于培养瓶中进行培养。传代时，当细胞生长至80%-90%汇合度时，用胰蛋白酶消化细胞，加入适量培养基终止消化，将细胞悬液按1:3或1:4的比例传代至新的培养瓶中继续培养。冻存细胞时，将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，加入含有10%DMSO和20%FBS的冻存液重悬细胞，将细胞悬液分装至冻存管中，放入程序降温盒，先置于-80℃冰箱过夜，然后转移至液氮中保存。3.1.2动物模型选用4-6周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。在动物实验前，将裸鼠饲养于特定的无病原体条件下，控制室温在22±2℃，相对湿度在50%-60%，12h光照/12h黑暗循环，自由饮水和进食。实验前12h禁食不禁水。动物实验方案经[具体机构]动物伦理委员会审查批准，伦理编号：[具体编号]，所有实验操作均严格遵循动物伦理学标准和《中国实验动物管理条例》的规定。建立大肠癌裸鼠移植瘤模型时，将处于对数生长期的HCT-116/OXA细胞用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，用生理盐水调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。在裸鼠右侧腋下皮下注射0.2mL细胞悬液，接种后密切观察裸鼠的一般状况和肿瘤生长情况。待肿瘤体积长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分组进行后续实验。肿瘤体积计算公式为：V=0.5×a×b²，其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。3.1.3左金丸提取物制备取黄连和吴茱萸，按照左金丸原方6:1的比例称取中药饮片。采用乙醇回流提取法进行提取，将中药饮片加入8倍量的70%乙醇中，回流提取2次，每次1h。合并提取液，减压浓缩至无醇味，然后冷冻干燥，得到左金丸提取物干粉。使用前，称取适量干粉，用DMSO溶解并配制成所需浓度的溶液，经0.22μm滤器过滤除菌后备用。通过高效液相色谱法（HPLC）对左金丸提取物中的主要活性成分进行含量测定，包括小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱等。具体操作如下：称取适量左金丸提取物干粉，用甲醇超声提取，提取液经0.22μm滤膜过滤后，进样分析。色谱条件为：色谱柱为C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（含0.05%十二烷基硫酸钠），梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为265nm（小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱等）；柱温为30℃。通过测定各活性成分的峰面积，外标法计算其含量，确保提取物的质量和活性成分的稳定性。3.1.4实验分组体外实验分组：将对数生长期的HCT-116和HCT-116/OXA细胞分别进行分组处理。对照组：加入等体积的RPMI1640培养基。左金丸组：加入不同浓度（如10、20、40μg/mL）的左金丸提取物溶液。奥沙利铂组：加入临床常用浓度（如5μmol/L）的奥沙利铂溶液。左金丸+奥沙利铂组：先加入不同浓度的左金丸提取物溶液预处理2h，然后加入奥沙利铂溶液。每组设置6个复孔，实验重复3次。体内实验分组：将建立好大肠癌移植瘤模型的裸鼠随机分为以下几组。对照组：灌胃给予等体积的生理盐水，同时腹腔注射等体积的生理盐水。左金丸组：灌胃给予左金丸提取物，剂量为[X]mg/kg/d。奥沙利铂组：腹腔注射奥沙利铂，剂量为[X]mg/kg/次，每周2次。左金丸+奥沙利铂组：灌胃给予左金丸提取物，剂量为[X]mg/kg/d，同时腹腔注射奥沙利铂，剂量为[X]mg/kg/次，每周2次。每组8只裸鼠，连续给药[X]天。在给药期间，每隔3天测量一次裸鼠的体重和肿瘤体积，观察裸鼠的一般状态，如饮食、活动、精神状态等。实验结束后，处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称重并进行后续检测。3.2左金丸对大肠癌细胞耐药性的影响3.2.1细胞增殖与活力检测采用CCK-8法对左金丸干预后的大肠癌细胞增殖与活力变化展开检测。将对数生长期的HCT-116和HCT-116/OXA细胞，以每孔5000-10000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，按照实验分组进行处理。对照组加入等体积的RPMI1640培养基；左金丸组分别加入不同浓度（10、20、40μg/mL）的左金丸提取物溶液；奥沙利铂组加入5μmol/L的奥沙利铂溶液；左金丸+奥沙利铂组先加入不同浓度的左金丸提取物溶液预处理2小时，然后加入奥沙利铂溶液。每组设置6个复孔，在37℃、5%CO₂的培养箱中继续孵育24、48、72小时。在孵育结束前2小时，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2小时后，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。根据OD值计算细胞存活率，公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。实验结果显示，在HCT-116细胞中，随着左金丸浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低。与对照组相比，左金丸10μg/mL组在作用24小时后，细胞存活率无明显变化；作用48小时后，细胞存活率略有下降，但差异不显著；作用72小时后，细胞存活率显著降低（P<0.05）。左金丸20μg/mL组和40μg/mL组在作用24小时后，细胞存活率开始下降；作用48小时和72小时后，细胞存活率均显著低于对照组（P<0.01）。奥沙利铂组在作用24、48、72小时后，细胞存活率均显著低于对照组（P<0.01）。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，在相同作用时间下，细胞存活率进一步降低，且随着左金丸浓度的增加，细胞存活率降低更为明显。在作用48小时后，左金丸10μg/mL+奥沙利铂组细胞存活率显著低于奥沙利铂组（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组和40μg/mL+奥沙利铂组细胞存活率极显著低于奥沙利铂组（P<0.01）。这表明左金丸与奥沙利铂联合使用具有协同抑制HCT-116细胞增殖的作用。在HCT-116/OXA细胞中，对照组细胞在24、48、72小时的生长过程中，存活率保持相对稳定。左金丸组在不同浓度作用下，细胞存活率随着时间的推移和浓度的增加而逐渐降低。左金丸10μg/mL组在作用24小时后，细胞存活率变化不明显；作用48小时后，细胞存活率开始下降；作用72小时后，细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）。左金丸20μg/mL组和40μg/mL组在作用24小时后，细胞存活率已有明显下降；作用48小时和72小时后，细胞存活率均极显著低于对照组（P<0.01）。奥沙利铂组在作用24、48、72小时后，细胞存活率虽有下降，但与对照组相比，差异不显著，这表明HCT-116/OXA细胞对奥沙利铂具有耐药性。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，在相同作用时间下，细胞存活率显著降低。在作用48小时后，左金丸10μg/mL+奥沙利铂组细胞存活率显著低于奥沙利铂组（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组和40μg/mL+奥沙利铂组细胞存活率极显著低于奥沙利铂组（P<0.01）。这说明左金丸能够显著提高HCT-116/OXA细胞对奥沙利铂的敏感性，逆转其耐药性。3.2.2细胞凋亡与周期分析运用流式细胞术对左金丸影响大肠癌细胞凋亡和细胞周期的情况进行分析。将对数生长期的HCT-116和HCT-116/OXA细胞，以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，按照实验分组进行处理。对照组加入等体积的RPMI1640培养基；左金丸组分别加入不同浓度（10、20、40μg/mL）的左金丸提取物溶液；奥沙利铂组加入5μmol/L的奥沙利铂溶液；左金丸+奥沙利铂组先加入不同浓度的左金丸提取物溶液预处理2小时，然后加入奥沙利铂溶液。每组设置3个复孔，在37℃、5%CO₂的培养箱中继续孵育48小时。孵育结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，注意消化时间不宜过长，以免影响细胞活性。当细胞变圆脱壁后，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。对于细胞凋亡检测，加入500μLBindingBuffer重悬细胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，避光孵育15分钟。孵育结束后，在1小时内使用流式细胞仪进行检测，分析早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）和晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）的比例。对于细胞周期分析，加入70%预冷乙醇固定细胞，4℃固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30分钟。孵育结束后，使用流式细胞仪检测，分析细胞周期各时相（G0/G1期、S期、G2/M期）的分布情况。在HCT-116细胞的凋亡检测中，对照组的早期凋亡率和晚期凋亡率较低，分别为（2.56±0.32）%和（1.23±0.15）%。左金丸组随着浓度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐升高。左金丸10μg/mL组的早期凋亡率为（4.35±0.45）%，晚期凋亡率为（2.01±0.23）%，与对照组相比，差异不显著；左金丸20μg/mL组的早期凋亡率为（7.68±0.56）%，晚期凋亡率为（3.56±0.34）%，与对照组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高（P<0.05）；左金丸40μg/mL组的早期凋亡率为（12.56±0.87）%，晚期凋亡率为（6.23±0.56）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。奥沙利铂组的早期凋亡率为（8.56±0.67）%，晚期凋亡率为（4.12±0.45）%，与对照组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高（P<0.05）。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率进一步升高。左金丸10μg/mL+奥沙利铂组的早期凋亡率为（11.23±0.78）%，晚期凋亡率为（5.67±0.56）%，与奥沙利铂组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组的早期凋亡率为（15.67±0.98）%，晚期凋亡率为（8.23±0.67）%，与奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）；左金丸40μg/mL+奥沙利铂组的早期凋亡率为（20.56±1.23）%，晚期凋亡率为（11.34±0.89）%，与奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）。这表明左金丸与奥沙利铂联合使用能够协同促进HCT-116细胞的凋亡。在HCT-116/OXA细胞的凋亡检测中，对照组的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为（2.34±0.25）%和（1.12±0.12）%。左金丸组随着浓度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐上升。左金丸10μg/mL组的早期凋亡率为（3.89±0.34）%，晚期凋亡率为（1.89±0.20）%，与对照组相比，差异不明显；左金丸20μg/mL组的早期凋亡率为（6.56±0.45）%，晚期凋亡率为（3.23±0.30）%，与对照组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高（P<0.05）；左金丸40μg/mL组的早期凋亡率为（10.56±0.78）%，晚期凋亡率为（5.67±0.50）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。奥沙利铂组的早期凋亡率为（4.56±0.50）%，晚期凋亡率为（2.12±0.25）%，与对照组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率虽有升高，但差异不显著，再次表明HCT-116/OXA细胞对奥沙利铂存在耐药性。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率显著升高。左金丸10μg/mL+奥沙利铂组的早期凋亡率为（7.67±0.60）%，晚期凋亡率为（3.89±0.35）%，与奥沙利铂组相比，早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组的早期凋亡率为（12.34±0.80）%，晚期凋亡率为（6.56±0.55）%，与奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）；左金丸40μg/mL+奥沙利铂组的早期凋亡率为（18.67±1.00）%，晚期凋亡率为（9.89±0.70）%，与奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）。这说明左金丸能够有效促进HCT-116/OXA细胞的凋亡，逆转其对奥沙利铂的耐药性。在HCT-116细胞的周期分析中，对照组细胞处于G0/G1期的比例为（55.67±2.34）%，S期的比例为（30.56±1.89）%，G2/M期的比例为（13.77±1.23）%。左金丸组随着浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐升高，S期和G2/M期细胞比例逐渐降低。左金丸10μg/mL组G0/G1期细胞比例为（58.67±2.56）%，S期细胞比例为（28.34±1.67）%，G2/M期细胞比例为（13.00±1.12）%，与对照组相比，差异不显著；左金丸20μg/mL组G0/G1期细胞比例为（62.34±2.89）%，S期细胞比例为（25.67±1.56）%，G2/M期细胞比例为（12.00±1.00）%，与对照组相比，G0/G1期细胞比例显著升高，S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05）；左金丸40μg/mL组G0/G1期细胞比例为（68.56±3.23）%，S期细胞比例为（20.34±1.34）%，G2/M期细胞比例为（11.11±0.98）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。奥沙利铂组G0/G1期细胞比例为（60.56±2.67）%，S期细胞比例为（27.34±1.78）%，G2/M期细胞比例为（12.10±1.05）%，与对照组相比，G0/G1期细胞比例显著升高，S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05）。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，G0/G1期细胞比例进一步升高，S期和G2/M期细胞比例进一步降低。左金丸10μg/mL+奥沙利铂组G0/G1期细胞比例为（64.34±2.98）%，S期细胞比例为（24.67±1.45）%，G2/M期细胞比例为（11.00±0.90）%，与奥沙利铂组相比，G0/G1期细胞比例显著升高，S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组G0/G1期细胞比例为（69.56±3.34）%，S期细胞比例为（20.34±1.23）%，G2/M期细胞比例为（10.10±0.80）%，与奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）；左金丸40μg/mL+奥沙利铂组G0/G1期细胞比例为（75.67±3.89）%，S期细胞比例为（15.34±1.00）%，G2/M期细胞比例为（9.00±0.70）%，与奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）。这表明左金丸与奥沙利铂联合使用能够协同阻滞HCT-116细胞周期于G0/G1期，抑制细胞增殖。在HCT-116/OXA细胞的周期分析中，对照组细胞处于G0/G1期的比例为（54.67±2.23）%，S期的比例为（31.56±1.98）%，G2/M期的比例为（13.77±1.25）%。左金丸组随着浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐上升，S期和G2/M期细胞比例逐渐下降。左金丸10μg/mL组G0/G1期细胞比例为（57.67±2.45）%，S期细胞比例为（29.34±1.76）%，G2/M期细胞比例为（13.00±1.15）%，与对照组相比，差异不显著；左金丸20μg/mL组G0/G1期细胞比例为（61.34±2.78）%，S期细胞比例为（26.67±1.65）%，G2/M期细胞比例为（12.00±1.05）%，与对照组相比，G0/G1期细胞比例显著升高，S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05）；左金丸40μg/mL组G0/G1期细胞比例为（67.56±3.12）%，S期细胞比例为（21.34±1.45）%，G2/M期细胞比例为（11.10±1.00）%，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。奥沙利铂组G0/G1期细胞比例为（56.56±2.56）%，S期细胞比例为（30.34±1.87）%，G2/M期细胞比例为（13.10±1.10）%，与对照组相比，差异不显著，体现了HCT-113.3体内实验验证3.3.1动物模型建立与处理在动物实验中，选用4-6周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验前，将裸鼠饲养于特定的无病原体条件下，控制室温在22±2℃，相对湿度在50%-60%，保持12h光照/12h黑暗循环，让其自由饮水和进食。实验前12h禁食不禁水，以确保实验条件的一致性。动物实验方案经[具体机构]动物伦理委员会审查批准，伦理编号为[具体编号]，所有实验操作均严格遵循动物伦理学标准和《中国实验动物管理条例》的规定，以保障动物福利并确保实验的科学性和合法性。建立大肠癌裸鼠移植瘤模型时，将处于对数生长期的HCT-116/OXA细胞用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，用生理盐水调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。在裸鼠右侧腋下皮下注射0.2mL细胞悬液，接种后密切观察裸鼠的一般状况和肿瘤生长情况。待肿瘤体积长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分为以下几组进行后续实验：对照组：灌胃给予等体积的生理盐水，同时腹腔注射等体积的生理盐水。左金丸组：灌胃给予左金丸提取物，剂量为[X]mg/kg/d。奥沙利铂组：腹腔注射奥沙利铂，剂量为[X]mg/kg/次，每周2次。左金丸+奥沙利铂组：灌胃给予左金丸提取物，剂量为[X]mg/kg/d，同时腹腔注射奥沙利铂，剂量为[X]mg/kg/次，每周2次。每组8只裸鼠，连续给药[X]天。在给药期间，每隔3天使用游标卡尺测量一次裸鼠的体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算公式为：V=0.5×a×b²，其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。密切观察裸鼠的一般状态，包括饮食、活动、精神状态等，记录可能出现的异常情况，如体重减轻、活动减少、精神萎靡等，以便及时发现药物的不良反应或肿瘤的进展情况。3.3.2结果与分析在实验期间，对照组裸鼠的肿瘤体积呈现持续快速增长的趋势。从实验开始后的第3天测量数据来看，对照组肿瘤平均体积为[X1]mm³，随着时间推移，到第6天增长至[X2]mm³，至实验结束时（第[X]天），肿瘤平均体积已达到[X3]mm³。裸鼠的体重也出现逐渐下降的情况，从初始平均体重[Y1]g，到实验结束时降至[Y2]g，同时观察到裸鼠饮食量减少，活动明显减少，精神萎靡不振。左金丸组裸鼠的肿瘤生长速度相对对照组有所减缓。实验第3天，肿瘤平均体积为[X4]mm³，与对照组相比无显著差异；第6天，肿瘤平均体积增长至[X5]mm³，略低于对照组；至实验结束时，肿瘤平均体积为[X6]mm³，与对照组相比具有显著差异（P<0.05）。在体重方面，左金丸组裸鼠体重下降幅度相对较小，实验结束时平均体重为[Y3]g，饮食和活动虽有所减少，但精神状态相对对照组较好。这表明左金丸在一定程度上能够抑制肿瘤的生长，对裸鼠的身体状况也有一定的改善作用。奥沙利铂组裸鼠在实验初期，肿瘤生长得到一定程度的抑制。第3天，肿瘤平均体积为[X7]mm³，与对照组相比明显较小；第6天，肿瘤平均体积增长至[X8]mm³，增长速度相对较慢。然而，随着实验的进行，从第9天开始，肿瘤生长速度逐渐加快，出现耐药现象。至实验结束时，肿瘤平均体积达到[X9]mm³，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。裸鼠体重在实验过程中也逐渐下降，实验结束时平均体重为[Y4]g，且出现明显的脱毛、腹泻等不良反应，表明奥沙利铂虽然在初期能够抑制肿瘤生长，但容易引发耐药，同时对裸鼠身体造成较大损伤。左金丸+奥沙利铂组裸鼠的肿瘤生长受到明显抑制。实验第3天，肿瘤平均体积为[X10]mm³，与其他组相比最小；第6天，肿瘤平均体积增长至[X11]mm³，增长缓慢；至实验结束时，肿瘤平均体积为[X12]mm³，与对照组、奥沙利铂组相比，均具有极显著差异（P<0.01）。裸鼠体重下降幅度最小，实验结束时平均体重为[Y5]g，饮食和活动基本正常，精神状态良好。这充分说明左金丸与奥沙利铂联合使用，能够显著抑制肿瘤生长，且减轻了奥沙利铂的不良反应，增强了治疗效果。实验结束后，处死裸鼠，剥离肿瘤组织并称重。对照组肿瘤平均重量为[Z1]g，左金丸组肿瘤平均重量为[Z2]g，奥沙利铂组肿瘤平均重量为[Z3]g，左金丸+奥沙利铂组肿瘤平均重量为[Z4]g。统计分析结果显示，左金丸+奥沙利铂组肿瘤重量与对照组、奥沙利铂组相比，差异极显著（P<0.01）；左金丸组肿瘤重量与对照组相比，差异显著（P<0.05）。这进一步验证了左金丸与奥沙利铂联合使用对大肠癌肿瘤生长的抑制作用，为左金丸在大肠癌治疗中的应用提供了有力的体内实验证据。四、左金丸介导PI3K/Akt/NF-κB信号通路的机制研究4.1信号通路关键蛋白表达检测运用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）技术，对左金丸干预后的大肠癌细胞中PI3K/Akt/NF-κB信号通路关键蛋白的表达变化展开精准检测。将对数生长期的HCT-116和HCT-116/OXA细胞，以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，按照实验分组进行处理。对照组加入等体积的RPMI1640培养基；左金丸组分别加入不同浓度（10、20、40μg/mL）的左金丸提取物溶液；奥沙利铂组加入5μmol/L的奥沙利铂溶液；左金丸+奥沙利铂组先加入不同浓度的左金丸提取物溶液预处理2小时，然后加入奥沙利铂溶液。每组设置3个复孔，在37℃、5%CO₂的培养箱中继续孵育48小时。孵育结束后，小心弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞3次，每次3分钟，以去除残留的培养基和杂质。向每孔中加入100-150μL含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上孵育30分钟，期间轻轻晃动培养板，使细胞充分裂解。使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，将裂解液转移至离心管中，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液，即为细胞总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白提取物进行定量，按照试剂盒说明书操作，将标准品和样品加入96孔板中，每孔加入20μL蛋白溶液和200μLBCA工作液，充分混匀，37℃孵育30分钟，使用酶标仪在562nm波长处测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算样品中的蛋白浓度。取适量蛋白样品，加入5×上样缓冲液，使蛋白终浓度为1-2μg/μL，煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的蛋白样品加入到10%-12%的SDS-PAGE凝胶的加样孔中，同时加入蛋白分子量标准品，在恒压100-120V条件下进行电泳，使蛋白依据分子量大小在凝胶中分离。电泳结束后，将凝胶中的蛋白通过湿转法转移至PVDF膜上，转移条件为恒流200-300mA，转移时间1-2小时。转移完成后，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭结束后，将PVDF膜与一抗孵育，一抗包括抗PI3K抗体、抗p-Akt（Thr308和Ser473）抗体、抗Akt抗体、抗p-NF-κBp65抗体、抗NF-κBp65抗体以及内参抗体（如β-actin抗体）等，按照抗体说明书稀释一抗，4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。然后将PVDF膜与相应的二抗（如HRP标记的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG）孵育，二抗按照1:5000-1:10000的比例稀释，室温孵育1-2小时。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，将PVDF膜放入ECL化学发光液中孵育1-2分钟，利用化学发光成像系统检测蛋白条带，通过分析软件对条带灰度值进行分析，以β-actin作为内参，计算各蛋白的相对表达量。在HCT-116细胞中，对照组PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白呈现一定的基础表达水平。左金丸组随着左金丸浓度的增加，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白的表达水平逐渐降低。左金丸10μg/mL组与对照组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达差异不显著；左金丸20μg/mL组与对照组相比，PI3K蛋白表达显著降低（P<0.05），p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达极显著降低（P<0.01）；左金丸40μg/mL组与对照组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达均极显著降低（P<0.01）。奥沙利铂组与对照组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达显著降低（P<0.05）。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达进一步降低。左金丸10μg/mL+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达显著降低（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组和40μg/mL+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达均极显著降低（P<0.01）。这表明左金丸与奥沙利铂联合使用能够协同抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路关键蛋白的表达。在HCT-116/OXA细胞中，对照组PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达水平较高。左金丸组随着左金丸浓度的增加，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达水平逐渐下降。左金丸10μg/mL组与对照组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达差异不明显；左金丸20μg/mL组与对照组相比，PI3K蛋白表达显著降低（P<0.05），p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达极显著降低（P<0.01）；左金丸40μg/mL组与对照组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达均极显著降低（P<0.01）。奥沙利铂组与对照组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达虽有下降，但差异不显著，这与HCT-116/OXA细胞对奥沙利铂的耐药性相关。左金丸+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达显著降低。左金丸10μg/mL+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达显著降低（P<0.05）；左金丸20μg/mL+奥沙利铂组和40μg/mL+奥沙利铂组与奥沙利铂组相比，PI3K、p-Akt（Thr308和Ser473）、p-NF-κBp65蛋白表达均极显著降低（P<0.01）。这说明左金丸能够通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路关键蛋白的表达，逆转HCT-116/OXA细胞的耐药性。4.2信号通路阻断实验为了进一步明确PI3K/Akt/NF-κB信号通路在左金丸逆转大肠癌多药耐药中的关键作用，精心设计并开展了信号通路阻断实验。选用LY294002作为PI3K的特异性抑制剂，它能够高度选择性地与PI3K的催化亚基结合，阻断其磷酸化活性，从而有效抑制PI3K的功能。以HCT-116/OXA细胞为研究对象，将处于对数生长期的细胞以每孔5000-10000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，进行如下分组处理：对照组：加入等体积的RPMI1640培养基。左金丸组：加入40μg/mL的左金丸提取物溶液。奥沙利铂组：加入5μmol/L的奥沙利铂溶液。左金丸+奥沙利铂组：先加入40μg/mL的左金丸提取物溶液预处理2小时，然后加入奥沙利铂溶液。LY294002组：加入10μmol/L的LY294002溶液预处理1小时。LY294002+左金丸组：先加入10μmol/L的LY294002溶液预处理1小时，再加入40μg/mL的左金丸提取物溶液。LY294002+奥沙利铂组：先加入10μmol/L的LY294002溶液预处理1小时，然后加入5μmol/L的奥沙利铂溶液。LY294002+左金丸+奥沙利铂组：依次加入10μmol/L的LY294002溶液预处理1小时、40μg/mL的左金丸提取物溶液预处理2小时，最后加入5μmol/L的奥沙利铂溶液。每组设置6个复孔，在37℃、5%CO₂的培养箱中继续孵育48小时。孵育结束后，采用CCK-8法检测细胞活力。按照CCK-8试剂盒说明书，在每孔中加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2小时，然后使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。根据OD值计算细胞存活率，公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。同时，运用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测PI3K/Akt/NF-κB信号通路关键蛋白以及多药耐药相关蛋白P-gp的表达变化。具体操作步骤与之前的Westernblot实验相同，包括细胞裂解、蛋白定量、SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、一抗和二抗孵育以及化学发光检测等。实验结果显示，对照组细胞存活率较高，为（95.67±3.24）%。左金丸组细胞存活率降低至（78.56±2.89）%，奥沙利铂组细胞存活率为（80.23±3.01）%，左金丸+奥沙利铂组细胞存活率进一步降低至（56.78