巨噬细胞ILF3：动脉粥样硬化病变中的关键角色与机制探究

巨噬细胞ILF3：动脉粥样硬化病变中的关键角色与机制探究一、引言1.1研究背景与意义动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种严重危害人类健康的慢性疾病，被视为心血管疾病（Cardiovasculardisease，CVD）的主要病因。据世界卫生组织（WHO）2018年统计数据显示，全球范围内每年约有1790万人死于心血管疾病，占全球年总死亡率的31％，而动脉粥样硬化在其中扮演着关键角色。动脉粥样硬化可累及全身动脉系统，当病变发生在冠状动脉，可引发心绞痛、心肌梗死，甚至导致心律失常和猝死；在脑血管，会引起脑缺血、脑萎缩，严重时造成脑血管破裂出血；肾动脉粥样硬化常引发夜尿、顽固性高血压，严重者可出现肾功能不全；肠系膜动脉粥样硬化表现为饱餐后腹痛、便血等；下肢动脉粥样硬化则会导致间歇性跛行，足背动脉搏动消失，严重时甚至发生坏疽。这些严重后果给患者的生命健康和生活质量带来了极大的威胁。最初，动脉粥样硬化被认为是一种血管退行性病变，但随着研究的不断深入，现在更多地被视作是一种慢性的脂质驱动的炎症浸润性疾病。胆固醇脂蛋白在动脉血管壁的浸润和积累是动脉粥样硬化发生的重要起始事件，这些脂蛋白随后会发生修饰，进而诱导单核细胞浸润血管壁并分化为炎性细胞。炎性细胞分泌的炎性因子会进一步促进病变局部的炎症反应，持续的炎症状态加剧了斑块的不稳定性，并最终可导致斑块的破裂，引发急性心血管事件。多项研究都为炎症在动脉粥样硬化发病机制中的关键作用提供了有力证据。2017年的CANTOS临床试验（Canakinumab抗血栓形成结果研究）数据显示，既往心肌梗死和高血清c反应蛋白的受试者接受IL-1β单克隆抗体（Canakinumab）或安慰剂治疗后，Canakinumab治疗组心血管事件的发生风险显著降低。2019年的COLCOT试验结果数据也表明，与安慰剂组相比，0.5mg秋水仙碱治疗组可显著降低近期心肌梗死患者首次和总缺血性心血管事件发生的风险。Canakinumab与秋水仙碱作为直接的抗炎药物，这两项国际多中心、随机、双盲的临床试验均有力地证明了动脉粥样硬化的发生与炎症密切相关。在动脉粥样硬化斑块内，存在着多种免疫细胞，包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、T细胞及B细胞等，其中巨噬细胞对动脉粥样硬化的发生、发展起着最为关键的作用。巨噬细胞可以摄取氧化的低密度脂蛋白颗粒（Oxidizedlowdensitylipoprotein，ox-LDL），进而形成泡沫细胞，这一过程是动脉粥样硬化形成的重要标志。同时，浸润到病变损伤区域的巨噬细胞迁移能力降低，它们会分泌促炎细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等，这些炎性因子会吸引更多的免疫细胞聚集到病变部位，进一步加重炎症反应。巨噬细胞还通过调节胶原蛋白和蛋白酶如基质金属蛋白酶的产生，影响斑块的稳定性，最终诱导病变区域发展为复杂的动脉粥样硬化斑块。当斑块内的炎症反应持续加剧，纤维帽在蛋白水解酶的作用下变薄，同时T淋巴细胞产生的γ-干扰素抑制平滑肌细胞合成胶原，肥大细胞减少平滑肌细胞在斑块内的数目，这些因素共同作用导致斑块稳定性下降，容易破裂形成血栓，引发急性心血管事件。白细胞介素增强结合因子3（Interleukinenhancerbindingfactor3，ILF3），也被称为NF90/NF110，编码的双链RNA结合蛋白可与其他蛋白、mRNA和非编码RNA结合，在基因表达和mRNA稳定的调控中发挥着重要作用。现有文献对ILF3的报道主要集中在病毒领域，但越来越多的研究开始关注其在其他生理和病理过程中的作用。基因组和表观基因组关联研究发现ILF3可能在早期血脂异常、血栓形成、和中风亚型中发挥作用。有研究表明，非诺贝特作为一种降脂药物，可通过抑制ILF3活性来减轻炎症，提示ILF3与炎症反应之间存在着某种联系。在乳腺癌中，ILF3可通过调节血管内皮生长因子mRNA的稳定性促进血管生成，这表明ILF3在细胞的增殖、分化和血管生成等过程中具有重要作用，也暗示了其在血管相关疾病中的潜在作用。尽管已有这些证据表明ILF3在血管疾病中可能起作用，但ILF3对动脉粥样硬化的影响尚未得到明确证实。本研究聚焦于巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化病变中的作用及机制，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。在理论方面，深入探究巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化中的作用机制，有望揭示动脉粥样硬化发病的新机制，进一步完善动脉粥样硬化的炎症理论，为心血管疾病的病理生理学研究提供新的思路和方向。在临床应用方面，如果能够明确巨噬细胞ILF3与动脉粥样硬化病变进展的关系，可能为动脉粥样硬化相关疾病的诊断、治疗和预后评估提供新的生物标志物和潜在治疗靶点。通过对巨噬细胞ILF3的干预，或许能够开发出更有效的治疗策略，减轻炎症反应，稳定斑块，降低急性心血管事件的发生风险，从而改善患者的预后，提高患者的生活质量，具有广阔的应用前景。1.2国内外研究现状动脉粥样硬化作为心血管疾病的主要病理基础，其发病机制一直是国内外研究的重点领域。早期研究主要聚焦于脂质代谢紊乱在动脉粥样硬化中的作用，认为血液中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，尤其是氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL），在动脉粥样硬化的起始阶段发挥关键作用。ox-LDL被巨噬细胞摄取后形成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化斑块形成的标志性事件。随着研究的深入，炎症在动脉粥样硬化中的核心作用逐渐被揭示。炎症细胞，如单核细胞、巨噬细胞、T细胞等在血管壁的浸润，以及炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的释放，参与并推动了动脉粥样硬化的发生、发展进程。例如，在动脉粥样硬化的早期阶段，单核细胞在趋化因子的作用下迁移至血管内膜下，分化为巨噬细胞，巨噬细胞摄取ox-LDL转变为泡沫细胞，同时分泌多种炎症因子，进一步招募更多的炎症细胞，形成炎症级联反应。近年来，关于动脉粥样硬化发病机制的研究不断拓展，涉及到细胞自噬、内质网应激、血管平滑肌细胞表型转化等多个方面。细胞自噬是细胞内的一种自我降解过程，在动脉粥样硬化中，巨噬细胞的自噬功能失调可导致脂质代谢紊乱和炎症反应加剧。内质网应激是细胞在应对各种应激刺激时，内质网稳态失衡引发的一系列反应，内质网应激相关信号通路的激活与动脉粥样硬化斑块的形成和稳定性密切相关。血管平滑肌细胞从收缩型向合成型的表型转化，使其增殖、迁移能力增强，分泌细胞外基质的能力改变，也在动脉粥样硬化的发展中起到重要作用。巨噬细胞在动脉粥样硬化中的作用一直是研究热点。巨噬细胞作为动脉粥样硬化斑块内的主要炎症细胞，其功能状态对动脉粥样硬化的进程有着深远影响。巨噬细胞具有多种功能，包括吞噬作用、分泌细胞因子和趋化因子、参与抗原提呈等。在动脉粥样硬化中，巨噬细胞通过清道夫受体摄取ox-LDL，形成泡沫细胞，促进斑块的形成。同时，巨噬细胞分泌的炎症因子如TNF-α、IL-1β、MCP-1等，可招募更多的免疫细胞到病变部位，加剧炎症反应。巨噬细胞还可以通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs），降解细胞外基质，影响斑块的稳定性。当斑块内的巨噬细胞数量增加、活性增强，尤其是促炎型巨噬细胞（M1型）占主导时，斑块的稳定性下降，容易破裂引发急性心血管事件。相反，抗炎型巨噬细胞（M2型）可分泌抗炎因子如IL-10、TGF-β等，抑制炎症反应，促进斑块的稳定。白细胞介素增强结合因子3（ILF3）作为一种双链RNA结合蛋白，在基因表达调控、RNA代谢等过程中发挥重要作用。在病毒感染领域，ILF3已被广泛研究，它参与病毒的复制、转录等过程，与病毒的致病性密切相关。在肿瘤研究中，ILF3也被发现与肿瘤的发生、发展、转移等过程相关。例如，在乳腺癌中，ILF3可通过调节血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的稳定性，促进肿瘤血管生成，从而支持肿瘤的生长和转移。在心血管疾病方面，虽然ILF3的研究相对较少，但已有一些线索提示其潜在作用。基因组和表观基因组关联研究发现ILF3可能在早期血脂异常、血栓形成、中风亚型中发挥作用。有研究表明，降脂药物非诺贝特可通过抑制ILF3活性来减轻炎症，暗示了ILF3与心血管炎症之间的联系。在急性冠脉综合征（ACS）患者的血清中，ILF3水平升高明显，这进一步表明ILF3可能参与了心血管疾病的病理过程。然而，目前关于ILF3在动脉粥样硬化中的具体作用及机制仍不清楚，亟待深入研究。1.3研究目的与方法本研究旨在深入探究巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化病变中的作用及机制，为动脉粥样硬化相关疾病的防治提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体研究目的如下：一是明确巨噬细胞ILF3对动脉粥样硬化进展的影响，通过体内外实验，观察巨噬细胞ILF3表达改变时动脉粥样硬化斑块的形成、发展及相关病理变化，以确定其在动脉粥样硬化进程中的具体作用；二是探究血清ILF3与动脉粥样硬化病变进展的关系，分析不同程度动脉粥样硬化患者血清ILF3水平的变化，以及其与病变严重程度、临床指标的相关性，为动脉粥样硬化的早期诊断和病情评估提供潜在的生物标志物；三是探究巨噬细胞ILF3与血清ILF3的关系，明确巨噬细胞ILF3是否参与血清ILF3水平的调控，以及两者之间的内在联系，进一步揭示ILF3在动脉粥样硬化中的作用机制。为实现上述研究目的，本研究将采用以下研究方法：在临床标本研究方面，依据齐鲁医院伦理委员会的伦理学要求，于山东省红十字会收集健康人体冠状动脉、颈动脉标本以及动脉粥样硬化疾病累及冠状动脉标本。对这些标本进行相关检测，如免疫组化检测ILF3的表达，分析其与动脉粥样硬化病变程度的相关性。在实验动物研究方面，选用ApoE基因敲除8周龄雄性小鼠（C57/BL6J品系背景，购自北京华阜康公司，源自JacksonLab）作为动脉粥样硬化模型小鼠。构建巨噬细胞特异性ILF3敲除小鼠（ILF3flox/flox，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建）、巨噬细胞特异性ILF3过表达小鼠（ILF3rosa-/+，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建）以及Lyz2-Cre工具鼠（由北京唯尚立德公司提供）。将ILF3flox/flox与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性敲除小鼠（ILF3flox/floxLyz2-Cre），命名为ILF3M-KO；将ILF3rosa/+与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性高表达小鼠（ILF3rosa/+Lyz2-Cre）小鼠，命名为ILF3M-TG，并通过小鼠尾巴提取的DNA予以基因型鉴定。将上述巨噬细胞ILF3特异性敲除与过表达小鼠与ApoE-/-小鼠交配，获得ILF3WT/ApoE-/-，ILF3M-KO/ApoE-/-及ILF3M-Tg/ApoE-/-模型小鼠。经高脂饲料喂养8周、16周后，取材并将小鼠主动脉根部制作成切片，观察不同小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况。对人体冠状动脉、颈动脉标本及小鼠主动脉根部组织，切片分别行油红O染色观察斑块面积，天狼猩红染色检测胶原成分，CD68和α-SMA免疫学组织染色分析斑块内巨噬细胞及平滑肌细胞数量。依据上述染色数据计算斑块易损指数，易损指数=(巨噬细胞阳性面积％+脂质阳性面积％)/(平滑肌细胞阳性面积％+胶原阳性面积％)。对不同基因型小鼠腹腔注射6％淀粉，三天后利用细胞贴壁方法提取小鼠腹腔巨噬细胞用于后续细胞学实验。通过这些实验方法，全面深入地研究巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化病变中的作用及机制。二、动脉粥样硬化病变概述2.1动脉粥样硬化的定义与危害动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种以大、中动脉内膜进行性脂质沉积、纤维组织增生和钙质沉着，导致动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小为特征的慢性血管疾病。其病变主要累及弹力型动脉（如主动脉及其一级分支）和弹力肌型动脉（如冠状动脉、脑动脉等）。从病理角度来看，动脉粥样硬化的发展是一个渐进的过程。在早期，动脉内膜下会出现脂质条纹，主要由吞噬了脂质的巨噬细胞和少量平滑肌细胞组成，这些脂质条纹是动脉粥样硬化的早期病变表现。随着病情的进展，脂质条纹逐渐发展为粥样斑块，粥样斑块由纤维帽、脂质核心和周围的炎症细胞组成，纤维帽是由平滑肌细胞和细胞外基质构成，起到维持斑块稳定性的作用，而脂质核心则富含胆固醇结晶、坏死细胞碎片等。当粥样斑块进一步发展，纤维帽变薄，斑块内的炎症反应加剧，就容易导致斑块破裂，形成血栓，引发急性心血管事件。动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因，具有极高的发病率和死亡率。在全球范围内，心血管疾病已成为人类健康的头号杀手。根据世界卫生组织（WHO）的数据，每年约有1790万人死于心血管疾病，其中很大一部分是由动脉粥样硬化引起的。在中国，随着人口老龄化和生活方式的改变，动脉粥样硬化及其相关心血管疾病的发病率也呈逐年上升趋势。据统计，我国心血管疾病患者已达2.9亿，每年因心血管疾病死亡的人数超过400万。动脉粥样硬化对健康的危害是多方面的。在心血管系统，冠状动脉粥样硬化可导致心肌缺血、缺氧，引发心绞痛、心肌梗死等严重疾病，严重威胁患者的生命安全。脑动脉粥样硬化可引起脑供血不足、脑梗死、脑出血等，导致患者出现头晕、头痛、偏瘫、失语等症状，严重影响患者的生活质量。肾动脉粥样硬化可导致肾功能减退，甚至发展为肾衰竭，需要长期透析或肾移植治疗。下肢动脉粥样硬化可导致下肢缺血、疼痛、间歇性跛行，严重时可导致下肢坏疽，不得不截肢，给患者带来极大的痛苦。动脉粥样硬化不仅对患者的健康造成严重威胁，也给社会和家庭带来沉重的经济负担。心血管疾病的治疗费用高昂，包括药物治疗、手术治疗、康复治疗等。据估算，我国每年用于心血管疾病的医疗费用超过3000亿元。此外，患者因患病无法正常工作，也会导致生产力下降，给家庭和社会带来间接经济损失。动脉粥样硬化还会增加社会的医疗资源负担，影响社会的可持续发展。因此，深入研究动脉粥样硬化的发病机制，寻找有效的防治措施，对于降低心血管疾病的发病率和死亡率，提高人类健康水平，减轻社会经济负担具有重要意义。2.2发病原理与进程动脉粥样硬化的发病原理较为复杂，目前普遍认为脂质代谢障碍在其中起着关键的起始作用。人体的脂质代谢是一个精细的过程，涉及多种脂质成分和代谢途径。正常情况下，血液中的脂质如胆固醇、甘油三酯等与载脂蛋白结合形成脂蛋白，其中低密度脂蛋白（LDL）负责将胆固醇运输到外周组织。当脂质代谢出现异常时，血液中LDL水平升高，尤其是LDL发生氧化修饰，形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有较强的细胞毒性，它可以改变内皮细胞的功能状态，使其表面的粘附分子表达增加，如血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）等。这些粘附分子能够吸引血液中的单核细胞粘附到血管内皮表面，并促使单核细胞迁移进入血管内膜下。进入内膜下的单核细胞会分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过表面的清道夫受体大量摄取ox-LDL，逐渐转化为泡沫细胞。泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化早期病变的重要标志，它们在血管内膜下不断积聚，形成脂质条纹。随着病变的进一步发展，脂质条纹逐渐演变为粥样斑块。在这个过程中，多种细胞和分子参与其中。平滑肌细胞从动脉中层迁移至内膜下，它们增殖并合成大量细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白等，这些细胞外基质在脂质核心周围形成纤维帽，将脂质核心包裹起来，形成粥样斑块。同时，炎症细胞如T淋巴细胞、肥大细胞等也在斑块内浸润。T淋巴细胞可分泌多种细胞因子，如γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，这些细胞因子可以激活巨噬细胞，增强其炎症反应活性，促进泡沫细胞的形成和脂质的积聚。肥大细胞则可释放组胺、类胰蛋白酶等生物活性物质，这些物质可以促进平滑肌细胞的增殖和迁移，同时也会增加血管壁的通透性，有利于脂质的沉积。在炎症细胞和细胞因子的持续作用下，粥样斑块不断增大，纤维帽逐渐变薄。当纤维帽无法承受斑块内的压力时，就会发生破裂，暴露的脂质核心和组织因子会激活血小板聚集和凝血系统，形成血栓。血栓的形成会导致血管腔急性阻塞，引发急性心血管事件，如心肌梗死、脑卒中等。从内膜病变到血管腔狭窄是一个渐进的过程。在动脉粥样硬化的早期，内膜病变主要表现为脂质条纹和早期粥样斑块的形成，此时血管腔的狭窄程度较轻，一般不会引起明显的临床症状。随着病变的进展，粥样斑块不断增大，纤维帽逐渐变薄，血管腔的狭窄程度逐渐加重。当血管腔狭窄程度达到一定程度时，就会影响血液的正常流动，导致相应器官的供血不足。例如，冠状动脉粥样硬化导致管腔狭窄超过50%时，患者在体力活动或情绪激动等情况下，可能会出现心绞痛症状，表现为胸骨后压榨性疼痛，可向左肩、左臂放射。当血管腔狭窄进一步加重，达到70%以上时，即使在静息状态下，也可能出现心肌缺血的症状，严重时可引发心肌梗死。脑动脉粥样硬化导致血管腔狭窄时，患者可出现头晕、头痛、记忆力减退等症状，当狭窄严重导致脑梗死时，会出现偏瘫、失语、昏迷等严重后果。下肢动脉粥样硬化导致血管腔狭窄时，患者会出现间歇性跛行，即行走一段距离后，下肢会出现疼痛、麻木等不适，休息后可缓解，继续行走又会出现，随着病情的加重，跛行距离会逐渐缩短，严重时可导致下肢坏疽。2.3炎症在动脉粥样硬化中的作用炎症在动脉粥样硬化的发生、发展过程中扮演着极为关键的角色，贯穿于疾病的各个阶段。在动脉粥样硬化的起始阶段，炎症反应就已悄然启动。当血管内皮细胞受到诸如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、高血压、高血糖等多种危险因素的刺激时，其正常的生理功能会受到干扰，发生损伤。内皮细胞损伤后，会产生一系列变化，其中包括表面粘附分子的表达上调，如血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）等。这些粘附分子如同“信号灯塔”，吸引血液中的单核细胞粘附到血管内皮表面。单核细胞随后穿越内皮细胞层，迁移进入血管内膜下，并在局部微环境的作用下分化为巨噬细胞。巨噬细胞具有强大的吞噬能力，它们通过表面的清道夫受体大量摄取ox-LDL，逐渐转化为泡沫细胞。泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化早期病变的重要标志，而这一过程与炎症反应密切相关，炎症细胞的浸润和炎症因子的释放为泡沫细胞的形成创造了条件。随着动脉粥样硬化的发展，炎症反应不断加剧。在病变部位，巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞大量聚集。巨噬细胞在摄取ox-LDL后，不仅自身形态和功能发生改变，还会分泌多种炎性因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等。这些炎性因子具有广泛的生物学活性，它们可以激活周围的细胞，进一步放大炎症反应。例如，TNF-α可以促进内皮细胞表达更多的粘附分子，吸引更多的炎症细胞聚集；IL-1和IL-6则可以刺激肝脏合成C反应蛋白（CRP）等急性时相蛋白，CRP是一种重要的炎症标志物，其水平的升高与动脉粥样硬化的严重程度密切相关。T淋巴细胞在动脉粥样硬化的炎症反应中也起着关键作用。Th1型T淋巴细胞主要分泌γ-干扰素（IFN-γ）等促炎细胞因子，IFN-γ可以激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力，同时还可以抑制平滑肌细胞合成胶原，导致纤维帽变薄，增加斑块的不稳定性。Th2型T淋巴细胞则分泌白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）等抗炎细胞因子，这些细胞因子可以抑制炎症反应，促进斑块的稳定。在正常情况下，Th1/Th2细胞处于平衡状态，维持着炎症反应的适度进行。然而，在动脉粥样硬化患者中，这种平衡往往被打破，Th1细胞功能亢进，Th2细胞功能相对不足，导致炎症反应过度激活，加速了动脉粥样硬化的发展。炎症反应还与动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关。稳定的动脉粥样硬化斑块通常具有较厚的纤维帽和较小的脂质核心，而不稳定斑块则纤维帽较薄，脂质核心较大，容易发生破裂。炎症细胞和炎症因子在斑块稳定性的调节中起着重要作用。巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）可以降解细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白等，使纤维帽变薄。此外，巨噬细胞还可以分泌组织因子，组织因子是一种促凝血物质，它可以激活凝血系统，导致血栓形成。当斑块破裂时，暴露的脂质核心和组织因子会引发急性血栓形成，堵塞血管，导致急性心血管事件的发生，如心肌梗死、脑卒中等。炎症反应还可以通过影响平滑肌细胞的功能来影响斑块的稳定性。炎症因子可以抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，减少胶原蛋白的合成，使纤维帽的修复能力下降。同时，炎症因子还可以促进平滑肌细胞凋亡，进一步削弱纤维帽的强度。炎症在动脉粥样硬化的发生、发展和斑块稳定性中起着至关重要的作用。从早期的内皮细胞损伤、单核细胞浸润和泡沫细胞形成，到中期的炎症细胞聚集和炎性因子释放，再到晚期的斑块破裂和急性心血管事件的发生，炎症反应贯穿始终。深入研究炎症在动脉粥样硬化中的作用机制，对于揭示动脉粥样硬化的发病机制，寻找有效的防治措施具有重要意义。通过抑制炎症反应，有望减轻动脉粥样硬化的病变程度，稳定斑块，降低急性心血管事件的发生风险。三、巨噬细胞与动脉粥样硬化3.1巨噬细胞在动脉粥样硬化中的功能巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生、发展过程中扮演着多面角色，其功能异常与动脉粥样硬化的进程紧密相连。巨噬细胞最显著的功能之一是吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），进而形成泡沫细胞，这一过程是动脉粥样硬化早期病变的关键事件。在正常生理状态下，巨噬细胞通过表面的清道夫受体识别并摄取ox-LDL，以维持细胞内脂质平衡。然而，在动脉粥样硬化的病理环境中，血液中ox-LDL水平升高，巨噬细胞持续大量摄取ox-LDL，超过了其代谢能力，导致脂质在细胞内大量积聚。这些积聚的脂质形成脂滴，使巨噬细胞的形态和功能发生改变，逐渐转化为泡沫细胞。泡沫细胞在血管内膜下不断堆积，形成脂质条纹，这是动脉粥样硬化的早期特征性病变。随着病情的进展，泡沫细胞进一步融合、坏死，释放出大量的脂质和炎症介质，促进了粥样斑块的形成和发展。巨噬细胞还具有分泌细胞因子和趋化因子的重要功能，在动脉粥样硬化的炎症反应中发挥关键作用。当巨噬细胞受到ox-LDL、脂多糖（LPS）等刺激时，会激活细胞内的信号通路，启动炎症因子的转录和翻译过程。巨噬细胞可分泌多种促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等。TNF-α能够激活内皮细胞，使其表达更多的粘附分子，吸引更多的炎症细胞聚集到血管内膜下，加剧炎症反应。IL-1和IL-6则可以刺激肝脏合成C反应蛋白（CRP）等急性时相蛋白，CRP水平的升高是炎症反应加剧的重要标志，与动脉粥样硬化的严重程度密切相关。巨噬细胞还能分泌趋化因子，如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等。MCP-1能够吸引血液中的单核细胞向血管内膜下迁移，单核细胞在局部微环境的作用下分化为巨噬细胞，进一步扩大了炎症细胞的数量。MIP-1α则可以招募T淋巴细胞等炎症细胞，增强炎症反应的强度。这些细胞因子和趋化因子相互作用，形成复杂的炎症网络，推动动脉粥样硬化的发展。巨噬细胞在抗原提呈和免疫调节方面也发挥着重要作用。作为抗原提呈细胞，巨噬细胞能够摄取、加工和提呈抗原给T淋巴细胞，启动适应性免疫反应。在动脉粥样硬化病变中，巨噬细胞摄取ox-LDL等抗原物质后，将其处理成抗原肽片段，并与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，呈现在细胞表面。T淋巴细胞识别抗原肽-MHC复合物后，被激活并增殖分化，产生多种细胞因子，进一步调节免疫反应。Th1型T淋巴细胞主要分泌γ-干扰素（IFN-γ）等促炎细胞因子，IFN-γ可以激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤能力，同时还可以抑制平滑肌细胞合成胶原，导致纤维帽变薄，增加斑块的不稳定性。Th2型T淋巴细胞则分泌白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）等抗炎细胞因子，这些细胞因子可以抑制炎症反应，促进斑块的稳定。巨噬细胞还可以通过分泌调节性细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）等，调节免疫细胞的功能和活性，维持免疫平衡。在动脉粥样硬化的不同阶段，巨噬细胞的抗原提呈和免疫调节功能对炎症反应的强度和方向具有重要影响，进而影响着动脉粥样硬化的进程。3.2巨噬细胞的极化与动脉粥样硬化巨噬细胞具有显著的可塑性，在不同的微环境刺激下，可极化为不同的表型，其中M1型和M2型巨噬细胞是两种典型的极化状态。M1型巨噬细胞又被称为经典活化巨噬细胞，主要由干扰素-γ（IFN-γ）、脂多糖（LPS）等刺激诱导产生。M1型巨噬细胞具有强大的促炎活性，其高表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），能够产生大量的一氧化氮（NO），NO具有细胞毒性，可杀伤病原体和肿瘤细胞，但同时也会对周围组织造成损伤。M1型巨噬细胞还分泌多种促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等。TNF-α可以激活内皮细胞，使其表达更多的粘附分子，吸引更多的炎症细胞聚集到血管内膜下，加剧炎症反应。IL-1和IL-6则可以刺激肝脏合成C反应蛋白（CRP）等急性时相蛋白，CRP水平的升高是炎症反应加剧的重要标志，与动脉粥样硬化的严重程度密切相关。在动脉粥样硬化病变中，M1型巨噬细胞的大量浸润会导致炎症反应的失控，促进脂质的氧化修饰和泡沫细胞的形成，增加斑块内的炎症细胞数量和活性，使斑块变得不稳定，容易破裂引发急性心血管事件。M2型巨噬细胞即替代活化巨噬细胞，主要由白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）等细胞因子诱导产生。M2型巨噬细胞具有抗炎和组织修复的功能。它高表达精氨酸酶-1（Arg-1），Arg-1可以将精氨酸代谢为鸟氨酸和多胺，这些物质参与细胞增殖、组织修复和胶原蛋白合成。M2型巨噬细胞还分泌多种抗炎细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等。IL-10能够抑制炎症细胞的活化和炎症因子的分泌，减轻炎症反应。TGF-β可以促进平滑肌细胞合成胶原蛋白，增强纤维帽的强度，有助于维持斑块的稳定性。在动脉粥样硬化的发展过程中，M2型巨噬细胞的存在有利于抑制炎症反应，促进胆固醇的逆向转运，减少泡沫细胞的形成，增强斑块的稳定性。当M2型巨噬细胞在斑块内占优势时，斑块的炎症程度减轻，纤维帽增厚，脂质核心缩小，从而降低了斑块破裂的风险。在动脉粥样硬化的发生、发展过程中，M1型和M2型巨噬细胞的平衡至关重要。正常情况下，巨噬细胞在不同微环境的调节下，维持着M1/M2的动态平衡，以保证机体的免疫稳态和血管壁的正常功能。然而，在动脉粥样硬化的病理状态下，这种平衡往往被打破。在疾病的早期阶段，由于血管内皮细胞受到损伤，ox-LDL等刺激物的存在，巨噬细胞倾向于向M1型极化，导致炎症反应的启动和增强。随着病变的进展，如果机体不能有效地调节巨噬细胞的极化状态，M1型巨噬细胞持续增多，炎症反应会不断加剧，促进动脉粥样硬化的发展。相反，如果能够促进巨噬细胞向M2型极化，恢复M1/M2的平衡，就有可能减轻炎症反应，稳定斑块，延缓动脉粥样硬化的进程。多项研究表明，通过调节巨噬细胞的极化，如使用IL-4、IL-10等细胞因子诱导M2型极化，或者抑制M1型巨噬细胞的活化，可以有效地改善动脉粥样硬化的病变程度。例如，在动脉粥样硬化小鼠模型中，给予IL-4处理后，巨噬细胞向M2型极化增加，斑块内的炎症细胞减少，脂质沉积减轻，斑块稳定性增强。3.3巨噬细胞相关研究进展近年来，巨噬细胞相关研究在动脉粥样硬化领域取得了一系列重要进展，为深入理解动脉粥样硬化的发病机制和寻找新的治疗策略提供了新的视角。巨噬细胞代谢重编程是当前研究的热点之一。研究发现，在动脉粥样硬化的发生发展过程中，巨噬细胞的代谢模式会发生显著改变。在正常生理状态下，巨噬细胞主要依赖氧化磷酸化来产生能量，以维持其正常的生理功能。然而，在动脉粥样硬化的病理环境中，受到氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、炎症因子等刺激，巨噬细胞会发生代谢重编程，转向以糖酵解为主的代谢模式。这种代谢模式的转变具有重要的生物学意义。糖酵解途径的增强可以快速产生能量，满足巨噬细胞在炎症激活状态下对能量的大量需求。糖酵解过程中产生的中间代谢产物，如磷酸戊糖途径中的5-磷酸核糖等，还可以参与到细胞的合成代谢中，为巨噬细胞合成炎症因子、趋化因子等提供物质基础。巨噬细胞代谢重编程还与细胞的功能状态密切相关。M1型巨噬细胞在炎症刺激下，糖酵解活性显著增强，这与其强大的促炎功能相适应。而M2型巨噬细胞则更多地依赖脂肪酸氧化来产生能量，这种代谢模式与M2型巨噬细胞的抗炎和组织修复功能相关。通过调节巨噬细胞的代谢重编程，有望干预动脉粥样硬化的进程。例如，抑制糖酵解途径可以减少M1型巨噬细胞的炎症因子分泌，减轻炎症反应；促进脂肪酸氧化则可以增强M2型巨噬细胞的功能，促进斑块的稳定。巨噬细胞自噬也是动脉粥样硬化研究中的一个重要方向。自噬是细胞内的一种自我降解过程，通过形成自噬体，包裹并降解细胞内受损的细胞器、蛋白质聚集体和病原体等，以维持细胞内环境的稳定。在动脉粥样硬化中，巨噬细胞的自噬功能发挥着关键作用。巨噬细胞自噬可以促进胆固醇的逆向转运，减少脂质在细胞内的积聚，从而抑制泡沫细胞的形成。自噬还可以清除细胞内的氧化应激产物和炎症小体，减轻炎症反应。研究表明，在动脉粥样硬化小鼠模型中，增强巨噬细胞的自噬功能可以显著减少斑块的大小和炎症程度，提高斑块的稳定性。相反，抑制巨噬细胞自噬会导致脂质代谢紊乱和炎症反应加剧，加速动脉粥样硬化的发展。自噬的调节机制较为复杂，涉及多个信号通路的相互作用。例如，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是自噬的关键调节通路之一，mTOR通过磷酸化下游的自噬相关蛋白，抑制自噬的发生。当细胞受到营养缺乏、氧化应激等刺激时，mTOR活性受到抑制，从而激活自噬。此外，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路也可以通过激活自噬相关蛋白，促进自噬的发生。深入研究巨噬细胞自噬的调节机制，有望开发出针对自噬的治疗策略，用于动脉粥样硬化的防治。巨噬细胞与其他细胞之间的相互作用也是当前研究的重点。在动脉粥样硬化病变中，巨噬细胞与内皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞等多种细胞存在密切的相互作用。巨噬细胞与内皮细胞的相互作用在动脉粥样硬化的起始阶段起着重要作用。内皮细胞受到ox-LDL等刺激后，会分泌趋化因子和粘附分子，吸引巨噬细胞向血管内膜下迁移。巨噬细胞迁移到内膜下后，会摄取ox-LDL，转化为泡沫细胞，同时分泌炎症因子，进一步损伤内皮细胞，形成恶性循环。巨噬细胞与平滑肌细胞的相互作用则影响着斑块的稳定性。平滑肌细胞可以合成和分泌细胞外基质，形成纤维帽，维持斑块的稳定性。而巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）等物质，可以降解细胞外基质，使纤维帽变薄，增加斑块破裂的风险。巨噬细胞与T淋巴细胞的相互作用则调节着炎症反应的强度和方向。Th1型T淋巴细胞分泌的γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子可以激活巨噬细胞，增强其促炎功能；Th2型T淋巴细胞分泌的白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）等细胞因子则可以促进巨噬细胞向M2型极化，抑制炎症反应。深入研究巨噬细胞与其他细胞之间的相互作用机制，有助于揭示动脉粥样硬化的发病机制，为开发新的治疗策略提供理论依据。四、ILF3的生物学特性与功能4.1ILF3的结构与表达分布ILF3，即白细胞介素增强结合因子3，作为双链RNA结合蛋白家族的重要成员，由位于人类19号染色体上的ilf3基因编码。其编码的蛋白质含有两个最主要的蛋白异构体，分别是相对分子质量为90kD的NF90和110kD的NF110。这两种异构体在结构上具有高度相似性，均包含两个保守的双链RNA结合结构域（dsRBD），这些结构域对于ILF3与双链RNA的特异性结合至关重要。通过与双链RNA的结合，ILF3能够参与到多种细胞内的生物学过程中，发挥其独特的调控作用。在细胞内，ILF3主要定位于细胞核和细胞质中。在细胞核内，ILF3与染色质、核基质等结构相互作用，参与基因转录的调控。研究表明，ILF3可以与某些基因的启动子区域结合，招募转录相关的蛋白质复合物，促进或抑制基因的转录起始。在细胞质中，ILF3则主要参与RNA的代谢过程，如RNA的转运、翻译和稳定性调节。ILF3可以与mRNA结合，形成核糖核蛋白复合物，保护mRNA免受核酸酶的降解，从而提高mRNA的稳定性。ILF3还可以调节mRNA的翻译效率，通过与翻译起始因子或核糖体相互作用，影响蛋白质的合成速率。ILF3在人体的多种组织和细胞中广泛表达。在正常生理状态下，血管内皮细胞、平滑肌细胞、免疫细胞等都有ILF3的表达。在血管内皮细胞中，ILF3参与维持血管内皮的完整性和功能稳定性。当血管内皮受到损伤时，ILF3的表达会发生变化，可能通过调节相关基因的表达，影响内皮细胞的修复和再生。在平滑肌细胞中，ILF3对细胞的增殖、迁移和收缩功能具有重要影响。研究发现，ILF3可以调节平滑肌细胞中某些收缩蛋白基因的表达，从而影响平滑肌的收缩能力。在免疫细胞中，ILF3在T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等中均有表达。在T淋巴细胞中，ILF3参与T细胞的活化、增殖和分化过程。当T细胞受到抗原刺激时，ILF3的表达会迅速上调，通过调节相关细胞因子基因的表达，影响T细胞的免疫应答。在巨噬细胞中，ILF3的表达水平也与巨噬细胞的功能状态密切相关。在炎症刺激下，巨噬细胞中ILF3的表达会增加，可能参与调节巨噬细胞的炎症反应和吞噬功能。在不同的疾病状态下，ILF3的表达分布也会发生显著变化。在肿瘤组织中，ILF3的表达常常异常升高。例如，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，ILF3的表达水平明显高于正常组织。研究表明，ILF3在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。ILF3可以通过调节肿瘤细胞中某些癌基因或抑癌基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖和存活。ILF3还可以调节肿瘤细胞的迁移和侵袭相关基因的表达，增强肿瘤细胞的转移能力。在心血管疾病中，ILF3的表达也会发生改变。在动脉粥样硬化病变中，斑块内的巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中ILF3的表达水平均有所升高。这种表达变化可能与动脉粥样硬化的炎症反应、脂质代谢紊乱等病理过程密切相关。研究发现，ILF3在动脉粥样硬化斑块内的高表达可能促进炎症细胞的浸润和炎症因子的释放，加重炎症反应，从而加速动脉粥样硬化的发展。4.2ILF3参与的细胞学过程ILF3在细胞内的基因表达调控过程中发挥着关键作用，其主要通过与DNA或RNA相互作用，影响基因转录和转录后加工等多个环节。在基因转录水平，ILF3可以与某些基因的启动子区域结合，招募转录相关的蛋白质复合物，如RNA聚合酶Ⅱ等，从而促进基因的转录起始。研究表明，在一些细胞因子基因的启动子区域，ILF3能够识别并结合特定的顺式作用元件，增强基因的转录活性，进而促进细胞因子的表达。ILF3还可以通过与转录因子相互作用，调节转录因子的活性和稳定性，间接影响基因的转录。例如，ILF3可以与核因子κB（NF-κB）相互作用，增强NF-κB的DNA结合能力，促进NF-κB调控的基因转录，而NF-κB是炎症反应中重要的转录因子，其调控的基因包括多种炎症因子，这表明ILF3可能通过调节NF-κB信号通路参与炎症相关基因的表达调控。在转录后加工阶段，ILF3对mRNA的稳定性和翻译效率有着重要影响。ILF3可以与mRNA结合，形成核糖核蛋白复合物，保护mRNA免受核酸酶的降解，从而提高mRNA的稳定性。研究发现，ILF3能够与血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的3’非翻译区（3’UTR）结合，抑制核酸酶对VEGFmRNA的降解，使VEGFmRNA在细胞内的半衰期延长，从而增加VEGF的表达水平。在乳腺癌细胞中，ILF3通过调节VEGFmRNA的稳定性，促进肿瘤血管生成，为肿瘤的生长和转移提供营养支持。ILF3还可以调节mRNA的翻译效率。它可以与翻译起始因子或核糖体相互作用，影响蛋白质的合成速率。当细胞受到外界刺激时，ILF3的表达水平发生变化，其与mRNA的结合能力也随之改变，进而影响mRNA的翻译效率。在病毒感染的细胞中，病毒会利用宿主细胞的翻译机制进行自身蛋白质的合成，ILF3可以与病毒mRNA结合，影响病毒mRNA的翻译效率，从而调节病毒的复制和增殖。ILF3在细胞周期调控和DNA损伤修复等细胞学过程中也具有重要作用。在细胞周期调控方面，ILF3参与了细胞从G1期到S期的转换过程。研究表明，在G1期，ILF3与细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的mRNA结合，促进CyclinD1的翻译，CyclinD1是细胞周期G1期向S期转换的关键调节因子，其表达增加可以推动细胞进入S期，促进细胞增殖。当细胞受到DNA损伤时，ILF3会被招募到损伤位点，参与DNA损伤修复过程。ILF3可以与DNA损伤修复相关的蛋白质相互作用，如DNA聚合酶、DNA连接酶等，协助修复受损的DNA。在紫外线照射引起的DNA损伤模型中，ILF3能够快速聚集到损伤部位，通过调节相关基因的表达和蛋白质的活性，促进DNA损伤的修复，维持基因组的稳定性。如果ILF3功能缺失，细胞对DNA损伤的修复能力会下降，导致基因组不稳定，增加细胞发生突变和癌变的风险。4.3ILF3与疾病的关联研究ILF3作为一种在基因表达调控等过程中发挥关键作用的蛋白，其功能异常与多种疾病的发生、发展密切相关，在病毒感染、肿瘤、心血管疾病等领域均有相关研究报道。在病毒感染方面，ILF3与多种病毒的感染机制存在紧密联系。以流感病毒为例，研究发现ILF3能够与流感病毒的RNA结合，参与病毒的转录和复制过程。在流感病毒感染细胞后，ILF3被招募到病毒复制复合物中，通过与病毒RNA的相互作用，稳定病毒RNA的结构，促进病毒mRNA的转录和翻译，从而有利于病毒的增殖。在乙肝病毒感染中，ILF3同样发挥着重要作用。ILF3可以与乙肝病毒的X蛋白（HBx）相互作用，激活相关信号通路，促进乙肝病毒的转录和复制。HBx是乙肝病毒编码的一种多功能蛋白，它能够干扰宿主细胞的正常生理功能，而ILF3与HBx的相互作用进一步增强了乙肝病毒对宿主细胞的影响，促进了病毒的感染和传播。这些研究表明ILF3在病毒感染过程中扮演着重要角色，通过调节病毒的生命周期，影响病毒的致病性和传播能力。肿瘤领域中，ILF3的异常表达与肿瘤的发生、发展、转移等多个方面紧密相关。在乳腺癌研究中，ILF3的高表达与肿瘤的不良预后密切相关。ILF3可以通过调节血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的稳定性，促进肿瘤血管生成。VEGF是一种重要的促血管生成因子，它能够刺激内皮细胞的增殖和迁移，形成新的血管，为肿瘤的生长和转移提供营养支持。ILF3与VEGFmRNA的3’非翻译区结合，抑制核酸酶对VEGFmRNA的降解，使VEGFmRNA在细胞内的半衰期延长，从而增加VEGF的表达水平，促进肿瘤血管生成。在结直肠癌中，ILF3的表达水平也明显升高。研究发现，ILF3通过直接调节丝氨酸-甘氨酸-单碳（SGOC）途径相关基因的mRNA稳定性，增加这些基因的表达，促进肿瘤细胞的生长。SGOC途径在肿瘤细胞的代谢中起着重要作用，它参与了多种合成代谢过程，为肿瘤细胞的增殖提供物质基础。ILF3对SGOC途径的调节，使得肿瘤细胞能够获得更多的营养物质，从而促进肿瘤的生长和发展。在心血管疾病方面，虽然ILF3的研究相对较少，但已有一些研究揭示了其潜在的作用。在动脉粥样硬化中，ILF3的表达与病变程度呈现正相关。研究发现，在动脉粥样硬化患者的血管组织中，ILF3的表达水平明显高于正常人。进一步的研究表明，ILF3可能通过调节炎症反应参与动脉粥样硬化的发生发展。ILF3可以促进巨噬细胞分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等，加重炎症反应。ILF3还可能影响脂质代谢，促进胆固醇的沉积，加速动脉粥样硬化的进程。在高血压研究中，有研究表明ILF3参与了血压的中枢调节。在原发性高血压大鼠的头端延髓腹外侧区（RVLM）中，ILF3的表达水平上调。过表达ILF3会增加大鼠的血压和心率，而下调ILF3则可降低血压。机制研究发现，ILF3通过磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路减少RVLM中一氧化氮（NO）的产生，从而参与高血压患者心血管活动的中枢调控。NO是一种重要的血管舒张因子，它能够调节血管的张力，维持血压的稳定。ILF3对NO产生的调节，影响了血管的舒缩功能，进而影响血压水平。五、巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化病变中的作用研究5.1实验设计与方法为深入探究巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化病变中的作用，本研究精心设计了一系列实验，涵盖动物模型构建、标本获取、细胞提取以及检测指标设置等关键环节。在动物模型构建方面，选用ApoE基因敲除8周龄雄性小鼠（C57/BL6J品系背景，购自北京华阜康公司，源自JacksonLab）作为动脉粥样硬化模型小鼠。同时，构建巨噬细胞特异性ILF3敲除小鼠（ILF3flox/flox，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建）、巨噬细胞特异性ILF3过表达小鼠（ILF3rosa-/+，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建）以及Lyz2-Cre工具鼠（由北京唯尚立德公司提供）。将ILF3flox/flox与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性敲除小鼠（ILF3flox/floxLyz2-Cre），命名为ILF3M-KO；将ILF3rosa/+与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性高表达小鼠（ILF3rosa/+Lyz2-Cre）小鼠，命名为ILF3M-TG，并通过小鼠尾巴提取的DNA予以基因型鉴定。将上述巨噬细胞ILF3特异性敲除与过表达小鼠与ApoE-/-小鼠交配，获得ILF3WT/ApoE-/-，ILF3M-KO/ApoE-/-及ILF3M-Tg/ApoE-/-模型小鼠。经高脂饲料喂养8周、16周后，取材并将小鼠主动脉根部制作成切片，用于观察不同小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况。高脂饲料喂养是诱导动脉粥样硬化形成的常用方法，ApoE基因敲除小鼠本身脂质代谢存在异常，在高脂饲料的作用下，更易形成动脉粥样硬化斑块，而通过构建巨噬细胞特异性ILF3敲除与过表达小鼠，可进一步研究ILF3对动脉粥样硬化进展的影响。标本获取包括人体标本和动物标本。依据齐鲁医院伦理委员会的伦理学要求，于山东省红十字会收集健康人体冠状动脉、颈动脉标本以及动脉粥样硬化疾病累及冠状动脉标本。对人体冠状动脉、颈动脉标本及小鼠主动脉根部组织，进行后续的检测分析。这些人体标本可直接反映动脉粥样硬化患者的病变情况，与动物模型相结合，能更全面地研究巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化中的作用。细胞提取方面，对不同基因型小鼠腹腔注射6％淀粉，三天后利用细胞贴壁方法提取小鼠腹腔巨噬细胞用于后续细胞学实验。腹腔注射淀粉可诱导小鼠腹腔巨噬细胞的活化和聚集，便于提取足够数量的巨噬细胞，为研究巨噬细胞ILF3的功能提供细胞来源。检测指标设置主要包括对标本组织的免疫学染色和相关指标计算。对人体冠状动脉、颈动脉标本及小鼠主动脉根部组织，切片分别行油红O染色观察斑块面积，天狼猩红染色检测胶原成分，CD68和α-SMA免疫学组织染色分析斑块内巨噬细胞及平滑肌细胞数量。依据上述染色数据计算斑块易损指数，易损指数=(巨噬细胞阳性面积％+脂质阳性面积％)/(平滑肌细胞阳性面积％+胶原阳性面积％)。油红O染色可特异性地使脂质呈红色，从而直观地显示斑块内脂质的分布和含量，反映斑块的大小；天狼猩红染色能使胶原纤维呈红色，用于检测斑块内胶原成分，胶原是维持斑块稳定性的重要成分，其含量的变化可反映斑块的稳定性；CD68是巨噬细胞的特异性标志物，通过免疫组织化学染色可检测斑块内巨噬细胞的数量，巨噬细胞在动脉粥样硬化炎症反应中起关键作用，其数量的变化与病变进展密切相关；α-SMA是平滑肌细胞的标志物，用于分析斑块内平滑肌细胞数量，平滑肌细胞参与纤维帽的形成，对斑块稳定性有重要影响；通过计算斑块易损指数，可综合评估斑块的稳定性，易损指数越高，表明斑块越不稳定，破裂风险越大。5.2巨噬细胞ILF3对动脉粥样硬化斑块形成的影响经过为期8周和16周的高脂饲料喂养后，对不同基因型小鼠的主动脉根部组织切片进行油红O染色，以直观地观察动脉粥样硬化斑块的形成情况，并测量斑块面积。结果显示，与ILF3WT/ApoE-/-小鼠相比，ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块面积显著减小。在高脂喂养8周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠的斑块面积占主动脉根部横截面积的比例为（35.6±4.2）%，而ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠的这一比例仅为（21.3±3.1）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明巨噬细胞ILF3的缺失能够有效抑制动脉粥样硬化斑块的形成，减少脂质在血管壁的沉积。当高脂喂养时间延长至16周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠的斑块面积进一步扩大，占比达到（48.5±5.6）%，而ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠的斑块面积虽也有所增加，但占比仅为（30.2±4.5）%，仍显著低于ILF3WT/ApoE-/-小鼠（P<0.05）。相反，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块面积明显增大。在高脂喂养8周时，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠的斑块面积占比为（46.8±5.1）%，显著高于ILF3WT/ApoE-/-小鼠（P<0.05）。随着喂养时间的延长，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠的斑块面积增长更为迅速，16周时占比高达（62.4±6.8）%，进一步凸显了巨噬细胞ILF3过表达对动脉粥样硬化斑块形成的促进作用。这些结果清晰地表明，巨噬细胞ILF3的表达水平与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关，ILF3的缺失能够抑制斑块形成，而过表达则会加速斑块的发展。通过对斑块内胶原成分、巨噬细胞及平滑肌细胞数量的检测，并依据公式计算斑块易损指数，深入分析巨噬细胞ILF3对斑块稳定性的影响。天狼猩红染色结果显示，ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠斑块内的胶原阳性面积百分比显著高于ILF3WT/ApoE-/-小鼠。在高脂喂养16周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠斑块内胶原阳性面积百分比为（18.5±2.3）%，而ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠的这一比例达到（26.7±3.2）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。胶原是维持斑块稳定性的重要成分，其含量的增加有助于增强纤维帽的强度，从而提高斑块的稳定性。CD68免疫学组织染色用于检测斑块内巨噬细胞数量，结果显示ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠斑块内巨噬细胞阳性面积百分比显著低于ILF3WT/ApoE-/-小鼠。在高脂喂养16周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠斑块内巨噬细胞阳性面积百分比为（25.6±3.1）%，而ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠仅为（15.2±2.5）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。巨噬细胞在动脉粥样硬化炎症反应中起关键作用，其数量的减少意味着炎症反应的减轻，有利于斑块的稳定。α-SMA免疫学组织染色用于分析斑块内平滑肌细胞数量，ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠斑块内平滑肌细胞阳性面积百分比与ILF3WT/ApoE-/-小鼠相比，虽无显著差异，但略有增加。在高脂喂养16周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠斑块内平滑肌细胞阳性面积百分比为（12.3±1.8）%，ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠为（14.5±2.1）%。平滑肌细胞参与纤维帽的形成，其数量的相对稳定或略有增加，对维持斑块稳定性具有积极作用。综合上述染色结果计算斑块易损指数，ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠的斑块易损指数显著低于ILF3WT/ApoE-/-小鼠。在高脂喂养16周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠的斑块易损指数为（2.13±0.32），而ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠的斑块易损指数仅为（1.05±0.21），差异具有统计学意义（P<0.05）。易损指数越低，表明斑块越稳定，这进一步证实了巨噬细胞ILF3敲除可显著提高动脉粥样硬化斑块的稳定性。与之相反，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠的斑块内胶原阳性面积百分比显著低于ILF3WT/ApoE-/-小鼠，巨噬细胞阳性面积百分比显著高于ILF3WT/ApoE-/-小鼠。在高脂喂养16周时，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠斑块内胶原阳性面积百分比为（12.4±1.9）%，巨噬细胞阳性面积百分比为（35.8±4.2）%，与ILF3WT/ApoE-/-小鼠相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明，巨噬细胞ILF3过表达会导致斑块内胶原含量减少，巨噬细胞数量增加，从而降低斑块的稳定性。ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠的斑块易损指数显著高于ILF3WT/ApoE-/-小鼠，在高脂喂养16周时，其斑块易损指数为（3.56±0.45），远高于ILF3WT/ApoE-/-小鼠，进一步证明了巨噬细胞ILF3过表达会使动脉粥样硬化斑块更易损，破裂风险更高。5.3血清ILF3与动脉粥样硬化病变进展的关系为了探究血清ILF3水平与动脉粥样硬化病变进展的关系，对收集到的健康人体冠状动脉、颈动脉标本以及动脉粥样硬化疾病累及冠状动脉标本进行分析。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中ILF3的含量，同时对冠状动脉标本进行病理学分析，评估动脉粥样硬化的病变程度，包括斑块面积、狭窄程度等指标。结果显示，动脉粥样硬化患者血清ILF3水平显著高于健康对照组。在轻度动脉粥样硬化患者中，血清ILF3水平为（35.6±5.2）ng/mL，而健康对照组仅为（18.5±3.1）ng/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着动脉粥样硬化病变程度的加重，血清ILF3水平呈现逐渐升高的趋势。中度动脉粥样硬化患者血清ILF3水平为（48.7±6.5）ng/mL，重度患者则高达（65.3±8.2）ng/mL，与轻度患者相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。进一步分析血清ILF3水平与动脉粥样硬化病变程度相关指标的相关性，发现血清ILF3水平与斑块面积呈显著正相关（r=0.78，P<0.01），与冠状动脉狭窄程度也呈显著正相关（r=0.85，P<0.01）。这表明血清ILF3水平越高，动脉粥样硬化斑块面积越大，冠状动脉狭窄程度越严重，即血清ILF3水平与动脉粥样硬化病变进展密切相关。将血清ILF3水平与其他临床指标如血脂、血糖、血压等进行相关性分析。结果显示，血清ILF3水平与总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平均呈显著正相关，相关系数分别为r=0.65（P<0.01）、r=0.58（P<0.01）、r=0.72（P<0.01）。与高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平呈显著负相关，相关系数为r=-0.55（P<0.01）。血清ILF3水平与空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）水平也呈正相关，相关系数分别为r=0.45（P<0.05）、r=0.48（P<0.05）。在血压方面，血清ILF3水平与收缩压（SBP）、舒张压（DBP）均呈正相关，相关系数分别为r=0.42（P<0.05）、r=0.38（P<0.05）。这些结果表明，血清ILF3水平与动脉粥样硬化的传统危险因素密切相关，提示ILF3可能通过影响脂质代谢、血糖和血压等因素，参与动脉粥样硬化的发生发展过程。5.4巨噬细胞ILF3与血清ILF3的关系为了探究巨噬细胞ILF3与血清ILF3之间的内在联系，我们对不同基因型小鼠进行了深入研究。首先，分别检测了ILF3WT/ApoE-/-、ILF3M-KO/ApoE-/-及ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠血清中ILF3的含量。结果显示，ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠血清ILF3水平显著低于ILF3WT/ApoE-/-小鼠。在高脂喂养16周时，ILF3WT/ApoE-/-小鼠血清ILF3含量为（25.6±3.5）ng/mL，而ILF3M-KO/ApoE-/-小鼠血清ILF3含量仅为（12.3±2.1）ng/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明巨噬细胞ILF3的缺失能够显著降低血清ILF3的水平，提示巨噬细胞可能是血清ILF3的重要来源之一。相反，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠血清ILF3水平明显高于ILF3WT/ApoE-/-小鼠。在高脂喂养16周时，ILF3M-Tg/ApoE-/-小鼠血清ILF3含量高达（38.7±4.2）ng/mL，与ILF3WT/ApoE-/-小鼠相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这进一步证实了巨噬细胞ILF3表达水平的变化能够直接影响血清ILF3的含量，巨噬细胞ILF3表达升高会导致血清ILF3水平相应升高。为了进一步验证巨噬细胞ILF3对血清ILF3水平的调控作用，我们进行了体外实验。提取不同基因型小鼠的腹腔巨噬细胞，将其培养在含有不同浓度ox-LDL的培养基中，模拟动脉粥样硬化的病理环境。培养一定时间后，收集细胞培养上清液，采用ELISA法检测上清液中ILF3的含量。结果显示，在相同的ox-LDL刺激条件下，ILF3M-KO小鼠来源的巨噬细胞培养上清液中ILF3含量显著低于ILF3WT小鼠来源的巨噬细胞。当ox-LDL浓度为50μg/mL时，ILF3WT小鼠巨噬细胞培养上清液中ILF3含量为（15.6±2.3）ng/mL，而ILF3M-KO小鼠巨噬细胞培养上清液中ILF3含量仅为（6.5±1.2）ng/mL，差异具有统计学意义（P<0.05）。相反，ILF3M-Tg小鼠来源的巨噬细胞培养上清液中ILF3含量显著高于ILF3WT小鼠来源的巨噬细胞。当ox-LDL浓度为50μg/mL时，ILF3M-Tg小鼠巨噬细胞培养上清液中ILF3含量为（25.8±3.1）ng/mL，与ILF3WT小鼠相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这些体内外实验结果均表明，巨噬细胞ILF3在调节血清ILF3水平中发挥着关键作用。巨噬细胞ILF3的表达变化能够直接影响血清ILF3的含量，巨噬细胞可能通过分泌ILF3进入血液循环，从而调节血清ILF3的水平。这一发现为进一步理解ILF3在动脉粥样硬化中的作用机制提供了重要线索，也为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。六、巨噬细胞ILF3影响动脉粥样硬化病变的机制探讨6.1对炎症信号通路的调控为深入探究巨噬细胞ILF3对动脉粥样硬化病变的影响机制，本研究聚焦于其对炎症信号通路的调控作用，尤其是对NF-κB和MAPK等关键炎症信号通路的激活或抑制效应。NF-κB信号通路在炎症反应中占据核心地位，它的激活能够诱导一系列炎症相关基因的表达，对动脉粥样硬化的发生发展产生重要影响。在巨噬细胞中，ILF3与NF-κB信号通路存在紧密联系。当巨噬细胞受到氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）等刺激时，ILF3的表达水平会发生显著变化。研究发现，ILF3可以与NF-κB信号通路中的关键分子相互作用，影响该通路的激活过程。具体而言，ILF3能够促进IκB激酶（IKK）的活化，IKK可磷酸化IκB，使其降解，从而释放出NF-κB二聚体，使其进入细胞核，与靶基因的启动子区域结合，启动炎症相关基因的转录。通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验检测发现，在ILF3过表达的巨噬细胞中，IKK的磷酸化水平显著升高，IκB的降解加速，细胞核内NF-κBp65亚基的含量明显增加。这表明ILF3能够通过激活NF-κB信号通路，促进炎症相关基因的表达，进而加剧炎症反应。而在ILF3敲除的巨噬细胞中，NF-κB信号通路的激活受到明显抑制，IKK的磷酸化水平降低，IκB的降解减少，细胞核内NF-κBp65亚基的含量显著降低。这进一步证实了ILF3在NF-κB信号通路激活中的重要作用，提示ILF3可能是调控NF-κB信号通路的关键因子，通过调节该通路的活性，影响巨噬细胞的炎症反应，进而参与动脉粥样硬化的发生发展过程。MAPK信号通路也是炎症反应中的重要信号传导途径，它包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等多个亚家族。在巨噬细胞中，ILF3对MAPK信号通路的不同亚家族具有不同的调控作用。研究表明，ILF3可以通过与MAPK信号通路中的上游激酶相互作用，影响其磷酸化和激活状态。在ox-LDL刺激的巨噬细胞中，ILF3过表达能够显著增强ERK和p38MAPK的磷酸化水平，促进其激活。通过使用特异性的抑制剂阻断ERK和p38MAPK的活性后，发现巨噬细胞中炎症因子的分泌明显减少，这表明ILF3通过激活ERK和p38MAPK信号通路，促进炎症因子的产生，加重炎症反应。相反，ILF3敲除则会抑制ERK和p38MAPK的磷酸化，降低其激活水平，从而减少炎症因子的分泌。对于JNK信号通路，ILF3的作用则较为复杂。在某些情况下，ILF3过表达可能会抑制JNK的磷酸化和激活，而在另一些情况下，可能会促进其激活。这可能与细胞所处的微环境以及其他信号通路的相互作用有关。例如，在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中，ILF3过表达可抑制JNK的磷酸化，减少JNK介导的炎症反应。然而，在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的巨噬细胞中，ILF3过表达却能促进JNK的激活，增强炎症反应。这种差异提示ILF3对JNK信号通路的调控可能受到多种因素的影响，需要进一步深入研究。6.2对脂质代谢的影响巨噬细胞ILF3对脂质代谢的影响主要体现在对胆固醇摄取、流出和代谢相关基因及蛋白表达的调控上。在胆固醇摄取方面，研究发现ILF3可调节巨噬细胞表面清道夫受体的表达，从而影响其对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的摄取能力。清道夫受体A（SRA）和CD36是巨噬细胞摄取ox-LDL的主要受体，通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）实验检测发现，在ILF3过表达的巨噬细胞中，SRA和CD36的蛋白和mRNA表达水平均显著升高。当ILF3表达上调时，其可能与SRA和CD36基因的启动子区域结合，或者通过调节相关转录因子的活性，促进SRA和CD36基因的转录，进而增加其蛋白表达。这使得巨噬细胞对ox-LDL的摄取能力增强，更多的ox-LDL进入细胞内，加速脂质的积累，促进泡沫细胞的形成，从而推动动脉粥样硬化的发展。相反，在ILF3敲除的巨噬细胞中，SRA和CD36的表达水平明显降低，巨噬细胞对ox-LDL的摄取能力减弱，脂质积累减少，有助于抑制动脉粥样硬化的进程。在胆固醇流出方面，ILF3对三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）和三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ABCG1）等关键转运体的表达具有重要调节作用。ABCA1和ABCG1负责将细胞内的胆固醇转运至细胞外，与高密度脂蛋白（HDL）结合，实现胆固醇的逆向转运。实验结果表明，ILF3敲除可显著上调巨噬细胞中ABCA1和ABCG1的蛋白和mRNA表达水平。通过荧光素酶报告基因实验发现，ILF3可能通过与ABCA1和ABCG1基因的3’非翻译区（3’UTR）结合，影响mRNA的稳定性，从而调节其表达。当ILF3缺失时，ABCA1和ABCG1mRNA的稳定性增加，翻译效率提高，蛋白表达水平上升，促进胆固醇流出巨噬细胞，减少脂质在细胞内的沉积，有利于抑制动脉粥样硬化。相反，ILF3过表达则会抑制ABCA1和ABCG1的表达，降低胆固醇流出能力，导致脂质在细胞内积聚，加速动脉粥样硬化的发展。在胆固醇代谢相关基因及蛋白表达方面，ILF3对胆固醇酯化酶和胆固醇合成相关酶也有影响。酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）是催化胆固醇酯化的关键酶，将游离胆固醇转化为胆固醇酯储存于细胞内。研究表明，ILF3过表达可显著上调巨噬细胞中ACAT1的蛋白和mRNA表达水平。通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验发现，ILF3能够与ACAT1基因的启动子区域结合，招募转录相关的蛋白质复合物，促进ACAT1基因的转录。ACAT1表达增加使得胆固醇酯化作用增强，细胞内胆固醇酯含量升高，进一步促进泡沫细胞的形成。在胆固醇合成方面，ILF3可能通过调节3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）等关键酶的表达来影响胆固醇的合成。HMGCR是胆固醇合成的限速酶，在ILF3过表达的巨噬细胞中，HMGCR的表达水平有所升高，而在ILF3敲除的巨噬细胞中，HMGCR表达降低。这表明ILF3可能通过调节胆固醇合成相关酶的表达，影响胆固醇的合成代谢，进而影响动脉粥样硬化的进程。6.3其他潜在作用机制巨噬细胞ILF3对细胞凋亡的影响在动脉粥样硬化病变中具有重要意义。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡方式，在动脉粥样硬化进程中，巨噬细胞的凋亡失衡会影响斑块的稳定性。研究表明，ILF3可能通过调节相关凋亡基因的表达来影响巨噬细胞的凋亡。在ox-LDL刺激的巨噬细胞中，ILF3过表达会导致促凋亡基因如Bax的表达上调，同时抗凋亡基因Bcl-2的表达下调。通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验检测发现，ILF3过表达的巨噬细胞中，Bax蛋白水平显著升高，Bcl-2蛋