检验科液相色谱技术操作手册培训指南

演讲人：日期:检验科液相色谱技术操作手册培训指南目录CATALOGUE01技术原理基础02设备操作准备03样品检测规程04日常维护要点05数据处理规范06安全与质控PART01技术原理基础液相色谱工作原理高效液相色谱基于样品组分在流动相（液体）与固定相（色谱柱填料）之间的分配系数差异实现分离。极性相近的组分在固定相中保留时间更长，从而实现高效分离。流动相与固定相相互作用采用高压输液泵（压力可达40-60MPa）推动流动相通过色谱柱，显著提升传质效率，缩短分析时间并提高分辨率。高压驱动分离过程通过程序控制流动相组成比例变化（如乙腈/水梯度），优化不同极性组分的洗脱顺序，适用于复杂样品的分离分析。梯度洗脱技术高压输液系统包括预柱（保护柱）和分离柱（C18等反相柱），柱温箱维持温度精度±0.5℃，柱效需达到>100,000理论塔板数/米。色谱柱子系统检测器模块紫外检测器（190-800nm波长范围）、二极管阵列检测器（三维光谱采集）、示差折光检测器（糖类分析专用），灵敏度需达0.001AUFS。由二元/四元梯度泵、脱气机组成，精确控制流动相流速（0.1-10mL/min）和混合比例，确保基线稳定性（RSD＜1%）。关键组件功能解析反相色谱（RPLC）采用非极性固定相（如C18）和极性流动相（甲醇/水），适用于80%以上有机化合物的分离，保留规律遵循"相似相溶"原则。离子交换色谱（IEC）使用带电官能团固定相（磺酸基/季铵基），通过pH缓冲液调节离子强度，专用于氨基酸、核苷酸等带电物质分离。尺寸排阻色谱（SEC）以多孔硅胶为填料，按分子流体力学体积进行分离，主要应用于蛋白质分子量测定（分辨率需达±5%）。亲和色谱（AC）通过生物特异性相互作用（如抗原-抗体）实现高选择性分离，纯化效率可达99.9%，用于单克隆抗体纯化等生物制药领域。分离模式分类PART02设备操作准备仪器开机前检查溶剂瓶与废液处理确认流动相溶剂瓶液位充足且无污染，废液瓶容量足够并妥善放置，避免废液溢出导致设备腐蚀或实验室污染。系统压力与泄漏测试启动前需手动检查管路连接处是否紧固，通过低压运行观察压力波动情况，确认无漏液现象。若发现异常需立即停机排查。电源与线路检查确保仪器电源线连接稳固，无破损或老化现象，接地良好以避免静电干扰。检查所有附属设备（如检测器、泵、自动进样器）的供电状态是否正常。流动相配制规范溶剂纯度与过滤要求使用色谱级溶剂配制流动相，避免杂质干扰基线稳定性。所有流动相需经0.45μm或更小孔径滤膜过滤，以去除颗粒物并延长色谱柱寿命。脱气操作流程配制后需进行超声脱气或在线脱气处理，消除溶解氧和气泡，防止泵送过程中产生压力波动或基线噪声。比例精度控制使用高精度移液器或天平配制混合流动相，确保溶剂比例误差小于1%，避免因配比偏差导致保留时间漂移。色谱柱安装流程柱温箱适配与固定将色谱柱两端标识的流动相流向与系统流向一致，垂直安装于柱温箱内并紧固卡扣，避免震动或倾斜导致的峰形展宽。柱压测试与平衡以低流速（如0.2mL/min）逐步升高至方法设定流速，监测压力变化是否平稳，并用初始流动相平衡色谱柱至基线稳定（通常需10-15倍柱体积）。柱前保护柱连接在分析柱前端加装保护柱，拦截颗粒物和强保留物质，延长分析柱使用寿命。安装时需确保保护柱与分析柱接口无死体积。PART03样品检测规程样品前处理步骤根据样品性质选择适当的提取方法（如固相萃取、液液萃取），去除杂质干扰，确保目标分析物纯度满足检测要求。需注意溶剂兼容性及回收率验证。样品提取与纯化精确控制稀释倍数，使用符合标准的溶剂（如甲醇、乙腈）定容至目标浓度范围，避免因浓度过高导致色谱柱过载或检测器信号饱和。样品稀释与定容通过0.22μm微孔滤膜过滤样品，消除颗粒物堵塞风险；必要时进行超声脱气，减少流动相中气泡对泵系统和基线稳定性的影响。过滤与脱气处理自动进样器校准定期执行进样针精度校验（如体积重复性测试），确保进样量误差小于±1%。需避免交叉污染，每次进样后使用强溶剂清洗针座及样品环。进样系统操作标准样品瓶装载规范使用低吸附材质样品瓶（如聚丙烯），装样量不低于瓶容积的80%以防止挥发；瓶盖密封性需通过压力测试，避免溶剂挥发导致浓度偏差。进样程序设置合理设置洗针次数、进样速度及延迟时间，平衡系统压力波动。对于高粘度样品，需延长吸样时间并降低进样速度以保证精度。运行参数设置方法流动相梯度优化根据目标物极性差异设计梯度程序（如乙腈-水比例变化），通过预实验确定最佳洗脱条件，确保峰分离度（R>1.5）并缩短分析周期。色谱柱温度控制依据固定相耐受范围设定柱温（通常30-60℃），温度波动需小于±0.5℃。高温可降低流动相粘度，但需评估目标物热稳定性。检测器参数配置紫外检测器需选择目标物最大吸收波长，避免溶剂截止波长干扰；质谱检测器需优化离子源电压、碰撞能量等参数以提高信噪比。PART04日常维护要点泵系统冲洗流程流动相置换程序使用高纯度溶剂逐步置换原有流动相，避免交叉污染，确保泵系统内部无残留。冲洗时需调节流速梯度，从低到高循环冲洗管路及密封组件。柱塞杆清洁与润滑拆卸柱塞杆后采用异丙醇超声清洗，清除结晶盐类沉积物，安装前涂抹专用硅油润滑剂以降低磨损，延长密封圈使用寿命。在线过滤器维护反向冲洗在线过滤器至废液瓶，防止颗粒物堆积造成压力波动。若压差持续超过阈值，需更换滤芯并执行系统排气操作。紫外检测器波长校准在零流动相条件下记录1小时基线漂移，RMS噪声值应小于0.5μAU，若超标需检查光学窗口污染或光源老化情况。基线噪声测试流通池透光率检测通过标准溶液透光率对比实验评估石英窗口清洁度，透光率下降需进行硝酸浸泡清洗或更换密封组件。采用钬玻璃滤光片进行全波段扫描验证，偏差超过±2nm时需执行光电二极管阵列校准程序，确保吸收峰定位准确性。检测器校准周期常见故障排除表压力异常波动处理排查溶剂过滤头堵塞、单向阀球粘连或比例阀故障，依次执行超声清洗、阀球敲击复位及电磁阀测试程序。峰形畸变诊断流程确认进样针是否弯曲、色谱柱筛板是否堵塞，进行针座校准或反向冲洗色谱柱，严重时更换保护柱芯。检查流动相脱气是否充分、色谱柱是否平衡完全，必要时更换在线脱气膜或执行梯度空白校正。基线漂移解决方案PART05数据处理规范基线校正与噪声评估需对色谱图基线进行平滑处理，消除背景噪声干扰，确保峰形清晰可辨，同时评估系统噪声水平是否符合方法要求。峰识别与分离度判定通过软件自动或手动识别色谱峰，计算相邻峰的分离度（R≥1.5为合格），避免共流出峰导致的定量误差。保留时间一致性检查对比样品与标准品的保留时间偏差（通常控制在±2%内），确认目标峰位置正确，排除溶剂效应或柱效下降的影响。色谱图分析原则明确积分阈值、斜率灵敏度及峰宽参数，采用统一的积分算法（如基线切线法或垂直分割法），避免主观差异导致数据波动。峰积分标准操作积分参数设定对于未完全分离的肩峰，需手动调整积分基线或采用峰谷分割；拖尾峰（不对称因子>1.2）需记录并评估是否影响定量准确性。肩峰与拖尾峰处理由两名操作人员独立积分同一色谱图，差异超过5%时需重新分析，确保数据可重复性。积分结果复核报告生成与审核报告需包含原始色谱图、积分参数、校准曲线及质控样结果，确保所有分析步骤可追溯。对超出线性范围或未检出的样品，需明确标注并附原因分析（如基质干扰或前处理损失）。初级操作员生成报告后，由技术主管复核数据逻辑性，最终由质量负责人签字确认，存档电子与纸质双版本。数据完整性验证异常值标注与说明三级审核流程PART06安全与质控化学试剂安全准则根据化学试剂的危险性（如易燃、腐蚀性、毒性等）进行严格分类，并按照标签要求存放于专用柜中，避免阳光直射或高温环境，确保通风系统正常运行。操作人员必须穿戴实验服、护目镜、耐酸碱手套及防毒面具等防护装备，接触挥发性试剂时需在通风橱内操作，严禁直接皮肤接触或吸入有害气体。针对试剂泄漏、飞溅或火灾等突发情况，需配备专用吸附材料、灭火器及应急喷淋装置，并定期组织演练，确保人员熟悉应急处置流程。试剂分类与存储规范个人防护装备使用应急处理措施质控样测试流程严格按照标准操作规程（SOP）配制质控样，使用经认证的参考物质进行标定，记录环境温湿度及仪器状态，确保质控样浓度与稳定性符合要求。质控样准备与标定平行测试与偏差分析趋势监控与校准每批次样品需插入质控样进行平行测试，通过计算相对标准偏差（RSD）评估精密度，若结果超出预设范围需立即排查仪器、试剂或操作问题。建立质控图跟踪长期数据趋势，定期校准仪器并更新阈值，对异常波动启动纠正预防措施（CAPA），确保检测系统持续稳定。03数据完整性验证02审计追踪功能启用配置色谱工作站审计追踪模块，自动记录