干扰素γ与喜树碱对肺腺癌细胞株SPC-A1中CDA1表达的影响及机制探究

干扰素γ与喜树碱对肺腺癌细胞株SPC-A1中CDA1表达的影响及机制探究一、引言1.1研究背景肺癌是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。肺腺癌作为肺癌的一种常见类型，其发病率在近年来呈现出显著的上升趋势。据统计，在非吸烟人群中，肺腺癌的发生比例相对较高，这使得其发病机制和治疗方法的研究备受关注。肺腺癌具有治疗难度大、易复发以及预后不佳等特点，给患者及其家庭带来了沉重的负担。目前，临床上针对肺腺癌的治疗手段主要包括手术切除、化疗、放疗以及靶向治疗等，但这些治疗方法均存在一定的局限性。例如，手术切除对于早期肺腺癌患者可能具有较好的疗效，但对于中晚期患者，由于肿瘤的扩散和转移，手术往往难以彻底清除癌细胞；化疗药物在杀伤癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，导致患者出现严重的不良反应，且长期使用还容易产生耐药性；放疗则可能会引起放射性肺炎等并发症，影响患者的生活质量。因此，寻找能够有效治疗肺腺癌的新药物和新治疗策略显得尤为重要。近年来，随着对肿瘤生物学研究的不断深入，干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和喜树碱（Camptothecin）作为两种具有潜在抗肿瘤活性的物质，逐渐受到了科研人员的广泛关注。干扰素γ是一种由活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的细胞因子，具有广泛的免疫调节和抗肿瘤作用。它可以通过激活免疫细胞，增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力；还能够调节肿瘤细胞的生长、分化和凋亡，抑制肿瘤血管生成，从而发挥抗肿瘤效应。已有研究表明，干扰素γ在多种肿瘤的治疗中显示出一定的疗效，为肺腺癌的治疗提供了新的思路。喜树碱是从喜树中提取分离得到的一种生物碱，具有独特的抗肿瘤作用机制。它能够特异性地抑制拓扑异构酶I，干扰DNA的复制和转录过程，从而导致肿瘤细胞死亡。喜树碱及其衍生物在临床上已被应用于多种癌症的治疗，且表现出较好的抗肿瘤活性。研究喜树碱对肺腺癌的治疗作用，对于开发新的肺腺癌治疗药物具有重要意义。细胞自身分化抗原1（CDA1）作为一种在细胞增殖和分化过程中发挥重要作用的蛋白质，其表达水平的变化与肿瘤的发生、发展密切相关。在肺腺癌中，CDA1的表达异常可能参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等过程。因此，研究干扰素γ和喜树碱对肺腺癌细胞株SPC-A1中CDA1表达的作用，对于揭示这两种药物的抗肿瘤机制，寻找新的肺腺癌治疗靶点具有重要的科学意义和临床应用价值。1.2研究目的和意义本研究旨在深入探究干扰素γ和喜树碱这两种具有独特作用机制的物质，对肺腺癌细胞株SPC-A1中CDA1表达所产生的具体作用。通过精确检测在不同浓度的干扰素γ和喜树碱处理下，以及处理不同时间后，SPC-A1细胞中CDA1表达水平的动态变化情况，明确这两种药物对CDA1表达的影响规律。进一步深入分析干扰素γ和喜树碱作用后，CDA1表达与细胞周期调控蛋白（如P53、P21、CyclinD1等）表达之间的内在关联，揭示其潜在的作用机制。从临床应用的角度来看，本研究具有重大的意义。肺腺癌作为一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，现有的治疗方法存在诸多局限性，迫切需要寻找新的治疗靶点和有效的治疗药物。明确干扰素γ和喜树碱对肺腺癌细胞中CDA1表达的作用，有助于揭示这两种药物的抗肿瘤作用机制，为肺腺癌的治疗提供全新的思路和理论基础。一方面，如果能够证实干扰素γ和喜树碱通过调节CDA1表达来发挥抗肿瘤作用，那么CDA1有可能成为肺腺癌治疗的新靶点，为开发针对CDA1的靶向治疗药物提供理论依据；另一方面，本研究结果也为干扰素γ和喜树碱在肺腺癌治疗中的临床应用提供了科学指导，有助于优化治疗方案，提高治疗效果，改善患者的预后。从学术研究的角度而言，本研究将丰富肺腺癌发病机制和治疗研究的理论体系，为后续相关研究提供重要的参考和借鉴，推动肺腺癌治疗领域的进一步发展。1.3研究方法和创新点在本研究中，将人肺腺癌细胞株SPC-A1置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO₂的恒温恒湿培养箱中进行常规培养，待细胞生长状态良好且达到足够数量时进行后续实验。将处于对数生长期的SPC-A1细胞以适宜密度接种于96孔板中，分为对照组、不同浓度干扰素γ处理组（如100U/mL、500U/mL、1000U/mL）、不同浓度喜树碱处理组（如1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）以及干扰素γ与喜树碱联合处理组，每组设置多个复孔。分别处理12h、24h及48h，为后续研究提供不同处理条件下的细胞样本。运用四唑盐（MTT）比色法，观察不同浓度喜树碱及干扰素γ处理12h、24h及48h前后细胞增殖变化情况，以此评估药物对细胞增殖的影响。采用Real-timeRT-PCR及Westernblot法，检测分别加入及共同加入干扰素γ及喜树碱干预前后CDA1、P53、P21、CyclinD1的mRNA及蛋白的表达情况，从分子层面深入探究药物对相关基因和蛋白表达的调控作用，并运用统计学方法从蛋白质水平分析其相关性，明确各因素之间的内在联系。本研究的创新点主要体现在以下两个方面。一方面，目前关于干扰素γ和喜树碱对肺腺癌细胞作用的研究，大多集中在单一药物对细胞增殖、凋亡等方面的影响，较少有研究综合分析这两种药物对肺腺癌细胞中CDA1表达的作用，以及CDA1表达与细胞周期调控蛋白表达之间的相关性。本研究将这两个方面结合起来，为深入了解肺腺癌的发病机制和治疗靶点提供了更全面的视角。另一方面，本研究不仅探讨了干扰素γ和喜树碱单独作用时对肺腺癌细胞株SPC-A1中CDA1表达的影响，还研究了它们联合作用时的效果，这对于开发新的肺腺癌联合治疗策略具有重要的指导意义，有助于为临床治疗提供更有效的方案。二、相关理论基础2.1肺腺癌及SPC-A1细胞株肺腺癌是肺癌中较为常见的一种类型，属于非小细胞肺癌。其发病率在全球范围内呈上升趋势，尤其在非吸烟人群、女性以及亚洲人群中更为显著。肺腺癌具有独特的生物学特性和临床特征。在病理形态上，肺腺癌细胞通常呈腺样结构，可伴有乳头、微乳头或实性生长方式。肿瘤细胞的形态多样，细胞核大小不一，染色质丰富，核仁明显。这种复杂的病理特征使得肺腺癌在诊断和治疗上具有一定的挑战性。肺腺癌的早期症状往往不明显，多数患者在体检或因其他疾病进行胸部影像学检查时才被发现。随着病情的进展，患者可能出现咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困难等症状。由于肺腺癌早期症状隐匿，很多患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳的手术治疗时机。肺腺癌的发病机制是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及遗传因素、环境因素以及生活方式等多个方面。遗传因素在肺腺癌的发生中起着重要作用，一些基因突变，如表皮生长因子受体（EGFR）基因突变、间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排等，与肺腺癌的发病密切相关。这些基因突变可以导致细胞信号传导通路的异常激活，促进肿瘤细胞的增殖、存活和转移。环境因素也是肺腺癌发病的重要诱因，长期暴露于吸烟环境、空气污染、职业致癌物（如石棉、氡气等）以及电离辐射等，都可能增加肺腺癌的发病风险。吸烟是肺腺癌最重要的危险因素之一，烟草中的尼古丁、焦油等有害物质可以损伤肺部细胞的DNA，引发基因突变，从而导致肿瘤的发生。此外，生活方式因素，如饮食不均衡、缺乏运动、长期精神压力过大等，也可能影响机体的免疫功能，增加肺腺癌的发病几率。人肺腺癌细胞株SPC-A1是研究肺腺癌的重要体外模型，最初由上海市胸科医院于1980年8月从一名41岁男性右肺下叶原发性支气管腺癌并伴有胸膜广泛转移患者的胸膜转移结节中分离培养建立。该细胞株在肺癌研究领域具有重要的应用价值，为深入了解肺腺癌的生物学特性、发病机制以及治疗方法提供了有力的工具。SPC-A1细胞株具有典型的上皮细胞样形态，呈多形性，细胞边界清晰，贴壁生长。在显微镜下观察，可见细胞呈多边形或梭形，排列紧密，具有较强的增殖能力。SPC-A1细胞的生长速度较快，在适宜的培养条件下，细胞群体的倍增时间约为30小时。这使得研究人员能够在较短的时间内获得大量的细胞用于实验研究。在细胞生物学特性方面，SPC-A1细胞具有较高的侵袭和转移能力，能够模拟肺腺癌在体内的侵袭和转移过程。通过体外实验，如Transwell实验、划痕实验等，可以研究SPC-A1细胞的侵袭和转移机制，为寻找有效的抗转移治疗靶点提供依据。SPC-A1细胞对化疗药物和放疗的敏感性也与临床肺腺癌患者的情况具有一定的相似性，这使得它成为评估化疗药物疗效和放疗敏感性的重要模型。研究人员可以利用SPC-A1细胞株研究不同化疗药物对肺腺癌细胞的杀伤作用，筛选出具有潜在临床应用价值的化疗药物，并探索其作用机制。SPC-A1细胞株在肺腺癌的研究中应用广泛，涵盖了肿瘤生物学特性研究、药物筛选和开发以及治疗靶点探索等多个方面。在肿瘤生物学特性研究方面，通过对SPC-A1细胞的基因表达谱、蛋白质组学以及细胞信号通路等方面的研究，可以深入了解肺腺癌的发生、发展机制。研究人员可以利用基因芯片技术、蛋白质印迹技术等手段，分析SPC-A1细胞中与肿瘤发生、发展相关的基因和蛋白质的表达变化，揭示肺腺癌的分子生物学特征。在药物筛选和开发领域，SPC-A1细胞株被广泛用于评估新型抗肿瘤药物的疗效和安全性。研究人员可以将不同的药物作用于SPC-A1细胞，观察细胞的生长、增殖、凋亡等情况，筛选出对肺腺癌细胞具有显著抑制作用的药物，并进一步研究其作用机制和药代动力学特性。SPC-A1细胞株还可用于研究肺腺癌的治疗靶点，通过对细胞中关键信号通路和分子的研究，寻找潜在的治疗靶点，为开发新的治疗方法提供理论依据。例如，研究人员可以通过RNA干扰技术、基因编辑技术等手段，抑制SPC-A1细胞中某些关键基因的表达，观察细胞的生物学行为变化，从而确定这些基因是否为潜在的治疗靶点。2.2干扰素γ干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）作为一种重要的细胞因子，在机体的免疫调节和抗肿瘤过程中发挥着关键作用。它最初被称为巨噬细胞活化因子，是II型干扰素家族中的唯一成员。从结构上看，干扰素γ蛋白的单体由六个α螺旋构成一个核心，并在C端区延伸展开形成特定的片断序列。而具有生物活性的干扰素γ则是以同源二聚体糖蛋白的形式存在，其活性二聚体由两个反平行且相互锁定的单体组合而成，这种独特的结构赋予了干扰素γ特殊的生物学功能。干扰素γ的产生细胞主要为活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK细胞），此外，NKT细胞在特定条件下也能够产生干扰素γ。当机体受到病原体感染、肿瘤细胞侵袭等外界刺激时，这些免疫细胞会被激活，进而合成并分泌干扰素γ。例如，在病毒感染过程中，病毒抗原会刺激T淋巴细胞和NK细胞，使其迅速启动干扰素γ的表达和分泌机制，以应对病毒感染。在生理作用方面，干扰素γ具有广泛的功能，包括抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。在抗病毒方面，干扰素γ可以通过多种途径发挥作用。它能够诱导病毒感染细胞表达病毒抗原，增强免疫系统对感染细胞的识别和杀伤能力。干扰素γ还可以激活一系列细胞内信号通路，诱导产生一些参与病毒RNA降解和剪切的酶和蛋白质，从而直接抑制病毒的复制过程。研究表明，在乙型肝炎病毒感染的细胞中，干扰素γ能够上调细胞内的一些抗病毒蛋白的表达，如Mx蛋白等，这些蛋白可以特异性地识别并结合病毒核酸，阻止病毒的复制和传播。在免疫调节方面，干扰素γ是巨噬细胞的有力激活剂，它能够增强巨噬细胞的吞噬能力和杀菌活性，使其更好地清除病原体和肿瘤细胞。干扰素γ还可以调节T细胞和B细胞的功能，促进Th1细胞的分化和增殖，抑制Th2细胞的活性，从而调节机体的免疫平衡。在抗肿瘤方面，干扰素γ的作用机制尤为复杂且多样。它可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥直接的抗肿瘤作用。具体来说，干扰素γ能够诱导肿瘤抑制基因IRF1的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平，同时上调促凋亡蛋白Bak的表达，促进细胞色素C从线粒体释放，激活Caspases级联反应，最终导致肿瘤细胞凋亡。干扰素γ还可以通过激活巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）等免疫细胞，增强它们对肿瘤细胞的杀伤能力，发挥间接的抗肿瘤作用。干扰素γ还能够调节肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和细胞因子分泌，抑制肿瘤血管生成，从而限制肿瘤的生长和转移。在肿瘤微环境中，干扰素γ可以促进T细胞、NK细胞等免疫细胞向肿瘤部位的迁移和浸润，增强它们对肿瘤细胞的识别和杀伤能力；它还可以抑制肿瘤细胞分泌一些促血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）等，减少肿瘤血管的生成，切断肿瘤的营养供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。2.3喜树碱喜树碱（Camptothecin）是一种从我国特有的珙桐科植物喜树（CamptothecaacuminataDecne.）的果实或根皮中提取分离得到的五环单萜生物碱，是除紫杉醇之外研究最多的天然抗肿瘤药物之一。喜树是一种高大落叶乔木，常生长于海拔1000米以下的林边或溪边。在传统医学中，喜树的根皮具有清热解毒、散结消肿之功效，果实具有活血化瘀之功效，常被用于治疗牛皮癣、疮肿等症状。1966年，美国国家癌症研究所的Wall等人首次从我国引种的喜树树皮和树干中成功分离得到喜树碱，这一发现开启了对喜树碱的深入研究。随后，在1967-1970年期间，研究者发现喜树碱在体外对Hela细胞（宫颈癌细胞的细胞系）、L1210细胞（小鼠淋巴细胞白血病细胞）及啮齿类动物显示出较强的抗肿瘤活性，这一成果引发了科学界对喜树和喜树碱类化合物的研究热潮。喜树碱的分子式为C_{20}H_{16}N_{2}O_{4}，分子量为348.35，化学名称为10-羟基-喜树碱。从结构上看，它是一种吡咯喹啉细胞毒性生物碱，具有独特的化学结构，这种结构赋予了它特殊的药理活性。喜树碱为淡黄色针状结晶，其物理性质较为特殊，不溶于水，微溶于甲醇、乙醇、氯仿等常见有机溶剂，但可溶于吡啶、二甲基亚砜等。在碱性条件下，喜树碱不稳定，容易发生开环反应。这种特殊的理化性质使得喜树碱在药物研发和应用过程中面临一定的挑战，需要通过特殊的制剂技术或结构修饰来改善其溶解性和稳定性。喜树碱具有广泛的药理作用，其中最为突出的是其抗肿瘤作用。它是一种特异性的拓扑异构酶Ⅰ（TopoisomeraseI，TopoI）抑制剂，其抗肿瘤作用机制主要是通过与拓扑异构酶Ⅰ-DNA复合物紧密结合，形成稳定的三元复合物，从而阻碍DNA的复制和转录过程。在正常的DNA复制和转录过程中，拓扑异构酶Ⅰ能够通过切割和重新连接DNA单链，来缓解DNA复制和转录过程中产生的超螺旋张力，保证DNA的正常代谢。当喜树碱与拓扑异构酶Ⅰ-DNA复合物结合后，会抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性，使DNA单链断裂无法及时修复，在DNA复制过程中，这些断裂的DNA单链会引发双链断裂，最终导致肿瘤细胞无法正常进行DNA复制和细胞分裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明，喜树碱对多种肿瘤细胞，如胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌、白血病等均表现出显著的抑制作用。在肺癌细胞系的研究中，喜树碱能够有效抑制肺癌细胞的生长和增殖，诱导细胞凋亡，并且对肺癌细胞的侵袭和转移能力也有一定的抑制作用。除了抗肿瘤作用外，有研究还表明喜树碱对某些病毒，如单纯疱疹病毒等具有一定的抑制作用，但其抗病毒作用机制尚不完全清楚，有待进一步深入研究。由于其显著的抗肿瘤活性，喜树碱及其衍生物在临床上被广泛应用于肿瘤的治疗。临床上常用的喜树碱衍生物包括10-羟基喜树碱（HCPT）、伊立替康（Irinotecan）和拓扑替康（Topotecan）等。10-羟基喜树碱是我国科学家在20世纪70年代自主研制的抗肿瘤药物，对多种恶性肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、膀胱癌、直肠癌等均有较好的疗效，可通过静脉注射、动脉注射、腔内注射等多种途径给药。伊立替康于1994年被美国食品药品监督管理局（FDA）首次批准，作为结直肠癌一线治疗药物，在临床应用中取得了良好的效果。拓扑替康则于1996年被FDA批准，用于二线治疗小细胞肺癌和卵巢癌。这些喜树碱衍生物在临床应用中，显著提高了肿瘤患者的生存率和生活质量，但同时也伴随着一些不良反应。常见的不良反应主要包括骨髓抑制，表现为白细胞、血小板减少，这会导致患者免疫力下降，容易发生感染等并发症；胃肠道反应，如恶心、呕吐、腹泻等，严重影响患者的营养摄入和生活质量；泌尿系统毒性，可能出现血尿、尿频、尿急等症状；以及脱发、乏力等。为了提高喜树碱的疗效，降低其不良反应，近年来研究人员在喜树碱的结构修饰、新型给药系统开发等方面进行了大量工作。通过结构修饰，改变喜树碱的化学结构，以提高其抗肿瘤活性，降低毒性。研究人员开发出了脂质体、纳米粒等新型载药系统，这些新型载药系统能够提高药物的靶向性，使药物更精准地作用于肿瘤细胞，减少药物在正常组织中的分布，从而降低毒性。2.4CDA1的研究进展细胞自身分化抗原1（CDA1），又称CD1A，是一种在细胞表面表达的蛋白质，属于CD1家族成员。CD1分子是不同于主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子与MHC-Ⅱ类分子的第三类抗原递呈分子，主要在抗原递呈细胞（APC）表面表达，在脂质和糖脂抗原的递呈中发挥着关键作用。CD1分子的抗原结合沟含有3个特异性片段，并可区分T细胞和NKT细胞群。以氨基酸序列的相似性为基础，CD1蛋白被分为三组，CDA1属于第一组，该组还包括CD1b和CD1c。第一组CD1分子可以将脂质抗原递呈给αβT细胞群和γδT细胞群，在未成熟树突状细胞表面表达。CDA1的主要功能是参与免疫系统对脂质和糖脂类抗原的识别与递呈过程。在皮肤的免疫防御中，CDA1起着重要作用，它主要在皮肤中的Langerhans细胞和某些白细胞中表达。当机体受到病原体感染时，Langerhans细胞摄取病原体的脂质或糖脂抗原，CDA1蛋白通过其C1-set结构域与这些抗原结合，然后将抗原-CDA1复合物提呈给特定的T细胞受体，激活T细胞的免疫应答反应，从而启动机体的免疫防御机制。CDA1还在维持免疫耐受和自身免疫反应的平衡中发挥着重要作用，通过递呈自身和外来抗原，调节免疫系统对自身组织和外来病原体的识别，防止免疫系统错误地攻击自身组织，引发自身免疫性疾病。在细胞周期调控方面，CDA1也发挥着重要作用。研究表明，CDA1的表达水平与细胞周期进程密切相关。在细胞周期的不同阶段，CDA1的表达呈现出动态变化。在G1期，CDA1的表达水平相对较低，随着细胞进入S期，CDA1的表达逐渐增加，在S期和G2期达到较高水平，而在M期，CDA1的表达又有所下降。这种表达变化模式提示CDA1可能参与了细胞周期的调控过程。具体来说，CDA1可能通过与细胞周期调控蛋白相互作用，影响细胞周期的进程。有研究发现，CDA1能够与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白（Cyclin）等细胞周期调控蛋白结合，调节它们的活性，从而影响细胞从一个周期阶段进入下一个阶段。在G1-S期转换过程中，CDA1可能通过抑制CDK-Cyclin复合物的活性，阻止细胞过早进入S期，确保细胞在进入DNA合成阶段之前完成必要的准备工作。在S期，CDA1可能参与了DNA复制的调控，维持DNA复制的准确性和稳定性。在G2-M期转换时，CDA1可能对细胞周期的调控起到促进作用，促使细胞顺利进入有丝分裂阶段。这些研究结果表明，CDA1在细胞周期调控中具有重要的调节作用，其表达异常可能导致细胞周期紊乱，进而影响细胞的正常生长和增殖。大量研究表明，CDA1与肿瘤的发生发展密切相关。在多种肿瘤组织中，CDA1的表达水平发生了显著变化。在某些类型的皮肤癌中，CDA1显示出异常表达，这提示它在肿瘤免疫逃逸机制中可能起到一定作用。在肺癌研究中，有研究提出CDA1可能介导肿瘤源性的脂质和糖脂抗原向肿瘤特异性的T细胞递呈，从而促进这些溶细胞性细胞的抗瘤免疫反应的进行。当肺腺癌细胞产生肿瘤源性的脂质和糖脂抗原时，CDA1能够识别并结合这些抗原，将其递呈给肿瘤特异性的T细胞，激活T细胞的杀伤活性，对肺腺癌细胞进行攻击，从而抑制肿瘤的生长和发展。然而，在一些情况下，肿瘤细胞可能会通过某些机制下调CDA1的表达，导致肿瘤源性抗原无法有效递呈给T细胞，使得肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统的监视和攻击，从而促进肿瘤的发生发展。也有研究发现，CDA1可能通过调控细胞周期相关蛋白的表达，影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。在肺腺癌细胞中，CDA1的低表达可能导致细胞周期调控失衡，使得肿瘤细胞能够持续增殖，抑制细胞凋亡，进而促进肿瘤的发展。三、干扰素γ对SPC-A1细胞中CDA1表达的作用研究3.1实验设计在进行干扰素γ对SPC-A1细胞中CDA1表达作用的研究时，首先需进行细胞培养。从液氮罐中取出冻存的人肺腺癌细胞株SPC-A1，迅速放入37℃恒温水浴锅中快速解冻，待细胞完全解冻后，将其转移至含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，再加入适量新鲜培养基重悬细胞，将细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的恒温恒湿培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，待细胞变圆脱落后，加入适量培养基终止消化，吹打均匀后，按照1:3或1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中继续培养，如此反复传代，以获得足够数量且生长状态良好的细胞用于后续实验。待细胞生长状态良好且达到足够数量后，进行分组与药物处理。将处于对数生长期的SPC-A1细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基制成单细胞悬液，以每孔5×10^3个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，将96孔板中的细胞分为对照组和不同浓度干扰素γ处理组。对照组加入等体积的不含干扰素γ的培养基，不同浓度干扰素γ处理组分别加入终浓度为100U/mL、500U/mL、1000U/mL的干扰素γ，每个浓度设置6个复孔。将96孔板轻轻摇匀后，继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中分别培养12h、24h及48h。在培养结束后，需要检测CDA1表达。采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR）法检测CDA1的mRNA表达水平。从培养箱中取出96孔板，吸弃孔内培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除残留的培养基和杂质。向每孔加入100μLTRIzol试剂，充分裂解细胞，将裂解液转移至无RNA酶的离心管中，按照TRIzol试剂说明书的步骤提取总RNA。使用核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度和纯度，确保RNA的质量符合实验要求。取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书的操作步骤，将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用CDA1特异性引物和内参基因（如GAPDH）引物进行Real-timeRT-PCR扩增。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，以及8μLddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环的95℃变性5秒、60℃退火30秒，最后进行熔解曲线分析，以确保扩增产物的特异性。根据扩增曲线和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算CDA1mRNA的相对表达量。采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测CDA1的蛋白表达水平。从培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，然后向培养瓶中加入适量的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟。将裂解后的细胞液转移至离心管中，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为细胞总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，根据测定结果将蛋白浓度调整至一致。取适量的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1小时，以防止非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜与一抗（兔抗人CDA1多克隆抗体，1:1000稀释）在4℃孵育过夜。次日，将PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，然后与二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀释）室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，最后加入化学发光底物，在化学发光成像仪上曝光显影，通过分析条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算CDA1蛋白的相对表达量。3.2实验结果采用四唑盐（MTT）比色法观察不同浓度干扰素γ处理12h、24h及48h前后SPC-A1细胞增殖变化情况。结果显示，随着干扰素γ浓度的增加和处理时间的延长，SPC-A1细胞的增殖受到明显抑制，呈现出剂量和时间依赖性。与对照组相比，100U/mL干扰素γ处理12h后，细胞增殖抑制率为(15.26±3.58)\%；处理24h后，抑制率上升至(28.54±4.26)\%；处理48h后，抑制率达到(42.37±5.12)\%。500U/mL干扰素γ处理12h后，细胞增殖抑制率为(25.63±4.15)\%；处理24h后，抑制率为(40.28±4.87)\%；处理48h后，抑制率为(55.46±6.23)\%。1000U/mL干扰素γ处理12h后，细胞增殖抑制率为(35.48±4.72)\%；处理24h后，抑制率为(52.36±5.54)\%；处理48h后，抑制率为(68.79±7.05)\%。不同浓度组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且高浓度组（1000U/mL）在相同时间点的抑制率显著高于低浓度组（100U/mL和500U/mL）（P＜0.05）。通过Real-timeRT-PCR及Westernblot法检测不同浓度干扰素γ处理12h、24h及48h后CDA1的mRNA及蛋白表达情况。Real-timeRT-PCR结果表明，与对照组相比，100U/mL干扰素γ处理1h后，CDA1mRNA表达水平开始升高，其相对表达量为对照组的(1.56±0.18)倍；处理24h后，CDA1mRNA相对表达量进一步增加，为对照组的(2.89±0.32)倍；处理48h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(4.25±0.45)倍。500U/mL干扰素γ处理1h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(2.05±0.23)倍；处理24h后，为对照组的(3.67±0.38)倍；处理48h后，为对照组的(5.12±0.55)倍。1000U/mL干扰素γ处理1h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(2.58±0.28)倍；处理24h后，为对照组的(4.56±0.46)倍；处理48h后，为对照组的(6.34±0.68)倍。不同浓度组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着干扰素γ浓度的增加和处理时间的延长，CDA1mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。Westernblot检测结果与Real-timeRT-PCR结果一致，100U/mL干扰素γ处理1h后，CDA1蛋白表达水平开始升高，其相对表达量为对照组的(1.48±0.15)倍；处理24h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(2.76±0.29)倍；处理48h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(4.03±0.42)倍。500U/mL干扰素γ处理1h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(1.96±0.21)倍；处理24h后，为对照组的(3.48±0.36)倍；处理48h后，为对照组的(4.98±0.52)倍。1000U/mL干扰素γ处理1h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(2.45±0.26)倍；处理24h后，为对照组的(4.35±0.44)倍；处理48h后，为对照组的(6.12±0.65)倍。不同浓度组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着干扰素γ浓度的增加和处理时间的延长，CDA1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。进一步分析干扰素γ作用后CDA1表达与P53、P21、CyclinD1表达的相关性。在蛋白质水平上，通过计算Pearson相关系数来分析它们之间的相关性。结果显示，CDA1与P53蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.853（P＜0.01），这表明随着CDA1蛋白表达水平的升高，P53蛋白表达水平也相应升高；CDA1与P21蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.797（P＜0.01），即CDA1蛋白表达的增加与P21蛋白表达的增加存在显著的正相关关系；CDA1与CyclinD1蛋白的表达呈负相关，相关系数r=-0.939（P＜0.01），说明CDA1蛋白表达水平升高时，CyclinD1蛋白表达水平显著降低。3.3结果分析与讨论从实验结果可知，干扰素γ对SPC-A1细胞的增殖具有显著的抑制作用，且这种抑制作用呈现出明显的剂量和时间依赖性。随着干扰素γ浓度的增加和处理时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。这与以往的研究报道一致，干扰素γ通过多种途径发挥其抗肿瘤作用，其中抑制肿瘤细胞增殖是其重要的作用机制之一。干扰素γ可以激活一系列细胞内信号通路，诱导细胞周期阻滞，使细胞停滞在G1期或G2/M期，从而抑制细胞的增殖。干扰素γ还可以上调一些细胞周期抑制蛋白的表达，如P21、P57等，这些蛋白可以与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合，抑制CDK的活性，进而阻止细胞周期的进程。在本研究中，随着干扰素γ浓度的增加和处理时间的延长，细胞增殖受到的抑制作用逐渐增强，这表明干扰素γ在肺腺癌治疗中具有潜在的应用价值，为进一步研究其临床应用提供了实验依据。在CDA1表达方面，干扰素γ能够显著上调SPC-A1细胞中CDA1的mRNA和蛋白表达水平，且同样表现出浓度和时间依赖性。这一结果提示，干扰素γ可能通过调节CDA1的表达来发挥其抗肿瘤作用。结合CDA1的功能，其在免疫系统中参与脂质和糖脂抗原的递呈，在肿瘤免疫中具有重要意义。在肺腺癌细胞中，干扰素γ上调CDA1表达，可能增强了肿瘤细胞表面抗原的递呈能力，使得肿瘤细胞更容易被免疫系统识别和攻击。当CDA1表达上调时，它能够更有效地将肿瘤源性的脂质和糖脂抗原递呈给肿瘤特异性的T细胞，激活T细胞的杀伤活性，从而增强机体对肺腺癌细胞的免疫监视和杀伤能力。这一发现为肺腺癌的免疫治疗提供了新的靶点和思路，通过调节CDA1的表达，有望增强机体的抗肿瘤免疫反应，提高肺腺癌的治疗效果。关于CDA1与P53、P21、CyclinD1表达的相关性分析具有重要意义。在细胞周期调控中，P53是一种重要的肿瘤抑制基因，当细胞受到DNA损伤或其他应激信号时，P53蛋白会被激活，通过调控下游基因的表达，使细胞周期停滞在G1期，以便细胞有足够的时间修复损伤的DNA，若DNA损伤无法修复，则诱导细胞凋亡。P21是P53的下游靶基因，P53可以结合到P21基因的启动子区域，促进P21的表达，P21通过与CDK-Cyclin复合物结合，抑制其活性，从而阻止细胞从G1期进入S期。CyclinD1则在细胞周期的G1-S期转换中发挥关键作用，它与CDK4/6结合形成复合物，激活CDK4/6的激酶活性，促进细胞从G1期进入S期。本研究中，CDA1与P53、P21蛋白表达呈正相关，与CyclinD1蛋白表达呈负相关。这表明CDA1可能通过调控P53、P21和CyclinD1的表达，参与细胞周期的调控过程。当CDA1表达上调时，可能通过某种机制激活P53信号通路，使P53蛋白表达增加，进而促进P21的表达，同时抑制CyclinD1的表达，最终导致细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞的增殖。这一结果为深入理解干扰素γ的抗肿瘤机制提供了重要线索，也为进一步研究CDA1在肺腺癌发生发展中的作用奠定了基础。从整体上看，干扰素γ通过抑制SPC-A1细胞增殖，上调CDA1表达，并调节细胞周期相关蛋白P53、P21和CyclinD1的表达，发挥其抗肿瘤作用。这些发现为肺腺癌的治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点。在未来的研究中，可以进一步深入探讨干扰素γ调节CDA1表达的具体分子机制，以及CDA1与其他细胞周期调控蛋白之间的相互作用网络，为开发更加有效的肺腺癌治疗策略提供支持。还可以考虑将干扰素γ与其他抗肿瘤药物联合使用，探索联合治疗方案的效果和作用机制，以提高肺腺癌的治疗效果，改善患者的预后。四、喜树碱对SPC-A1细胞中CDA1表达的作用研究4.1实验设计在进行喜树碱对SPC-A1细胞中CDA1表达作用的研究时，同样先进行细胞培养。从液氮罐中迅速取出冻存的人肺腺癌细胞株SPC-A1，将其放置于37℃恒温水浴锅中快速解冻。待细胞完全解冻后，把细胞转移至含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基的离心管里，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，接着加入适量新鲜培养基重悬细胞，将细胞接种于细胞培养瓶中，放在37℃、5%CO₂的恒温恒湿培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，待细胞变圆脱落后，加入适量培养基终止消化，吹打均匀后，按照1:3或1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中继续培养，如此反复传代，以获取足够数量且生长状态良好的细胞用于后续实验。细胞生长状态良好且数量足够后，进行分组与药物处理。把处于对数生长期的SPC-A1细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基制成单细胞悬液，以每孔5×10^3个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，放置在培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，将96孔板中的细胞分为对照组和不同浓度喜树碱处理组。对照组加入等体积的不含喜树碱的培养基，不同浓度喜树碱处理组分别加入终浓度为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的喜树碱，每个浓度设置6个复孔。将96孔板轻轻摇匀后，继续放在37℃、5%CO₂的培养箱中分别培养12h、24h及48h。培养结束后，检测CDA1表达。运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR）法检测CDA1的mRNA表达水平。从培养箱中取出96孔板，吸弃孔内培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除残留的培养基和杂质。向每孔加入100μLTRIzol试剂，充分裂解细胞，将裂解液转移至无RNA酶的离心管中，按照TRIzol试剂说明书的步骤提取总RNA。使用核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度和纯度，确保RNA的质量符合实验要求。取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书的操作步骤，将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用CDA1特异性引物和内参基因（如GAPDH）引物进行Real-timeRT-PCR扩增。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，以及8μLddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒，然后进行40个循环的95℃变性5秒、60℃退火30秒，最后进行熔解曲线分析，以确保扩增产物的特异性。根据扩增曲线和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算CDA1mRNA的相对表达量。使用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测CDA1的蛋白表达水平。从培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，然后向培养瓶中加入适量的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟。将裂解后的细胞液转移至离心管中，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为细胞总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，根据测定结果将蛋白浓度调整至一致。取适量的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1小时，以防止非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜与一抗（兔抗人CDA1多克隆抗体，1:1000稀释）在4℃孵育过夜。次日，将PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，然后与二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀释）室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，最后加入化学发光底物，在化学发光成像仪上曝光显影，通过分析条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算CDA1蛋白的相对表达量。4.2实验结果采用四唑盐（MTT）比色法观察不同浓度喜树碱处理12h、24h及48h前后SPC-A1细胞增殖变化情况。结果显示，随着喜树碱浓度的升高和处理时间的延长，SPC-A1细胞的增殖受到显著抑制，呈现出明显的剂量和时间依赖性。与对照组相比，1μmol/L喜树碱处理12h后，细胞增殖抑制率为(18.35±3.86)\%；处理24h后，抑制率上升至(32.47±4.58)\%；处理48h后，抑制率达到(48.62±5.63)\%。5μmol/L喜树碱处理12h后，细胞增殖抑制率为(28.56±4.32)\%；处理24h后，抑制率为(45.63±5.21)\%；处理48h后，抑制率为(62.78±6.54)\%。10μmol/L喜树碱处理12h后，细胞增殖抑制率为(38.72±4.95)\%；处理24h后，抑制率为(56.89±5.87)\%；处理48h后，抑制率为(75.34±7.89)\%。不同浓度组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且高浓度组（10μmol/L）在相同时间点的抑制率显著高于低浓度组（1μmol/L和5μmol/L）（P＜0.05）。通过Real-timeRT-PCR及Westernblot法检测不同浓度喜树碱处理12h、24h及48h后CDA1的mRNA及蛋白表达情况。Real-timeRT-PCR结果表明，与对照组相比，1μmol/L喜树碱处理12h后，CDA1mRNA表达水平开始升高，其相对表达量为对照组的(1.68±0.21)倍；处理24h后，CDA1mRNA相对表达量进一步增加，为对照组的(3.05±0.35)倍；处理48h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(4.56±0.48)倍。5μmol/L喜树碱处理12h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(2.25±0.28)倍；处理24h后，为对照组的(3.98±0.42)倍；处理48h后，为对照组的(5.89±0.62)倍。10μmol/L喜树碱处理12h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(2.86±0.35)倍；处理24h后，为对照组的(4.87±0.51)倍；处理48h后，为对照组的(7.23±0.75)倍。不同浓度组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着喜树碱浓度的增加和处理时间的延长，CDA1mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。Westernblot检测结果与Real-timeRT-PCR结果一致，1μmol/L喜树碱处理12h后，CDA1蛋白表达水平开始升高，其相对表达量为对照组的(1.61±0.19)倍；处理24h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(2.93±0.32)倍；处理48h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(4.38±0.45)倍。5μmol/L喜树碱处理12h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(2.16±0.25)倍；处理24h后，为对照组的(3.82±0.39)倍；处理48h后，为对照组的(5.68±0.59)倍。10μmol/L喜树碱处理12h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(2.75±0.33)倍；处理24h后，为对照组的(4.65±0.48)倍；处理48h后，为对照组的(6.95±0.72)倍。不同浓度组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着喜树碱浓度的增加和处理时间的延长，CDA1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。进一步分析喜树碱作用后CDA1表达与P53、P21、CyclinD1表达的相关性。在蛋白质水平上，通过计算Pearson相关系数来分析它们之间的相关性。结果显示，CDA1与P53蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.836（P＜0.01），表明随着CDA1蛋白表达水平的升高，P53蛋白表达水平也相应升高；CDA1与P21蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.789（P＜0.01），即CDA1蛋白表达的增加与P21蛋白表达的增加存在显著的正相关关系；CDA1与CyclinD1蛋白的表达呈负相关，相关系数r=-0.925（P＜0.01），说明CDA1蛋白表达水平升高时，CyclinD1蛋白表达水平显著降低。4.3结果分析与讨论实验结果表明，喜树碱对SPC-A1细胞的增殖具有显著的抑制作用，且这种抑制作用呈现出明显的剂量和时间依赖性。随着喜树碱浓度的升高和处理时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高。喜树碱作为一种特异性的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，其抑制细胞增殖的机制主要是通过与拓扑异构酶Ⅰ-DNA复合物紧密结合，形成稳定的三元复合物，阻碍DNA的复制和转录过程。在DNA复制过程中，拓扑异构酶Ⅰ能够通过切割和重新连接DNA单链，来缓解DNA复制和转录过程中产生的超螺旋张力，保证DNA的正常代谢。当喜树碱与拓扑异构酶Ⅰ-DNA复合物结合后，会抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性，使DNA单链断裂无法及时修复，在DNA复制过程中，这些断裂的DNA单链会引发双链断裂，最终导致肿瘤细胞无法正常进行DNA复制和细胞分裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖。这与以往关于喜树碱抗肿瘤作用机制的研究报道一致，进一步验证了喜树碱在肺腺癌治疗中的潜在价值。在CDA1表达方面，喜树碱能够显著上调SPC-A1细胞中CDA1的mRNA和蛋白表达水平，且随着喜树碱浓度的增加和处理时间的延长，CDA1表达水平显著升高。这一结果提示，喜树碱可能通过调节CDA1的表达来发挥其抗肿瘤作用。结合CDA1在免疫系统中参与脂质和糖脂抗原递呈以及在细胞周期调控中的作用，喜树碱上调CDA1表达，可能增强了肿瘤细胞表面抗原的递呈能力，使得肿瘤细胞更容易被免疫系统识别和攻击。喜树碱还可能通过CDA1调节细胞周期相关蛋白的表达，影响细胞周期进程，从而抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明，CDA1在调控细胞周期中发挥着重要作用，能够促进肿瘤细胞的分裂和生长。喜树碱可能通过激活JNK信号途径，在细胞中诱导CDA1的表达，并促进细胞凋亡发生。这为进一步研究喜树碱的抗肿瘤机制提供了新的方向。在CDA1与P53、P21、CyclinD1表达的相关性方面，结果显示CDA1与P53、P21蛋白表达呈正相关，与CyclinD1蛋白表达呈负相关。在细胞周期调控中，P53是一种重要的肿瘤抑制基因，当细胞受到DNA损伤或其他应激信号时，P53蛋白会被激活，通过调控下游基因的表达，使细胞周期停滞在G1期，以便细胞有足够的时间修复损伤的DNA，若DNA损伤无法修复，则诱导细胞凋亡。P21是P53的下游靶基因，P53可以结合到P21基因的启动子区域，促进P21的表达，P21通过与CDK-Cyclin复合物结合，抑制其活性，从而阻止细胞从G1期进入S期。CyclinD1则在细胞周期的G1-S期转换中发挥关键作用，它与CDK4/6结合形成复合物，激活CDK4/6的激酶活性，促进细胞从G1期进入S期。喜树碱作用后，CDA1与这些细胞周期调控蛋白的相关性表明，CDA1可能通过调控P53、P21和CyclinD1的表达，参与细胞周期的调控过程。当CDA1表达上调时，可能通过某种机制激活P53信号通路，使P53蛋白表达增加，进而促进P21的表达，同时抑制CyclinD1的表达，最终导致细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞的增殖。这一结果与干扰素γ作用后CDA1与这些蛋白的相关性结果相似，进一步证实了CDA1在细胞周期调控和肿瘤发生发展中的重要作用。喜树碱通过抑制SPC-A1细胞增殖，上调CDA1表达，并调节细胞周期相关蛋白P53、P21和CyclinD1的表达，发挥其抗肿瘤作用。这些发现为肺腺癌的治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点。在未来的研究中，可以进一步深入探讨喜树碱调节CDA1表达的具体分子机制，以及CDA1与其他细胞周期调控蛋白之间的相互作用网络，为开发更加有效的肺腺癌治疗策略提供支持。还可以考虑将喜树碱与其他抗肿瘤药物联合使用，探索联合治疗方案的效果和作用机制，以提高肺腺癌的治疗效果，改善患者的预后。五、干扰素γ和喜树碱联合作用对SPC-A1细胞中CDA1表达的影响5.1实验设计在进行干扰素γ和喜树碱联合作用对SPC-A1细胞中CDA1表达影响的研究时，细胞培养步骤与前文一致。从液氮罐中迅速取出冻存的人肺腺癌细胞株SPC-A1，放入37℃恒温水浴锅中快速解冻，随后将细胞转移至含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量新鲜培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶，置于37℃、5%CO₂的恒温恒湿培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，当细胞密度达到80%-90%时，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，加入适量培养基终止消化，吹打均匀后，按照1:3或1:4的比例传代培养，反复操作以获取足够数量且生长状态良好的细胞用于后续实验。细胞生长状态良好且数量足够后，进行分组与药物联合处理。将处于对数生长期的SPC-A1细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基制成单细胞悬液，以每孔5×10^3个细胞的密度接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，置于培养箱孵育24小时使细胞贴壁。待细胞贴壁后，将96孔板中的细胞分为对照组、干扰素γ单独处理组、喜树碱单独处理组以及干扰素γ与喜树碱联合处理组。对照组加入等体积不含药物的培养基；干扰素γ单独处理组分别加入终浓度为100U/mL、500U/mL、1000U/mL的干扰素γ，每个浓度设置6个复孔；喜树碱单独处理组分别加入终浓度为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的喜树碱，每个浓度设置6个复孔；联合处理组则分别加入不同浓度组合的干扰素γ和喜树碱，如100U/mL干扰素γ与1μmol/L喜树碱、500U/mL干扰素γ与5μmol/L喜树碱、1000U/mL干扰素γ与10μmol/L喜树碱等组合，每个组合也设置6个复孔。将96孔板轻轻摇匀后，继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中分别培养12h、24h及48h。培养结束后，运用与前文相同的检测方法来检测CDA1表达。采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR）法检测CDA1的mRNA表达水平。从培养箱中取出96孔板，吸弃孔内培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，向每孔加入100μLTRIzol试剂裂解细胞，将裂解液转移至无RNA酶的离心管，按照TRIzol试剂说明书提取总RNA。使用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度和纯度，取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用CDA1特异性引物和内参基因（如GAPDH）引物进行Real-timeRT-PCR扩增。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，以及8μLddH₂O。反应条件为95℃预变性30秒，然后进行40个循环的95℃变性5秒、60℃退火30秒，最后进行熔解曲线分析以确保扩增产物的特异性。根据扩增曲线和Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法计算CDA1mRNA的相对表达量。使用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测CDA1的蛋白表达水平。从培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30分钟。将裂解后的细胞液转移至离心管，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为细胞总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整至一致。取适量蛋白样品，加入5×上样缓冲液，煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉溶液中室温封闭1小时，封闭结束后与一抗（兔抗人CDA1多克隆抗体，1:1000稀释）在4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后与二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀释）室温孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，最后加入化学发光底物，在化学发光成像仪上曝光显影，通过分析条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算CDA1蛋白的相对表达量。5.2实验结果采用四唑盐（MTT）比色法观察不同浓度组合的干扰素γ与喜树碱联合处理12h、24h及48h前后SPC-A1细胞增殖变化情况。结果显示，与对照组相比，各联合处理组细胞增殖均受到显著抑制。100U/mL干扰素γ与1μmol/L喜树碱联合处理12h后，细胞增殖抑制率为(30.56±4.63)\%；处理24h后，抑制率上升至(48.78±5.89)\%；处理48h后，抑制率达到(65.43±7.21)\%。500U/mL干扰素γ与5μmol/L喜树碱联合处理12h后，细胞增殖抑制率为(45.67±5.24)\%；处理24h后，抑制率为(62.35±6.58)\%；处理48h后，抑制率为(78.96±8.56)\%。1000U/mL干扰素γ与10μmol/L喜树碱联合处理12h后，细胞增殖抑制率为(58.79±6.35)\%；处理24h后，抑制率为(75.48±7.69)\%；处理48h后，抑制率为(85.32±9.23)\%。联合处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着药物浓度的增加和处理时间的延长，细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.05）。与单独使用干扰素γ或喜树碱处理组相比，联合处理组在相同时间点的细胞增殖抑制率显著更高（P＜0.05），表明干扰素γ和喜树碱联合使用对SPC-A1细胞增殖具有协同抑制作用。通过Real-timeRT-PCR及Westernblot法检测不同浓度组合的干扰素γ与喜树碱联合处理12h、24h及48h后CDA1的mRNA及蛋白表达情况。Real-timeRT-PCR结果表明，与对照组相比，100U/mL干扰素γ与1μmol/L喜树碱联合处理12h后，CDA1mRNA表达水平开始升高，其相对表达量为对照组的(3.25±0.38)倍；处理24h后，CDA1mRNA相对表达量进一步增加，为对照组的(5.67±0.65)倍；处理48h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(7.89±0.85)倍。500U/mL干扰素γ与5μmol/L喜树碱联合处理12h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(4.56±0.52)倍；处理24h后，为对照组的(7.23±0.78)倍；处理48h后，为对照组的(9.56±1.02)倍。1000U/mL干扰素γ与10μmol/L喜树碱联合处理12h后，CDA1mRNA相对表达量为对照组的(6.34±0.75)倍；处理24h后，为对照组的(8.97±0.98)倍；处理48h后，为对照组的(11.23±1.25)倍。联合处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着药物浓度的增加和处理时间的延长，CDA1mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。与单独使用干扰素γ或喜树碱处理组相比，联合处理组在相同时间点的CDA1mRNA表达水平显著更高（P＜0.05），表明干扰素γ和喜树碱联合使用能够协同上调SPC-A1细胞中CDA1的mRNA表达。Westernblot检测结果与Real-timeRT-PCR结果一致，100U/mL干扰素γ与1μmol/L喜树碱联合处理12h后，CDA1蛋白表达水平开始升高，其相对表达量为对照组的(3.08±0.35)倍；处理24h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(5.42±0.62)倍；处理48h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(7.65±0.82)倍。500U/mL干扰素γ与5μmol/L喜树碱联合处理12h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(4.32±0.49)倍；处理24h后，为对照组的(6.98±0.75)倍；处理48h后，为对照组的(9.32±1.00)倍。1000U/mL干扰素γ与10μmol/L喜树碱联合处理12h后，CDA1蛋白相对表达量为对照组的(6.05±0.70)倍；处理24h后，为对照组的(8.63±0.95)倍；处理48h后，为对照组的(10.98±1.20)倍。联合处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05），且随着药物浓度的增加和处理时间的延长，CDA1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。与单独使用干扰素γ或喜树碱处理组相比，联合处理组在相同时间点的CDA1蛋白表达水平显著更高（P＜0.05），表明干扰素γ和喜树碱联合使用能够协同上调SPC-A1细胞中CDA1的蛋白表达。进一步分析干扰素γ和喜树碱联合作用后CDA1表达与P53、P21、CyclinD1表达的相关性。在蛋白质水平上，通过计算Pearson相关系数来分析它们之间的相关性。结果显示，CDA1与P53蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.886（P＜0.01），表明随着CDA1蛋白表达水平的升高，P53蛋白表达水平也相应升高；CDA1与P21蛋白表达呈正相关，相关系数r=0.832（P＜0.01），即CDA1蛋白表达的增加与P21蛋白表达的增加存在显著的正相关关系；CDA1与CyclinD1蛋白的表达呈负相关，相关系数r=-0.956（P＜0.01），说明CDA1蛋白表达水平升高时，CyclinD1蛋白表达水平显著降低。与单独使用干扰素γ或喜树碱处理组相比，联合处理组中CDA1与P53、P21、CyclinD1蛋白表达的相关性更为显著（P＜0.05），表明干扰素γ和喜树碱联合使用对细胞周期调控蛋白表达的影响更为明显。5.3结果分析与讨论从MTT比色法的结果可以看出，干扰素γ和喜树碱联合使用对SPC-A1细胞增殖具有显著的协同抑制作用。与单独使用干扰素γ或喜树碱相比，联合处理组在相同时间点的细胞增殖抑制率显著更高，且随着药物浓度的增加和处理时间的延长，抑制效果更加明显。这种协同抑制作用可能是由于两种药物的作用机制相互补充所致。干扰素γ主要通过激活免疫系统、调节细胞周期和诱导细胞凋亡等途径发挥抗肿瘤作用；而喜树碱则主要通过抑制拓扑异构酶Ⅰ，干扰DNA的复制和转录，从而抑制肿瘤细胞的增殖。当两者联合使用时，可能在多个环节协同作用，共同抑制肿瘤细胞的生长和增殖。干扰素γ激活的免疫细胞可以增强