免疫组化常用抗体及应用手册

免疫组化常用抗体及应用手册一、免疫组化与抗体应用概述免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）通过抗原-抗体特异性结合原理，定位检测组织/细胞中目标蛋白的表达，是病理诊断、肿瘤分型及科研探索的核心技术之一。抗体的特异性、效价及适用场景直接决定染色结果的准确性与可重复性。本手册聚焦临床与科研中高频使用的抗体，从靶点功能、适用样本、典型场景及技术要点展开说明，为从业者提供实用参考。二、肿瘤诊断核心抗体及应用（一）上皮性肿瘤相关抗体上皮组织来源的肿瘤（如癌）需通过上皮标志物明确起源，同时结合增殖、预后标志物判断生物学行为。1.细胞角蛋白（Cytokeratin,CK）家族靶点与亚型：CK是上皮细胞中间丝蛋白，包含CK5/6、CK7、CK8/18、CK19、CK20等亚型，不同亚型对应不同上皮组织特性。适用样本：石蜡包埋组织、冰冻切片（新鲜组织需优化固定条件）。典型应用：*CK7+CK20组合*：鉴别消化系统肿瘤（如结直肠癌CK20+、CK7-；胃癌多为CK7+、CK20±）；*CK5/6+P63*：辅助诊断鳞状细胞癌（鳞癌常双阳，腺癌多阴性）。注意要点：高温修复时需选择合适的抗原修复液（如pH9.0EDTA或柠檬酸缓冲液）；正常上皮（如皮肤、乳腺导管）也会表达CK，需结合组织形态学判断。2.人表皮生长因子受体2（HER2）靶点功能：HER2过表达与乳腺癌、胃癌等肿瘤的侵袭性及靶向治疗敏感性相关。适用样本：乳腺癌、胃癌等实体瘤的石蜡切片（需严格质控，避免脱片）。典型应用：乳腺癌HER2免疫组化（IHC）初筛，阳性（3+）提示可直接使用曲妥珠单抗；胃癌HER2检测需结合FISH确认基因扩增（IHC2+时）。注意要点：组织固定需用中性福尔马林，固定时间4-48小时；染色时设置阳性对照（已知HER2+组织）与阴性对照。（二）间叶性肿瘤相关抗体间叶肿瘤（如肉瘤）需通过间叶标志物与上皮标志物的“反向表达”（上皮-间叶转化相关研究除外）明确诊断。1.波形蛋白（Vimentin）靶点功能：间叶细胞特异性中间丝蛋白，是间叶肿瘤的“泛标志物”。适用样本：肉瘤、黑色素瘤、部分癌（如肾透明细胞癌）的石蜡/冰冻切片。典型应用：鉴别癌（CK+、Vimentin-）与肉瘤（Vimentin+、CK-）；辅助诊断血管肉瘤、平滑肌肉瘤等。注意要点：部分正常组织（如血管内皮、淋巴细胞）也会弱表达，需结合其他标志物；修复液选择pH9.0EDTA可提升染色强度。2.CD34靶点功能：造血干细胞及血管内皮细胞标志物，常用于血管源性肿瘤诊断。适用样本：血管肉瘤、胃肠道间质瘤（GIST）、孤立性纤维性肿瘤的石蜡切片。典型应用：血管肉瘤（CD34+）与卡波西肉瘤（HHV8+、CD34-）的鉴别；GIST中CD34常与DOG1、c-Kit（CD117）联合使用。注意要点：骨髓活检需注意红细胞背景干扰，可延长洗涤时间；部分间质瘤CD34表达缺失，需结合其他标志物。（三）淋巴造血系统肿瘤抗体淋巴造血肿瘤需通过CD系列抗体明确细胞来源、分化阶段及克隆性。1.CD3与CD20靶点功能：CD3标记T淋巴细胞，CD20标记B淋巴细胞，是淋巴瘤分型的基础标志物。适用样本：淋巴结、骨髓、结外淋巴组织的石蜡/冰冻切片（冰冻切片需新鲜固定）。典型应用：鉴别T细胞淋巴瘤（CD3+）与B细胞淋巴瘤（CD20+）；结合CD4/CD8判断T细胞亚群（如CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒性T细胞）。注意要点：石蜡切片需高温抗原修复（pH6.0柠檬酸缓冲液效果更佳）；正常淋巴组织中T、B细胞呈“镶嵌式”分布，需结合形态学判断肿瘤性增生。2.Ki-67靶点功能：增殖细胞核抗原，反映细胞增殖活性，与肿瘤恶性程度、预后相关。适用样本：各类肿瘤的石蜡切片（需避免挤压、坏死组织）。典型应用：乳腺癌Ki-67指数（阳性细胞比例）指导内分泌治疗（低Ki-67更敏感）；淋巴瘤Ki-67辅助判断侵袭性（如套细胞淋巴瘤Ki-67＞30%提示预后差）。注意要点：计数时需选择肿瘤细胞密集区（“热点区”），避免间质细胞干扰；不同克隆号抗体（如MIB-1）的染色阈值略有差异，需统一判读标准。三、病理分型与鉴别诊断抗体（一）神经内分泌肿瘤抗体神经内分泌肿瘤（NETs）需通过特异性标志物明确分化程度与起源。1.突触素（Synaptophysin,Syn）与嗜铬粒蛋白A（CgA）靶点功能：Syn标记突触小泡，CgA标记神经内分泌颗粒，二者是NETs的核心标志物。适用样本：肺、胃肠道、胰腺等部位的NETs石蜡切片。典型应用：鉴别NETs（Syn+、CgA+）与腺癌/鳞癌（Syn-、CgA-）；结合Ki-67区分G1（低增殖）、G2（中增殖）、G3（高增殖，如神经内分泌癌）。注意要点：部分类癌（高分化NETs）CgA表达较弱，需结合Syn；修复液选择pH9.0EDTA可增强CgA染色强度。（二）黑色素瘤与癌的鉴别抗体黑色素瘤易与低分化癌混淆，需通过黑色素细胞标志物明确。1.S-100蛋白与HMB45靶点功能：S-100是泛黑色素细胞标志物，HMB45特异性标记黑色素小体相关蛋白。适用样本：皮肤、黏膜、眼内等部位的黑色素瘤石蜡切片。典型应用：鉴别黑色素瘤（S-100+、HMB45+）与癌（CK+、S-100-）；辅助诊断促结缔组织增生性黑色素瘤（S-100+、HMB45-）。注意要点：部分朗格汉斯细胞（皮肤）、施万细胞（神经）也会表达S-100，需结合HMB45；冰冻切片染色时需缩短固定时间，避免抗原丢失。四、科研探索类热门抗体及应用（一）肿瘤微环境研究抗体肿瘤微环境（TME）包含免疫细胞、基质细胞及细胞因子，是科研热点方向。1.PD-L1（CD274）靶点功能：程序性死亡配体1，通过与PD-1结合抑制T细胞活性，是免疫治疗（如抗PD-1/PD-L1单抗）的核心靶点。适用样本：肿瘤组织石蜡切片（需使用经验证的克隆号，如22C3、SP263）。典型应用：预测免疫治疗响应（PD-L1高表达提示可能获益）；研究肿瘤免疫逃逸机制（结合CD8+T细胞、FoxP3+Treg细胞分析）。注意要点：不同克隆号的染色阈值不同（如22C3的阳性定义为肿瘤细胞≥1%）；需设置阳性对照（如扁桃体组织，生发中心周围细胞PD-L1+）。2.CD8与FoxP3靶点功能：CD8标记细胞毒性T细胞，FoxP3标记调节性T细胞（Treg），反映TME的免疫活性与抑制状态。适用样本：肿瘤、炎症组织的石蜡切片。典型应用：分析“热肿瘤”（CD8+T细胞浸润多）与“冷肿瘤”（CD8+T细胞浸润少）的免疫表型；研究Treg细胞在肿瘤免疫抑制中的作用（FoxP3+细胞比例与预后的相关性）。注意要点：石蜡切片需高温修复（pH6.0柠檬酸缓冲液）；计数时需区分肿瘤内与间质内的免疫细胞，避免假阳性。（二）细胞信号通路研究抗体信号通路异常是肿瘤发生的核心机制，相关抗体常用于机制研究。1.β-catenin（β-连环蛋白）靶点功能：Wnt通路核心分子，胞核/胞质异常表达提示Wnt通路激活，与结直肠癌、肝癌等相关。适用样本：肿瘤、正常组织的石蜡切片。典型应用：结直肠癌中β-catenin胞核阳性提示APC/CTNNB1基因突变；研究肿瘤细胞上皮-间叶转化（EMT）过程中β-catenin的核转位。注意要点：正常上皮细胞β-catenin主要表达于胞膜，核阳性需结合形态学判断；修复液选择pH9.0EDTA可增强核染色信号。五、抗体应用的共性技术要点（一）样本处理与固定组织固定需及时（离体后1小时内），使用中性福尔马林（4%甲醛），固定时间4-24小时（避免过长导致抗原封闭）；冰冻切片需用OCT包埋，-80℃保存，染色前用丙酮/甲醇固定10分钟。（二）抗原修复高温修复（微波炉或压力锅）是主流方法，根据抗体选择修复液：柠檬酸缓冲液（pH6.0）：适用于CK、CD系列、Ki-67；EDTA缓冲液（pH9.0）：适用于CgA、β-catenin、HER2；修复时间：石蜡切片通常10-15分钟（压力锅需控制压力与时间）。（三）抗体孵育与洗涤一抗孵育：4℃过夜（更优）或室温1-2小时，浓度按说明书调整（通常1:50-1:200）；二抗孵育：室温30分钟，选择与一抗种属匹配的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbit）；洗涤：用PBS-T（含0.1%Tween-20）洗涤3次，每次5分钟，避免非特异性结合。（四）结果判读与质控阳性对照：选择已知阳性的组织（如乳腺癌HER2阳性对照、扁桃体CD3/CD20阳性对照）；阴性对照：用PBS代替一抗，或使用同型IgG对照；判读标准：根据抗体类型（核、胞质、胞膜）结合临床/科研需求制定，如Ki-67计数热点区、HER2按ASCO/CAP标准判读。六、常见问题及解决方案（一）染色背景高原因：非特异性结合、封闭不足、抗体浓度过高；解决：延长洗涤时间（每次10分钟，洗3次）、增加封闭时间（5%BSA封闭30分钟）、降低一抗浓度。（二）阳性信号弱原因：抗原修复不充分、抗体效价低、孵育时间不足；解决：更换修复液（如从柠檬酸换为EDTA）、延长修复时