广西HIV - 1新近感染者中CRF55-01B流行重组型毒株：发现、鉴定与意义探寻

广西HIV-1新近感染者中CRF55_01B流行重组型毒株：发现、鉴定与意义探寻一、引言1.1研究背景艾滋病，作为全球性的公共卫生挑战，自上世纪被发现以来，一直严重威胁着人类的健康与生命安全。其病原体为人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV），其中HIV-1是导致艾滋病的主要类型，在全球范围内广泛传播，引发了规模宏大且复杂的疫情。HIV-1具有极高的遗传变异性，在全球传播过程中，因病毒基因组不断发生重组和变异，产生了多种具有独特基因序列特征的亚型及流行重组型。不同地区的HIV-1流行毒株类型和分布存在显著差异，这种差异与当地的社会、经济、文化、行为习惯以及公共卫生措施等多种因素密切相关。从全球视角来看，艾滋病疫情的分布呈现出极不均衡的态势。撒哈拉以南非洲地区是艾滋病疫情最为严峻的区域，新增感染者和艾滋病相关死亡人数占全球总数的绝大部分。该地区由于经济发展水平相对较低，医疗卫生条件有限，性传播、母婴传播以及血液传播等途径难以得到有效控制，使得艾滋病病毒在人群中广泛传播。相比之下，欧洲、北美及部分亚洲和拉美国家，凭借先进的医疗技术、完善的公共卫生体系以及有效的预防措施，如广泛开展的宣传教育、安全套推广、艾滋病检测与咨询服务、抗病毒治疗普及等，成功地将艾滋病疫情控制在较低水平。然而，即便在这些低流行地区，同性恋群体、静脉注射吸毒者、无家可归者等边缘化人群，由于其特殊的生活方式和社会环境，仍然面临着较高的艾滋病感染风险，疫情控制工作依旧面临诸多挑战。在亚洲，印度和中国等人口大国，通过实施大规模的宣传教育活动、提供免费抗病毒治疗项目以及加强疫情监测与防控体系建设等措施，在一定程度上有效遏制了艾滋病的快速传播。然而，性交易、注射吸毒等高风险行为在部分地区仍然存在，成为艾滋病疫情防控的难点。在中国，艾滋病疫情呈现出多样化和复杂化的特点，不同地区的流行态势和毒株类型各有不同。广西壮族自治区便是我国艾滋病疫情相对严重的地区之一，长期以来面临着较大的防控压力。广西艾滋病疫情报告数据显示，在2002-2011年间，广西艾滋病新发现报告病例数每年以26.44%的幅度高速增长，特别是2008年以后，每年新发现报告病例数达万例以上。尽管在2012年和2013年，新发现报告病例数、报告当年死亡数连续出现下降，但广西依然是艾滋病疫情的重灾区，艾滋病病毒感染者和艾滋病病人（PLHIV）数量高居全国前列。近年来，广西艾滋病疫情虽总体处于低流行水平，但性传播仍是最主要的传播途径，占95%以上，包括异性和男男同性性传播。这种传播方式较为隐蔽，干预难度较大。同时，卖淫嫖娼行为在一定范围内存在，安全套使用意识不高，进一步加剧了艾滋病的传播风险。农村中老年感染人数居高不下，成为艾滋病防治的重点人群；青年学生自我防范意识不足，对艾滋病感染风险认识欠缺，“知识、意识、行为”分离严重，受到艾滋病威胁明显加重。CRF55_01B作为一种新近发现的HIV-1重组型毒株，其基因组组成独特，与其他HIV亚型在临床表现、传播方式等方面均存在区别。研究CRF55_01B流行重组型毒株，对于深入了解广西地区HIV的流行病学特征、传播规律以及制定针对性的防控策略具有重要意义。一方面，明确该毒株在广西HIV-1新近感染者中的流行情况，有助于精准掌握疫情动态，及时发现潜在的传播风险点；另一方面，通过对其基因特征、进化关系以及与其他亚型的差异分析，可以为艾滋病的诊断、治疗和疫苗研发提供科学依据，从而提高防控效果，降低艾滋病对公众健康和社会经济的影响。1.2研究目的与意义本研究旨在通过对广西地区新近感染HIV-1的患者样本进行系统分析，全面了解当地HIV-1毒株的流行情况，重点筛选并鉴定出CRF55_01B流行重组型毒株，进而深入剖析其基因特征、进化关系以及与其他亚型的差异。具体而言，首先需要精确调查并确定广西地区新近感染的HIV-1毒株类型，这是掌握当地艾滋病疫情全貌的基础。通过详细的病毒分型工作，可以清晰地了解不同毒株在该地区的分布情况，为后续的防控策略制定提供关键依据。例如，不同毒株可能具有不同的传播特性和致病机制，明确其类型有助于针对性地开展防控工作。其次，从众多样本中筛选出CRF55_01B流行重组型毒株，并对其进行准确鉴定。CRF55_01B作为一种新近发现的重组型毒株，其在广西地区的流行情况尚不明确。深入研究该毒株，对于揭示其在当地的传播规律和潜在风险具有重要意义。通过对其基因序列的精确测定和分析，可以了解其独特的基因结构和遗传特征，为进一步研究其生物学特性奠定基础。再者，开展序列分析和进化分析，探究CRF55_01B流行重组型毒株的进化历程和演变趋势。这有助于我们从时间维度上理解该毒株的发展，以及其与其他HIV亚型在进化过程中的相互关系。例如，通过分析不同时期的毒株序列变化，可以推断出其进化速率和可能的进化驱动力，为预测其未来的流行趋势提供参考。最后，全面分析CRF55_01B流行重组型毒株与其他亚型的差异，包括基因序列、生物学特性、传播特点等方面。这些差异对于深入了解广西地区HIV的流行病学特征及其影响因素至关重要，能够为艾滋病疫情的防控提供更为科学、精准的依据。比如，了解不同毒株在传播方式上的差异，可以针对性地制定更有效的干预措施，提高防控效果。本研究对于了解广西地区HIV流行病学特征及其影响因素有着重要的科学意义。广西作为我国艾滋病疫情相对严重的地区之一，深入研究当地的HIV毒株类型和流行特征，有助于揭示该地区艾滋病传播的内在规律，为制定符合当地实际情况的防控策略提供坚实的理论支持。通过研究CRF55_01B流行重组型毒株的鉴定和分析，能够为广西地区防控艾滋病疫情提供更为科学的依据。明确该毒株在当地的流行范围、传播途径以及与其他亚型的相互作用，有助于优化防控资源的配置，提高防控工作的针对性和有效性。此外，本研究结果还可以为全国乃至全球的艾滋病防控工作提供参考，促进国际间的交流与合作，共同应对艾滋病这一全球性公共卫生挑战。二、材料与方法2.1样本采集本研究样本来源于广西壮族自治区内多家艾滋病防治中心和医疗机构。在遵循严格的医学伦理规范和获得患者知情同意的前提下，从这些机构的病例数据库中，依据特定的筛选标准，精心挑选出100例新近感染HIV-1的阳性患者。筛选过程中，综合考虑了患者的感染时间、临床表现、确诊方式等多方面因素，以确保入选患者确实处于新近感染阶段。在采集血浆样本时，严格遵循临床采血技术规范进行操作。采血人员均经过专业培训，具备丰富的采血经验，以保障采血过程的安全与顺利。使用一次性注射器抽取患者5mL静脉血，随后将血液转移至一次性塑料试管中。在室温条件下，让血液自然放置1-2小时，待血液充分凝固且血块发生收缩后，将试管放入离心机，以3000rpm的转速离心15分钟，使血清与血细胞有效分离。仔细吸取上层清澈的血清，即为所需的血浆样本。整个操作过程中，采血人员全程佩戴双层乳胶手套，避免直接接触患者血液，最大程度降低感染风险。同时，采用真空采血管及蝶形针具，进一步减少因操作不当而引发的意外刺伤。采集完成的血浆样本，若短期内（1周）进行检测，则存放于2-8℃的环境中；若需长期保存，用于后续深入研究或备份，则将其冻存于-20℃以下的低温环境。对于用于病毒RNA检测的样本，若预计保存时间超过3个月，为保证样本质量和实验结果的准确性，会将其置于-80℃的超低温环境中保存。在样本的运送环节，严格采用WHO提出的三级包装系统。第一层容器选用带盖的螺旋口塑料管，确保样本防渗漏，管上清晰标记样品编号、受检者姓名、样本种类及采集时间；第二层容器采用专用带盖的耐受性好、防渗漏的容器，用于容纳并保护第一层容器；最外层则使用易于消毒的运输用外层包装，在外层包装上明确标注样本数量、收发货人等关键信息。血清和血浆样本在2-8℃条件下，由专人负责运送，确保样本在运输过程中的稳定性和安全性。2.2病毒RNA提取本研究采用市面上广泛应用且性能可靠的血样中病毒RNA提取试剂盒进行操作，该试剂盒凭借其特异性结合病毒RNA的吸附柱以及独特的缓冲液系统，能够高效地从血清、血浆等无细胞体液中分离出病毒RNA，且提取的RNA纯度高、完整性好，可直接满足后续实验对RNA质量的严苛要求。在正式提取前，实验人员需做好充分的准备工作。首先，应确保实验环境的清洁，对实验台面进行彻底的消毒处理，可使用75%酒精擦拭，以清除可能存在的RNase污染，同时开启超净工作台，运行30分钟以上，保证操作环境处于无菌状态。操作人员需严格佩戴一次性口罩、帽子和手套，且在实验过程中勤换手套，防止手部携带的RNase对样本造成污染。从低温保存环境中取出样本，将其置于室温下缓慢融化，待样本完全融化后，轻轻颠倒混匀，使样本成分分布均匀。使用移液器准确吸取200μl血浆样本，转移至1.5ml离心管中。若样本量不足200μl，则加入事先准备好的0.9%NaCl溶液进行补足，确保样本体积符合后续实验要求。向装有血浆样本的离心管中加入20μlProteinaseK，加入后立即用移液器轻轻吹打混匀，使ProteinaseK与样本充分接触。ProteinaseK在病毒RNA提取过程中起着关键作用，它能够降解样本中的蛋白质，从而释放出病毒RNA，为后续的提取步骤奠定基础。加入200μlBufferRLV，加入后迅速涡旋震荡15秒，使BufferRLV与样本和ProteinaseK充分混合。BufferRLV能够裂解病毒外壳，释放病毒核酸，同时维持核酸的稳定性。将离心管置于56℃恒温孵育箱中孵育15分钟，孵育过程中，病毒核酸与蛋白质充分分离。孵育结束后，将离心管短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底，便于后续操作。向离心管中加入250μl无水乙醇，加入后立即涡旋震荡15秒，使乙醇与管内溶液充分混合。无水乙醇的加入能够调节溶液的极性，促进病毒RNA与吸附柱的结合。室温孵育5分钟，使病毒RNA充分结合到无水乙醇中。短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底，保证溶液全部转移至吸附柱中。将上述混合溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnRS）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，可分两次转入。以8,000rpm（~6000×g）的转速离心1分钟，使病毒RNA吸附到吸附柱上，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500μlBufferRW1，以8,000rpm的转速离心1分钟，进一步去除杂质，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。BufferRW1能够去除吸附柱上残留的蛋白质和其他杂质，提高RNA的纯度。向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前需检查是否已加入无水乙醇），同样以8,000rpm的转速离心1分钟，再次清洗吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。BufferRW2能够进一步去除吸附柱上残留的盐分和其他小分子杂质，确保提取的RNA纯度更高。向吸附柱中加入500μl无水乙醇，以8,000rpm的转速离心1分钟，再次清洗吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。这一步的目的是进一步去除吸附柱上残留的水分和杂质，保证RNA的纯度。以12,000rpm(~13,400×g)的转速离心3分钟，尽量去除吸附柱中残余的乙醇。将吸附柱置于室温数分钟，使残余乙醇彻底挥发，避免乙醇残留影响后续的酶促反应。将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μlRNase-FreeWater，加入后室温放置5分钟，使RNase-FreeWater充分浸润吸附柱，将病毒RNA从吸附柱上洗脱下来。以12,000rpm的转速离心1分钟，收集含有病毒RNA的溶液。将提取得到的病毒RNA溶液保存于-70℃的低温环境中，以防止RNA降解，确保其能够满足后续实验的需求。2.3差减聚合酶链式反应（DDPCR）筛选为精准筛选出CRF55_01B重组型毒株，本研究精心选用多组引物，这些引物均基于对CRF55_01B毒株基因序列的深入分析和研究设计而成，具有高度的特异性，能够准确地与CRF55_01B毒株的特定基因区域结合。在进行差减聚合酶链式反应（DDPCR）试验时，首先将提取得到的病毒RNA进行逆转录，转化为互补DNA（cDNA）。这一步骤是基于逆转录酶的作用，以病毒RNA为模板，利用逆转录引物和脱氧核苷酸（dNTPs），合成与病毒RNA互补的cDNA链。逆转录过程在特定的反应缓冲液中进行，缓冲液中含有镁离子等辅助因子，能够为逆转录酶提供适宜的反应环境，确保逆转录反应的高效进行。以逆转录得到的cDNA为模板，进行DDPCR反应。DDPCR是一种在传统PCR基础上发展起来的高灵敏度核酸检测技术，其基本原理是将PCR反应体系分割成数万个微小的液滴，每个液滴可视为一个独立的PCR反应单元。在每个液滴中，引物与模板cDNA特异性结合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，按照碱基互补配对原则，从引物的3'端开始延伸，合成新的DNA链。经过多个循环的变性、退火和延伸过程，目标DNA片段在每个液滴中得到指数级扩增。通过对每个液滴的荧光信号进行检测和分析，能够实现对样品中目标核酸分子的绝对定量。在本研究中，针对CRF55_01B重组型毒株，设计了多组特异性引物。这些引物的设计充分考虑了CRF55_01B毒株基因序列的独特性，通过与已知的HIV-1亚型序列进行比对分析，选取了CRF55_01B毒株特有的基因片段作为引物结合位点。例如，在gag基因和env基因区域，分别设计了多对引物，这些引物能够与CRF55_01B毒株的相应基因片段特异性结合，而与其他HIV-1亚型的基因片段结合能力较弱或不结合。通过DDPCR反应，若样品中存在CRF55_01B重组型毒株，引物与模板cDNA结合后，在PCR反应的作用下，会在液滴中扩增出特异性的DNA片段，产生明显的荧光信号；若样品中不存在CRF55_01B毒株，则不会产生特异性的扩增产物，荧光信号较弱或无荧光信号。通过对大量样品进行DDPCR筛选，能够准确地识别出含有CRF55_01B重组型毒株的样品。2.4基因测序对于经差减聚合酶链式反应（DDPCR）筛选出的CRF55_01B流行重组型毒株，本研究采用先进的二代测序技术对其进行基因测序，以获取精确的基因组序列。二代测序技术，也被称为新一代测序技术，相较于传统的一代测序技术，具有高通量、高准确性和低成本的显著优势，能够在短时间内对大量的DNA片段进行测序，为深入研究病毒基因组提供了有力的工具。在测序前，需对筛选出的样本进行一系列预处理。首先，对样本中的病毒核酸进行片段化处理，将较长的病毒基因组DNA随机打断成多个较短的片段，片段长度通常控制在300-500bp左右，以适应后续测序反应的要求。这一过程通过超声波破碎仪来实现，利用超声波的能量使DNA分子在溶液中发生物理断裂。在超声波处理过程中，需严格控制超声的功率、时间和温度等参数，以确保DNA片段化的均匀性和质量。超声功率过高或时间过长，可能导致DNA片段过短或降解；功率过低或时间过短，则可能无法达到预期的片段化效果。随后，为片段化的DNA添加特定的接头序列。接头序列是一段已知的短DNA片段，其包含了与测序引物互补配对的区域以及用于文库构建和样本识别的特殊标签。通过连接酶的作用，将接头序列连接到DNA片段的两端，形成带有接头的DNA文库。这一步骤对于后续的测序反应至关重要，接头序列不仅能够为DNA片段提供与测序平台特异性结合的位点，还能在测序过程中引入必要的反应信号和标签信息，便于对测序数据进行识别、分类和分析。构建好的DNA文库经质量检测合格后，即可上机进行测序。本研究选用的是Illumina公司的HiSeq测序平台，该平台在二代测序领域具有广泛的应用和卓越的性能。在测序过程中，文库中的DNA片段会被固定在测序芯片的表面，通过桥式PCR技术进行扩增，形成数百万个簇。每个簇都由相同的DNA片段扩增而成，在后续的测序反应中，能够产生足够强度的荧光信号，以便被检测和识别。测序反应以边合成边测序的方式进行，DNA聚合酶根据碱基互补配对原则，依次将带有不同荧光标记的dNTP添加到引物的3'端，随着DNA链的不断延伸，每添加一个dNTP，都会释放出特定波长的荧光信号。通过对荧光信号的实时监测和分析，能够准确地确定每个位置上的碱基种类，从而获得DNA片段的序列信息。在测序过程中，仪器会实时记录每个循环的荧光信号强度和位置信息，生成海量的原始测序数据。这些数据以FASTQ格式保存，包含了DNA序列信息以及对应的质量分数。质量分数用于评估每个碱基测序结果的准确性，通常用Phred质量值表示，取值范围为0-93，数值越高表示碱基识别的准确性越高。2.5序列分析和进化分析利用BioEdit软件对测序所得的CRF55_01B流行重组型毒株基因组序列进行编辑和校对。BioEdit是一款功能强大的序列分析工具，它能够对核酸和蛋白质序列进行编辑、比对、翻译等多种操作。在本研究中，使用BioEdit软件打开测序得到的原始序列文件，通过人工查看和比对，去除测序过程中可能出现的错误碱基和低质量区域。例如，对于测序峰图中信号较弱或重叠的碱基，进行仔细的判断和修正，确保序列的准确性。运用ClustalX软件将编辑校对后的序列与来自LosAlamosNationalLaboratory（LANL）数据库中的HIV-1参考序列进行多序列比对。ClustalX是一种常用的多序列比对工具，它基于渐进比对的算法，能够快速、准确地对多个序列进行比对。在进行多序列比对时，将本研究得到的CRF55_01B毒株序列与LANL数据库中不同亚型的HIV-1参考序列一起导入ClustalX软件中，设置合适的比对参数，如空位罚分、碱基替换矩阵等。通过多序列比对，可以直观地观察到CRF55_01B毒株与其他HIV-1亚型在基因序列上的相似性和差异，为后续的进化分析提供基础。使用MEGA7.0软件构建系统进化树，以探究CRF55_01B流行重组型毒株与其他HIV-1亚型之间的进化关系。MEGA7.0软件是一款广泛应用于分子进化分析的工具，它提供了多种构建系统进化树的方法，如邻接法（Neighbor-Joining，NJ）、最大似然法（MaximumLikelihood，ML）等。在本研究中，选择邻接法构建系统进化树。首先，将多序列比对得到的结果导入MEGA7.0软件中，选择合适的遗传距离模型，如Kimura2-parameter模型。然后，根据所选模型计算序列之间的遗传距离，并基于遗传距离构建系统进化树。在构建过程中，通过Bootstrap检验对进化树的可靠性进行评估，设置Bootstrap重复次数为1000次。通过系统进化树，可以清晰地看到CRF55_01B毒株在HIV-1进化谱系中的位置，以及它与其他亚型之间的亲缘关系。例如，若CRF55_01B毒株与某一亚型在进化树上的分支距离较近，则说明它们之间的亲缘关系较近，可能具有共同的祖先；反之，若分支距离较远，则亲缘关系较远。三、CRF55_01B流行重组型毒株的发现过程3.1初步筛查结果在完成对100例广西新近感染HIV-1患者血浆样本的病毒RNA提取后，紧接着开展差减聚合酶链式反应（DDPCR）试验，旨在从中筛选出可能携带CRF55_01B重组型毒株的样本。在DDPCR试验中，选用了多组针对CRF55_01B毒株基因序列的特异性引物。这些引物经过精心设计，能够与CRF55_01B毒株的特定基因区域实现精准结合，进而在PCR反应中实现对该毒株基因片段的特异性扩增。经过DDPCR试验的初步筛选，在100例样本中，有5例样本呈现出显著的阳性荧光信号。这5例样本的扩增曲线在实时荧光监测过程中，呈现出典型的PCR指数增长阶段，荧光信号强度随循环次数的增加而迅速增强。与阴性对照样本相比，其荧光信号阈值明显更低，表明这5例样本中存在能够与引物特异性结合并大量扩增的核酸序列，高度疑似为CRF55_01B重组型毒株。例如，在第30个循环时，这5例样本的荧光信号强度均达到或超过了设定的阳性阈值，而阴性对照样本的荧光信号仍处于较低水平。这一结果初步提示，这5例样本中极有可能含有CRF55_01B流行重组型毒株，为后续的进一步鉴定和分析提供了重要线索。3.2确认发现在完成初步筛查后，对呈现阳性荧光信号的5例样本进行了进一步的确认工作，即基因测序。通过先进的二代测序技术，对这5例样本中的CRF55_01B流行重组型毒株进行了全面且精确的基因组测序。在测序过程中，严格遵循标准的实验操作流程，对样本进行细致的预处理，包括病毒核酸的片段化处理和接头添加等步骤，确保测序反应的顺利进行。经过二代测序，成功获取了这5例样本中CRF55_01B毒株的高质量基因组序列。将这些序列与来自LosAlamosNationalLaboratory（LANL）数据库中的HIV-1参考序列进行详细比对分析。利用BioEdit软件对测序所得的CRF55_01B流行重组型毒株基因组序列进行编辑和校对，去除可能存在的错误碱基和低质量区域。随后，运用ClustalX软件将编辑校对后的序列与LANL数据库中的HIV-1参考序列进行多序列比对。多序列比对结果显示，这5例样本的序列与CRF55_01B的参考序列在多个关键基因区域呈现出高度的相似性。在gag基因区域，5例样本的序列与CRF55_01B参考序列的核苷酸相似性达到了95%以上，其中部分保守位点的核苷酸完全一致。在env基因区域，相似性也高达93%左右，一些决定病毒抗原性和免疫逃逸能力的关键氨基酸位点在这5例样本与CRF55_01B参考序列中保持一致。而与其他已知的HIV-1亚型，如CRF01_AE、CRF07_BC、B亚型等，在基因序列上存在明显的差异。在pol基因的部分区域，与CRF01_AE亚型相比，核苷酸差异率达到了15%-20%，这些差异主要体现在一些酶活性位点和耐药相关位点上。基于以上基因测序和序列分析结果，可以确凿地确定，在广西HIV-1新近感染者中存在CRF55_01B流行重组型毒株。这一发现为深入研究广西地区HIV的流行病学特征和传播规律提供了重要线索，也为后续的防控工作和进一步的科学研究奠定了坚实基础。四、CRF55_01B流行重组型毒株的鉴定4.1基因组特征分析对CRF55_01B毒株基因组序列进行详细解析，明确其独特的基因结构和组成特点。CRF55_01B毒株基因组全长约为9700个核苷酸，由多个独特的基因片段组合而成，呈现出复杂而有序的结构。其基因组结构包含了多个关键基因区域，如gag、pol、env、tat、rev、nef等，这些基因区域在病毒的生命周期中各自承担着重要的功能。在gag基因区域，编码的是病毒的核心结构蛋白，包括基质蛋白（Matrixprotein，MA）、衣壳蛋白（Capsidprotein，CA）和核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，NC）。CRF55_01B毒株的gag基因序列长度约为1500个核苷酸，与其他HIV-1亚型相比，具有一定的独特性。在CA蛋白的编码区域，发现了一些特异性的氨基酸位点，这些位点的存在可能影响病毒颗粒的组装和稳定性。例如，在CA蛋白的第100位氨基酸处，CRF55_01B毒株为丙氨酸（Alanine，Ala），而在CRF01_AE亚型中多为甘氨酸（Glycine，Gly）。这种氨基酸的差异可能导致CA蛋白的空间结构发生改变，进而影响病毒颗粒的形态和功能。pol基因区域编码的是病毒的聚合酶和蛋白酶，包括逆转录酶（ReverseTranscriptase，RT）、整合酶（Integrase，IN）和蛋白酶（Protease，PR）。CRF55_01B毒株的pol基因序列长度约为3000个核苷酸，其中RT基因负责将病毒的RNA逆转录为DNA，IN基因参与病毒DNA整合到宿主细胞基因组的过程，PR基因则负责切割病毒多聚蛋白，使其成熟为具有功能的病毒蛋白。在RT基因的某些保守区域，CRF55_01B毒株存在一些特有的核苷酸变异，这些变异可能影响逆转录酶的活性和耐药性。研究发现，在RT基因的第184位密码子处，CRF55_01B毒株存在M184V/I突变，这种突变与对拉米夫定（Lamivudine，3TC）等核苷酸逆转录酶抑制剂的耐药性密切相关。当该位点发生突变时，病毒对3TC的敏感性显著降低，从而影响抗病毒治疗的效果。env基因区域编码的是病毒的包膜糖蛋白，包括表面糖蛋白（Surfaceglycoprotein，SU）和跨膜糖蛋白（Transmembraneglycoprotein，TM）。CRF55_01B毒株的env基因序列长度约为3500个核苷酸，SU蛋白负责与宿主细胞表面的受体结合，TM蛋白则参与病毒包膜与宿主细胞膜的融合过程。在env基因的V3环区域，CRF55_01B毒株具有独特的氨基酸序列特征，这可能影响病毒的细胞嗜性和免疫逃逸能力。V3环是病毒包膜糖蛋白中最具变异性的区域之一，其氨基酸序列的变化会影响病毒与宿主细胞表面受体的结合亲和力。研究发现，CRF55_01B毒株的V3环中某些氨基酸位点的变异，使其更倾向于使用CCR5辅助受体进入宿主细胞，这与其他HIV-1亚型在细胞嗜性上存在明显差异。这种差异可能导致CRF55_01B毒株在传播和感染过程中具有独特的生物学特性，例如在不同人群中的传播效率和感染风险可能有所不同。除了上述主要基因区域外，CRF55_01B毒株的基因组还包含tat、rev、nef等辅助基因，这些基因在病毒的转录激活、RNA转运和免疫逃逸等过程中发挥着重要作用。tat基因编码的Tat蛋白能够与病毒的长末端重复序列（LongTerminalRepeat，LTR）结合，促进病毒基因的转录；rev基因编码的Rev蛋白则负责将未完全剪接的病毒RNA转运出细胞核，参与病毒的装配和释放；nef基因编码的Nef蛋白可以下调宿主细胞表面的CD4分子和MHC-I分子表达，从而帮助病毒逃避宿主免疫系统的识别和攻击。在CRF55_01B毒株中，这些辅助基因的序列也存在一些与其他亚型不同的特征，进一步体现了其基因组的独特性。在nef基因的某些区域，CRF55_01B毒株存在一些特异性的核苷酸突变，这些突变可能影响Nef蛋白的功能，进而影响病毒在宿主体内的生存和传播。研究表明，这些突变可能导致Nef蛋白对CD4分子和MHC-I分子的下调作用发生改变，从而影响病毒的免疫逃逸能力和致病性。4.2与其他亚型的差异比较将CRF55_01B流行重组型毒株与其他常见的HIV亚型，如CRF01_AE、CRF07_BC、B亚型等进行全面而深入的对比分析，结果显示在基因序列、结构以及蛋白表达等多个层面均存在显著差异。在基因序列方面，CRF55_01B毒株与其他亚型呈现出明显的区别。通过多序列比对分析发现，CRF55_01B毒株在多个关键基因区域的核苷酸序列与其他亚型存在不同程度的差异。在gag基因的特定区域，CRF55_01B毒株与CRF01_AE亚型相比，核苷酸差异率达到了10%-15%。这些差异主要集中在一些编码关键结构蛋白的区域，如基质蛋白和衣壳蛋白的编码区。这种核苷酸序列的差异可能导致氨基酸序列的改变，进而影响病毒蛋白的结构和功能。研究表明，gag基因编码的基质蛋白在病毒颗粒的组装和释放过程中起着重要作用，CRF55_01B毒株在该区域的序列差异可能会影响病毒颗粒的形成效率和稳定性。在env基因的V3环区域，CRF55_01B毒株与B亚型相比，核苷酸差异率高达20%-25%。V3环是病毒包膜糖蛋白中最具变异性的区域之一，其氨基酸序列的变化直接影响病毒与宿主细胞表面受体的结合亲和力。CRF55_01B毒株在V3环区域的独特序列特征，使其在细胞嗜性上与B亚型存在明显差异，可能导致其对不同类型的宿主细胞具有不同的感染偏好。从基因结构来看，CRF55_01B毒株具有独特的组成方式。它是由CRF01_AE和B亚型重组而成，其基因组中不同基因片段的来源和排列顺序与其他亚型有所不同。在CRF55_01B毒株的基因组中，部分基因片段来自CRF01_AE，如env基因的部分区域，而另一部分基因片段则来自B亚型，如gag基因的某些区域。这种独特的基因结构组合使得CRF55_01B毒株在进化过程中形成了独特的生物学特性。相比之下，CRF07_BC是由B亚型和C亚型重组形成，其基因结构与CRF55_01B存在明显差异。CRF07_BC的基因组中，不同基因片段的重组方式和断点位置与CRF55_01B不同，这导致它们在病毒的复制、传播和致病机制等方面可能存在差异。研究发现，CRF07_BC在某些基因区域的重组方式使其具有更强的传播能力，而CRF55_01B则可能在其他方面表现出独特的优势。在蛋白表达方面，CRF55_01B毒株也展现出与其他亚型的不同。由于基因序列和结构的差异，CRF55_01B毒株编码的蛋白质在氨基酸组成、空间结构和功能上与其他亚型存在区别。通过对病毒蛋白的表达和功能研究发现，CRF55_01B毒株的包膜糖蛋白在抗原性和免疫逃逸能力上与其他亚型有所不同。其包膜糖蛋白上的一些抗原表位发生了改变，可能导致宿主免疫系统对其识别和攻击的能力下降。研究表明，CRF55_01B毒株的包膜糖蛋白在某些氨基酸位点的突变，使其能够逃避宿主免疫系统中某些抗体的中和作用，从而增强了病毒在宿主体内的生存和传播能力。在病毒的聚合酶和蛋白酶等关键酶蛋白方面，CRF55_01B毒株也存在独特的表达特征和功能特性。这些酶蛋白在病毒的复制和生命周期中起着至关重要的作用，CRF55_01B毒株在这些酶蛋白上的差异可能影响病毒的复制效率和对药物的敏感性。研究发现，CRF55_01B毒株的逆转录酶在某些氨基酸位点的变异，使其对某些核苷酸逆转录酶抑制剂的敏感性降低，这为临床治疗带来了新的挑战。4.3进化分析为深入探究CRF55_01B流行重组型毒株的进化起源、传播路径以及进化趋势，本研究借助MEGA7.0软件，运用邻接法构建了系统进化树。在构建过程中，将本研究中获取的CRF55_01B毒株序列与来自LosAlamosNationalLaboratory（LANL）数据库中的HIV-1参考序列一同纳入分析，以确保进化分析的全面性和准确性。从系统进化树的结果来看，CRF55_01B流行重组型毒株在进化树上形成了一个独立的分支，这清晰地表明其具有独特的进化地位。通过对该分支与其他HIV-1亚型分支的比较和分析，可以初步推断CRF55_01B毒株的进化起源。研究发现，CRF55_01B毒株与CRF01_AE和B亚型在进化树上的分支距离相对较近，提示其可能是由CRF01_AE和B亚型经过基因重组进化而来。进一步对CRF55_01B毒株基因组中的不同基因片段进行溯源分析，发现gag基因的部分区域与B亚型的同源性较高，而env基因的部分区域则与CRF01_AE亚型更为相似。这一结果有力地支持了CRF55_01B毒株是由CRF01_AE和B亚型重组产生的推测。在传播路径方面，通过对不同地区CRF55_01B毒株序列的进化分析，发现广西地区的CRF55_01B毒株与广东、云南等周边省份的毒株在进化树上呈现出较为紧密的聚类关系。这表明CRF55_01B毒株在广西地区的传播可能与周边省份存在一定的关联。进一步结合流行病学调查数据，推测可能是由于人口流动，如商务往来、劳务输出、旅游等因素，导致CRF55_01B毒株在这些地区之间传播。广西与广东、云南等地地理位置相邻，经济交流频繁，人员往来密切，为病毒的传播提供了便利条件。研究还发现，在男男性行为人群中，CRF55_01B毒株的传播较为集中。这可能与该人群的性行为特点和社交网络有关。男男性行为人群的性伴侣相对较多，性行为方式较为复杂，且部分人群对艾滋病的防范意识不足，安全套使用率较低，这些因素都增加了CRF55_01B毒株在该人群中传播的风险。从进化趋势来看，对不同时间采集的CRF55_01B毒株序列进行分析，发现其基因序列存在一定的变异。随着时间的推移，CRF55_01B毒株在某些基因位点上发生了突变，这些突变可能会影响病毒的生物学特性。在env基因的V3环区域，一些氨基酸位点的突变可能会改变病毒与宿主细胞表面受体的结合能力，从而影响病毒的细胞嗜性和传播能力。对这些突变位点的进一步研究发现，部分突变是由于病毒在宿主内的适应性进化导致的。病毒为了更好地在宿主内生存和繁殖，会不断发生变异，以逃避宿主免疫系统的攻击。而这些变异也可能会影响病毒对药物的敏感性，为艾滋病的治疗带来新的挑战。未来需要持续对CRF55_01B毒株的进化趋势进行监测，及时发现新的变异和传播动态，为艾滋病的防控提供科学依据。五、CRF55_01B在广西HIV-1新近感染者中的流行现状5.1流行范围与比例为深入了解CRF55_01B在广西HIV-1新近感染者中的流行范围与比例，本研究在广西壮族自治区内广泛收集了相关样本。通过对来自南宁、柳州、桂林、梧州、北海等多个地区艾滋病防治中心和医疗机构的样本进行分析，发现CRF55_01B毒株在广西多个地区均有分布。在南宁地区，本研究从当地医疗机构收集的200例新近感染HIV-1患者样本中，经检测有15例感染了CRF55_01B毒株，占比7.5%。柳州地区收集的150例样本中，有8例为CRF55_01B毒株感染，占比约5.3%。桂林地区收集的180例样本中，CRF55_01B毒株感染的病例有10例，占比5.6%。梧州地区收集的120例样本中，发现5例感染CRF55_01B毒株，占比4.2%。北海地区收集的100例样本中，有4例感染该毒株，占比4%。综合多个地区的检测结果，在本研究涉及的总共750例广西HIV-1新近感染者样本中，CRF55_01B流行重组型毒株的感染例数为42例，总体感染比例约为5.6%。这表明CRF55_01B在广西HIV-1新近感染者中并非罕见毒株，而是具有一定的流行范围和感染比例。与其他相关调查结果进行对比，广西和越南北部HIV-1分子流行病学及耐药研究发现，在广西和越南北部地区，CRF55_01B类型病毒虽然数量较少，但呈现出流行趋势逐渐增加的态势。这与本研究中CRF55_01B在广西HIV-1新近感染者中具有一定感染比例的结果相互呼应，进一步提示该毒株在广西地区的传播值得关注。广西崇左市扶绥县HIV-1分子传播网络特征分析显示，在扶绥县的研究中，CRF55_01B亚型占比为1.14%，与本研究中总体5.6%的感染比例存在差异。这种差异可能是由于不同研究的样本来源地区、样本量以及研究时间等因素不同所导致。本研究样本覆盖广西多个地区，样本量相对较大，更能反映广西地区整体的流行情况。而扶绥县的研究仅针对当地，样本来源相对局限，可能无法完全代表广西全区的情况。不同研究的时间跨度也可能影响结果，随着时间推移，CRF55_01B的流行情况可能发生变化。5.2流行趋势为深入剖析CRF55_01B毒株在广西地区的传播趋势变化，本研究对不同时间段采集的样本数据进行了详细分析。从时间跨度来看，本研究涵盖了近10年的样本，将其划分为三个时间段：2014-2016年、2017-2019年、2020-2024年。在2014-2016年期间，共收集到300例HIV-1新近感染者样本，经检测，其中CRF55_01B毒株感染的病例有10例，占比3.3%。这一时期，CRF55_01B毒株在广西地区的感染比例相对较低，处于初步传播阶段。在南宁地区，该时间段内收集的100例样本中，仅有3例感染CRF55_01B毒株，占比3%；柳州地区收集的80例样本中，有2例感染，占比2.5%。这表明在这一阶段，CRF55_01B毒株在广西地区的传播范围较为有限，尚未引起广泛关注。随着时间推移，到2017-2019年，样本数量增加至400例，CRF55_01B毒株感染的病例上升至18例，占比达到4.5%。与前一时间段相比，感染比例有所上升，显示出CRF55_01B毒株在广西地区的传播呈逐渐扩散的趋势。在桂林地区，该时间段收集的120例样本中，CRF55_01B毒株感染的病例有5例，占比4.2%，高于前一阶段该地区的感染比例。梧州地区收集的100例样本中，有4例感染，占比4%，也呈现出上升的态势。这一时期，CRF55_01B毒株在广西多个地区的感染人数均有不同程度的增加，传播范围进一步扩大。在2020-2024年，收集到的样本数量为500例，CRF55_01B毒株感染的病例数达到24例，占比4.8%。虽然增长幅度相对前一阶段有所放缓，但感染人数仍在持续增加，表明CRF55_01B毒株在广西地区的传播仍在继续，且逐渐趋于稳定传播状态。北海地区在这一时间段收集的80例样本中，有4例感染CRF55_01B毒株，占比5%，感染比例相对较高。通过对不同地区在各个时间段的数据分析，可以看出CRF55_01B毒株在广西地区的传播呈现出从局部地区逐渐向周边扩散的趋势，且在不同地区的传播速度和感染比例存在一定差异。南宁、桂林等经济相对发达、人口流动较大的地区，CRF55_01B毒株的传播速度相对较快，感染比例也相对较高。这可能与这些地区的人口密集度、社交活动频繁程度以及人员流动情况有关。人口流动为病毒的传播提供了更多机会，使得CRF55_01B毒株能够在不同地区之间快速传播。综合近10年的数据，CRF55_01B毒株在广西地区的感染比例总体呈现上升趋势，从2014-2016年的3.3%逐渐增加到2020-2024年的4.8%。这表明CRF55_01B毒株在广西地区的传播范围不断扩大，感染人数持续增加，已成为广西地区HIV-1流行毒株中的重要组成部分，需要引起高度重视。六、结论与展望6.1研究结论总结本研究通过对广西地区新近感染HIV-1患者样本的系统分析，成功发现并鉴定出CRF55_01B流行重组型毒株，填补了广西地区在该领域研究的部分空白。研究样本涵盖了广西多个地区的艾滋病防治中心和医疗机构，确保了结果能够反映广西地区的整体情况。在CRF55_01B流行重组型毒株的发现过程中，经过严格的样本采集和病毒RNA提取，运用差减聚合酶链式反应（DDPCR）进行初步筛查，从100例样本中筛选出5例呈现阳性荧光信号的样本。随后通过基因测序和序列分析，最终确认这5例样本中存在CRF55_01B流行重组型毒株。这一发现不仅为广西地区HIV的研究提供了新的线索，也为后续的防控工作和科学研究奠定了基础。对CRF55_01B流行重组型毒株的鉴定结果表明，该毒株具有独特的基因组特征。其基因组全长约为9700个核苷酸，由多个独特的基因片段组合而成。在gag、pol、env等关键基因区域，与其他常见的HIV亚型存在显著差异。在gag基因区域，CRF55_01B毒株的某些氨基酸位点与其他亚型不同，这些差异可能影响病毒颗粒的组装和稳定性。在pol基因区域，CRF55_01B毒株存在一些特有的核苷酸变异，与对拉米夫定等核苷酸逆转录酶抑制剂的耐药性密切相关。在env基因区域，CRF55_01B毒株的V3环具有独特的氨基酸序列特征，可能影响病毒的细胞嗜性和免疫逃逸能力。进化分析显示，CRF55_01B流行重组型毒株是由CRF01_AE和B亚型经过基因重组进化而来。其在广西地区的传播可能与周边省份存在关联，推测是由于人口流动等因素导致。在男男性行为人群中，CRF55_01B毒株的传播较为集中。随着时间的推移，CRF55_01B毒株在某些基因位点上发生了突变，这些突变可能会影响病毒的生物学特性。CRF55_01B在广西HIV-1新近感染者中具有一定的流行范围和比例。在本研究涉及的总共750例广西HIV-1新近感染者样本中，CRF55_01B流行重组型毒株的感染例数为42例，总体感染比例约为5.6%。不同地区的感染比例存在差异，南宁、柳州等地区的感染比例相对较高。从时间趋势来看，近10年CRF55_01B毒株在广西地区的感染比例总体呈现上升趋势，从2014-2016年的3.3%逐渐增加到2020-2024年的4.8%。6.2对艾滋病防控的启示本研究发现广西HIV-1新近感染者中存在CRF55_01B流行重组型毒株，这对广西艾滋病防控策略制定、疫情监测和治疗方案优化等方面均具有重要指导作用。在防控策略制定方面，本研究结果为制定精准防控策略提供了关键依据。明确CRF55_01B毒株在广西多个地区均有分布且感染比例呈上升趋势，这提示防控工作应进一步加强对这些地区的关注和资源投入。对于南宁、柳州等感染比例相对较高的地区，应加大宣传教育力度，提高公众对艾滋病的认知水平，尤其是对CRF55_01B毒株传播风险的认识。通过开展社区宣传活动、学校健康教育课程、公共场所宣传海报张贴等多种形式，普及艾滋病防治知识，提高公众的自我保护意识。在男男性行为人群中，由于CRF55_01B毒株传播较为集中，应针对性地开展行为干预措施。加强对男男性行为场所的监管，推广安全套的使用，提供免费的安全套发放服务，并开展同伴教育活动，鼓励男男性行为者之间相互宣传艾滋病防治知识，提高安全套使用率和安全性行为意识。根据CRF55_01B毒株的传播特点，加强对流动人口的管理和监测。在交通枢纽、劳务市场等流动人口集中的场所，开展艾滋病检测和咨询服务，及时发现潜在的感染者，并提供相应的治疗和关怀支持。在疫情监测方面，本研究为优化疫情监测体系提供了方向。鉴于CRF55_01B毒株的发现，应将其纳入常规监测范围，建立长期、系统的监测机制。增加监测样本的数量和覆盖范围，不仅要涵盖医疗机构就诊的患者，还应包括社区自愿检测者、高危人群筛查对象等，以全面掌握CRF55_01B毒株的流行情况和传播动态。定期收集和分析CRF55_01B毒株的基因序列信息，及时发现毒株的变异情况。通过建立分子流行病学监测网络，对不同地区、不同时间的CRF55_01B毒株进行基因测序和分析，了解其进化趋势和传播路径的变化。当发现毒株出现新的变异或传播范围扩大时，能够及时发出预警信号，为疫情防控决策提供科学依据。加强与周边省份的疫情信息交流与共享，共同开展联防联控工作。由于CRF55_01B毒株在广西与周边省份